Développés pour améliorer la santé et le bien-être, certains composés pharmaceutiques sont désormais sous haute surveillance car considérés comme des contaminants émergents des eaux. Pour répondre à ce nouvel enjeu, nous visons à développer un microsystème d'analyse permettant l'identification et la quantification de ces contaminants dans des échantillons d'eau. L'aspect original de ce microsystème repose sur l'intégration au sein du canal d'une zone de préconcentration dans laquelle sont immobilisés des ligands (aptamères dans notre étude), permettant l'extraction sélective de la cible et sa concentration. Pour développer ce microsystème, deux types de fonctionnalisation de surface doivent être mis en œuvre : (1) globale, sur toute la surface des canaux, pour contrôler leurs propriétés de surface et ainsi éviter l'adsorption et contrôler les écoulements de liquides, et (2) locale, pour greffer les ligands sélectifs dans une zone confinée du canal. Les polymères COC et THV, prometteurs pour la conception de puces microfluidiques grâce à leur transparence dans le domaine UV-visible et leur excellente résistance aux solvants, ont été sélectionnés pour la microfabrication du système. Cependant, leur inertie chimique rend difficile la fonctionnalisation de leur surface, et de nouvelles méthodes de traitement de surface ont été développées. Nous présentons ainsi plusieurs méthodes innovantes pour la fonctionnalisation de ces matériaux, basées sur un dépôt plasma, une modification électrochimique et/ou une réaction chimique. La possibilité d'encapsuler les ligands dans une phase monolithique à l'intérieur d'un microcanal grâce à un procédé sol-gel a également été évaluée. / Developed to promote human health and well-being, certain pharmaceuticals are now attracting attention as crucial emerging water contaminants. To deal with this concern, we aim at developing an analytical microsystem for the identification and quantitation of these contaminants in water samples. The original aspect of this lab-on-a-chip relies on the integration inside the channel of a preconcentration zone in which ligands (aptamer in our study) are immobilized, in order to concentrate the target and extract it from the rest sample matrix. Development of this microsystem requires surface treatments to modify the microchannel surface at two scales: (1) globally (on the entire channel walls) to control surface properties and thus avoid adsorption as well as control fluid flows, or (2) locally to immobilize selective ligands in restricted areas for selective target extraction and preconcentration. Polymers COC and THV, attractive for the conception of microfluidic chips thanks to their UV-visible transparency and high resistance to aggressive solvents, were selected as the microchip material. However due their chemical inertness new functionalization techniques have to be developed to modify their surface. In this work, innovative surface treatment strategies have been developed for both materials, based on plasma, electrochemical and chemical approaches. The possibility of encapsulating aptamers in a monolithic phase inside microchannel by sol-gel process was also explored.

L’analyse de traces dans des matrices complexes (environnementales, alimentaires ou biologiques) requiert très souvent une étape de purification et de préconcentration avant une analyse via des méthodes chromatographiques. Dans cette optique, des supports d’extraction basés sur des mécanismes de reconnaissance moléculaire ont été développés et appliqués à l’extraction de composés cibles rendant ainsi l’analyse plus sensible et plus fiable. Ces supports sélectifs peuvent entre autres résulter de l’immobilisation de biomolécules tels que les anticorps ou les aptamères (i.e. des oligonucléotides présentant une séquence capable de se lier spécifiquement à une molécule). Cette étape de traitement de l’échantillon est particulièrement nécessaire lorsqu’il s’agit de développer des systèmes séparatifs miniaturisés, tels que les microsystèmes séparatifs sur puce, du fait de la diminution de la résolution qui résulte de l’utilisation d’un canal de séparation de faible longueur. Dans ce contexte, ce projet de recherche a consisté à développer des systèmes bioanalytiques miniaturisés pour l’analyse de petites molécules ou protéines dans des échantillons complexes. Pour développer ces systèmes, la synthèse d’un monolithe hybride organique-inorganique in situ dans des capillaires de 100 µm d.i. a, dans un premier temps, été optimisée via une approche sol-gel puis caractérisée en termes de répétabilité. Dans une deuxième partie, deux toxines modèles de faible poids moléculaire ont été choisies : la microcystine-LR (MC-LR) et l’ochratoxine A (OTA). Des anticorps monoclonaux et des aptamères, spécifiques de l’une et l’autre des toxines ont ensuite été greffés sur des monolithes en capillaire. Les immuno- et oligoadsorbants miniaturisés obtenus (respectivement mIS et mOS) ont été couplés en ligne avec la nanoLC. La rétention spécifique des toxines cibles sur les mIS et mOS a été démontrée dans l’eau pure. La répétabilité de la synthèse et du greffage a été évaluée et la capacité de chacun des supports miniaturisés a été déterminée. Enfin, mIS et mOS ont été appliqués avec succès à l’extraction sélective de la MC-LR et de l’OTA à partir d’extraits de cultures de cyanobactéries, d’eaux environnementales ainsi que d’échantillons de bière dopés. Dans un troisième temps, de façon à transposer les outils sélectifs développés à l’analyse de protéines, des microréacteurs enzymatiques (IMER) ont été préparés par greffage de deux enzymes protéolytiques (pepsine et trypsine) sur des monolithes. Ces outils ont ensuite été couplés avec la nanoLC-MS² pour l’analyse d’une protéine modèle, le cytochrome C. Les rendements de digestion sur IMER se sont avérés présenter une bonne répétabilité. Toutefois, l’efficacité de la digestion sur les IMER à base de pepsine reste à ce jour insuffisante et nécessite de réadapter la procédure de greffage et/ou de digestion. / The analysis of ultra-traces from complex matrices (environmental, foodstuff or biological) often requires a step of purification and preconcentration before their analysis by chromatographic separation methods. Therefore, extraction sorbents based on a molecular recognition mechanism can be developed and used for the selective extraction of target molecules thus rendering their quantitative analysis in complex samples more reliable and sensitive. These extraction sorbents may result, among others, from the immobilization of biomolecules such as antibodies and aptamers (i.e. oligonucleotides whose sequence is specific for a target molecule). This selective sample pretreatment step is particularly necessary when developing miniaturized devices such as separative microsystems on chip because of the decrease of the resolution that results from the use of a shorter length separation channel. In this context, the aim of our study was to develop miniaturized bioanalytical devices for the analysis of small molecules or proteins in complex samples. For the development of these devices, in-situ synthesis of a porous hybrid organic-inorganic monolith in capillaries (100 µm i.d.) by sol-gel approach was firstly optimized and characterized in terms of repeatability. Secondly, two model toxins of low molecular weight were chosen: microcystin-LR (MC-LR) and ochratoxin A (OTA). Monoclonal antibodies and aptamers specific to one and the other target molecules were then grafted on the monolithic capillaries. The resulting miniaturized immunosorbent (mIS) and oligosorbent (mOS) were then coupled on-line to nanoLC. Specific retention of MC-LR and OTA on the mIS and the mOS, respectively, was demonstrated in pure water. Synthesis repeatability and capacity of the miniaturized sorbents were evaluated. Finally, these miniaturized tools were applied to the selective extraction of MC-LR or OTA from complex samples, i.e. blue-green algae extracts, environmental waters or beer. In a third part, immobilized enzyme reactors (IMERs) were prepared by grafting two proteolytic enzymes (pepsin and trypsin) on monoliths in order to transpose the developed selective tools to the analysis of proteins. These IMERs were then coupled on-line to nanoLC-MS² for the analysis of a model protein, cytochrome C. Digestion yields on IMERs presented a good repeatability. However, digestion efficiency on the pepsin-based IMERs remains so far insufficient and grafting or digestion procedure needs to be readjusted.

Oncolytic viruses promise to significantly improve current cancer treatments through their tumour-selective replication and multimodal attack against cancer cells. However, one of the biggest setbacks for oncolytic virus therapies is the intravenous delivery of the virus, as it can be cleared by neutralizing antibodies (nAbs) from the bloodstream before it reaches the tumour cells. In our group, we have succeeded in developing aptamers to vesicular stomatitis virus (VSV), as well as to rabbit anti-VSV polyclonal neutralizing antibodies (nAbs). We tested these aptamers’ biological activity with a cell-based plaque forming assay and found that the aptamers prevented in vitro neutralization of VSV by nAbs and increased the virus infection rate of transformed cells up to 77%. In line with this approach, we enhanced the delivery of oncolytic viruses by selecting aptamers to the CT26 colon carcinoma cell line. The binding of aptamer pools has been tested on flow cytometry and the best pools were subjected to high throughput sequencing. Selected aptamers were linked to anti-VSV aptamers and applied for target delivery of the virus to cancer cells. Development of this aptamer-based technology aims to improve viral anti-cancer therapies, with a potential to be applied as treatment for patients affected with cancer. Finally, in collaboration with a group from Erlangen University, we performed an aptamer selection using capillary electrophoresis and cell-SELEX. The target, the extracellular domain of human CD83, is a maturation marker for dendritic cells and is involved in the regulation of the immune system. Selected aptamer sequences bound selectively to mature dendritic cells, in comparison to immature dendritic cells, and thus hold promise to be applied for further studies leading to a better understanding of CD83’s mechanism of action.

Rapid detection of foodborne pathogen is one of the most urgent problems in the world, because foodborne pathogen could cause serious illness, such as nausea, vomiting and diarrhea. We have developed a sensitive microfluidic system based on dendrimers and aptamers for rapid detection of Escherichia coli O157:H7 at very low cells concentration. Dendrimers, with high level of functional groups and homogeneous spherical shape, are prefect nanoscale polymers used as a template material by increasing sensitivity and specificity of analytes detection in microfluidics. In this work, we develop a sensitive microfluidic system based on dendrimers and aptamers for detecting Escherichia coli O157:H7 at very low cell concentrations. Carboxyl functionalized G7-polyamidoamine (PAMAM-COOH) dendrimers are immobilized on (3-aminopropyl)-trimethoxysilane (APTMS) pretreated microfluidic channels. The aptamers are subsequently conjugated on the immobilized dendrimes through chemicals. The sensitivity and specificity are validated by injecting fluorescein isothiocyanate (FITC) labelled Escherichia coli O157:H7 at various cells concentration into the resulting microchannels, indicating that the detectable cells concentration can be reached as low as 100 (cells/ml) and the detection time is 10 hours. To further exploit and improve the work efficiency our microfluidic device, the microfluidic channel is designed into a staggered herringbone microchannel (SHM) to create the chaotic dynamics inside the microfluidic device, and the SHM is then simulated by a COMSOL software showing that the staggered herringbone structures can improve chaotic dynamics of designed microchannel and will enhance the probability of particles to attach on the surface of microdevice. All the results show that our approach has the potential to develop the field of rapid and accurate detection on foodborne pathogens.

Dans ce travail, nous avons pu sélectionner par la méthode SELEX un aptamère à ARN modifié, appelé Apt1, qui se lie avec une haute affinité au récepteur CD44. L'aptamère sélectionné a été modifié avec par des 2'-F-pyrimidines afin d’augmenter sa stabilité vis-à-vis des nucléases pour une application thérapeutique. Cet aptamère a été ensuite greffé sur des liposomes contenant des séquences de siRNA dirigées contre un gène rapporteur, dans le but d’un ciblage actif des cellules tumorales exprimant le récepteur CD44. Cette fonctionnalisation a été réalisée par la conjugaison d’un dérivé 3'-thiol de Apt1 et un dérivé maléimide de phospholipides, directement à la surface des liposomes, ou bien séparément puis par post-insertion sur les liposomes. Les liposomes ainsi formulés présentent une forte affinité pour les cellules exprimant le CD44 sans déclencher de réponse inflammatoire au sein de ces cellules. En outre, nous montrons que l'inhibition du gène rapporteur est augmentée et prolongée lorsque l’aptamère est couplé aux liposomes chargés aux siRNA, in vitro ainsi qu’in vivo sur un modèle murin orthotopique de cancer du sein. De tels vecteurs de siRNA constituent donc un outil prometteur pour le ciblage actif de tumeurs exprimant le récepteur CD44. L'étape suivante consistera charger ces vecteurs par des séquences de siRNA permettant de réprimer des oncogènes. / In this work we succeeded to select a modified RNA aptamer, named Apt1, to bind the human CD44 receptor protein with high affinity using the Systemaic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) method. The selected aptamer was modified with 2'-F-pyrimidines to increase its stability against nucleases for therapeutic applications. Furthermore, we designed and characterized aptamer-functionalized liposomes loaded with siRNA molecules against a reporter gene as a model drug delivery system for the active targeting CD44-expressing tumor cells in vitro and in vivo. Such functionalization was performed by conjugation of 3'-thiol-modified Apt1 to maleimide-modified phospholipids, either on the surface of liposomes, or separately, followed by post-insertion onto liposomes. The targeted liposomes displayed high affinity for CD44-positive cells without triggering any inflammatory response within these cells. Moreover, we show that a higher and prolonged inhibition of the targeted gene can be achieved when siRNA-loaded liposomes are functionalized by the aptamer, both in vitro and in vivo on a murine orthotopic breast cancer model. Such a delivery system may thus be a useful tool for the active targeting of CD44-expressing tumors and silencing oncogenes in vivo.

>Magister Scientiae - MSc / Human Immunodeficiency Virus (HIV), which is the cause of Acquired Immunodefiency Syndrome (AIDS) is a major global public health issue affecting over 37 million people worldwide and is responsible for claiming over 32 million lives since the discovery of the disease in 1981. Through effective diagnosis, treatment and prevention HIV is a manageable disease. Today, advanced antiretrovirals, known as HAART, serve as effective, first-line drug regimens, consisting of a variety of viral inhibitors, and have successfully helped viral suppression. However, issues arise with antiretrovirals due to patient non-adherence and the development of drug resistant mutations. Coupled with dormant HIV reservoirs, viral extinction is attenuated. It is therefore essential that effective alternative treatments are investigated. The exploration of nanomedicine for targeted drug delivery has shown an ability to prolong the drug circulation time, target drugs to specific sites in the body, and enhance drug effectiveness. A previous study demonstrated a novel therapeutic strategy that was based on a mutant version of the caspase-3 enzyme that can induce apoptosis in HIV infected cells. This therapeutic strategy has the potential to wipe out reservoirs of HIV infection. However, the therapeutic strategy lacked selectivity because the delivery mechanism was based on protein transduction technology which will result in the nonselective delivery of the drug. In this study, preliminary work towards the development of a targeted nanoparticle delivery system for this mutant caspase-3 enzyme is described. The study describes the synthesis of green fluorescent protein loaded alginate/chitosan nanoparticles that were functionalized with a DNA aptamer intended to target the nanoparticles to CD4 expressing cells, that are also targeted by HIV. The THP-1 cell line was used due to the ability of the cells to express CD4 receptors on the cell surface. The nanoparticles were synthesized through ionotropic gelation. The size, polydispersity, zeta potential and morphology were investigated by Dynamic Light Scattering and Scanning Electron Microscopy, respectively. The strongly negative zeta potential studies revealed stability of the nanoparticles in suspension and Scanning Electron Microscopy results showed an indicative collapse of the polymer network for the empty nanoparticles (i.e. nanoparticles not loaded with GFP), whereas solid, cuboid nanoparticles were shown for the GFP-loaded nanoparticles. Image-based fluorescence cytometry demonstrated that the GFP-loaded nanoparticles bind to the THP-1 cells that express the CD4 receptor. The results obtained are indicative of a potential drug delivery system for HIV treatment however, adjustments would need to be made to the current study to further develop this nanocarrier.

Detection of cancer at the early stages greatly increases the chance for successful treatment and favourable prognosis for patients. However, a liquid-based biopsy has yet to be developed for most cancers. Extracellular vesicles (EVs) are an attractive candidate for early cancer detection since their surface proteome mirrors the cell of origin. Thus, there is a need for the development of reliable probes that can detect cancer derived EVs. In this thesis, the VBS-1 aptamer was developed to selectively bind to triple-negative breast cancer cell line derived EVs. Initially, several EV isolation methods were compared and isolated EVs were validated and characterized. Aptamer clones were developed by Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment to EVs isolated by differential ultracentrifugation and their binding was validated by flow cytometry. The binding partner of the selected VBS-1 aptamer was identified by LC-MS/MS to be the transmembrane protein ATP1A1. The presence of an ATP1A1-positive EV population was validated by flow cytometry. The selected aptamer may find further application in biosensors for the detection of EVs as cancer biomarkers in biological fluids.

La détection de petites molécules contribue au développement de nombreux domaines tels que la sécurité alimentaire, la sécurité intérieure, le diagnostic, le contrôle de l'environnement, etc. Cependant, la petite taille de ces cibles et leur faible concentration rendent difficile leur détection. Pour pallier à cela, des biocapteurs avec des sondes appropriées et des stratégies d'amplification du signal sont nécessaires. Parmi les éléments de reconnaissance couramment utilisés, les aptamères présentent l'avantage d'une synthèse aisée et de grandes possibilités de modification, ainsi qu'une dénaturation réversible à haute température et une tolérance élevée à la concentration en sel et au pH dans le milieu de travail. Plus important encore, la petite taille des aptamères en fait un choix idéal pour créer des structures adaptées pour la détection de petites cibles. La possibilité de couper la séquence de l'aptamère a fourni d'autres approches d’amplification de signal. Il existe deux catégories de méthodes de détection basées sur des aptamères : analyse hétérogène lorsque l'aptamère est immobilisé sur la surface ou analyse homogène lorsque le test est réalisé en solution. Nous proposons dans cette thèse une approche appliquable aux deux stratégies. L'adénosine a été utilisée comme une cible modèle pour cette preuve de concept. La détection de l'adénosine a été obtenue en combinant l'auto-assemblage de dimères d'oligonucléotides avec des extrémités pendantes correspondantes à l'aptamère coupé. Nous avons construit des structures auto-assemblées d'ADN (de 1D à 3D) avec l'adénosine comme déclencheur d'un changement structurel. La première méthode décrite dans ce travail consiste à utiliser de telles structures d'ADN combinées à l'imagerie par Résonance de Plasmons de Surface (SPRi). La SPRi est une méthode sensible à la variation d'indice optique produite par l'interaction entre les sondes immobilisées sur le prisme de l'or et la cible dans la solution. En présence d'adénosine, la structure d'ADN s'auto-assemble sur la surface de l'or et un signal a été créé. La limite de détection de l'adénosine atteinte par cette méthode est de 10 μM. La deuxième homogène méthode consiste à analyser les variations d'absorbance UV de la solution contenant les structures d'ADN puisque l'absorbance UV de l'ADN monocaténaire et du duplex ADN hybride est différente. En raison de cet effet, la température de fusion des brins d'ADN peut être déterminée par la dérivée de l'absorbance UV mesurée. Les structures d'ADN combinant les extrémités pendantes de l'aptamère coupé couplés à des oligonucléotides complémentaires présentent deux températures de fusion caractéristique de la dissociation de chaque partie. L'une correspond à l'oligonucléotide hybridé et l'autre à l'aptamère coupé liant l'adénosine. En présence d'adénosine dans la solution, la stabilité de la structure augmente et le pic de fusion de l'aptamère coupé est décalé à une température plus élevée tandis que le second pic de fusion reste identique et peut servir de référence interne. La limite de détection atteinte pour cette méthode est de 1 μM. Les structures d'ADN que nous avons proposées s'auto-assemblent de manière linéaire ou bi- ou tri-dimensionnelle : la structure 1D est une chaîne d'ADN formée par un enchainement de dimères connectés par des extrémités formées de l'aptamère scindé; La structure en 2D est une structure en forme de Y formée par un ADN simple brin avec une extrémité aptamère scindé sur chaque branche du "Y"; La structure 3D est un tétraèdre formé par quatre simple brins d'ADN avec des extrémités aptamère scindé sur les quatre sommets. En présence d'adénosine, les structures 2D et 3D peuvent s'auto-assembler et ainsi former un réseau avec les extrémités pendantes. La structure 1D a été mûrement développée pour les deux méthodes, les structures 2D et 3D ont été prouvées efficaces pour la détection, mais nécessitent encore plus d'efforts pour permettre une détection optimisée. / The detection of small molecules contributes to the development of many fields such as food safety, homeland security, diagnose, environment control, etc. However, their small size and low concentration are the usual cause of limitations in their detection. In order to improve the detection, biosensors with appropriate probes and signal amplification strategies are required. Amongst the commonly used recognition elements, aptamer has the advantage of easier mass production and modification, reversible denaturation at high temperature and high tolerance of salt concentration and pH in the working environment. More importantly its small size made it an ideal choice for creating delicate structures for the detection of small targets. The possibility of splitting the aptamer sequence has provided more approaches for amplification purpose. There are two categories of detecting methods based on aptamers: heterogeneous analyzation where the aptamer is immobilized on a surface or homogeneous analyzation where the assay is performed in solution. In this thesis, we proposed an amplification method useful for both heterogeneous and homogeneous assays. Adenosine was used as a proof of concept target. The detection of Adenosine was achieved by combining the self-assembly of oligonucleotide dimers with split-aptamer dangling ends. We constructed self-assembled DNA structures (from 1D to 3D) with Adenosine as the trigger for a structural change. The heterogeneous assay is based on in Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi). SPRi is a method sensitive to the change of refraction index created by the interaction between the probes immobilized on the gold surface and the targets in the flowing solution. With the presence of Adenosine in the solution, the DNA structure is self-assembled on the gold surface and the signal was created. The detection limit achieved by this method was 10 µM. The second homogeneous assay is based on the melting profile of the solution determined from the absorbance of UV light (260 nm wavelength). The UV absorbance of single strand DNA and hybridized DNA duplex is different. Due to this effect, the melting temperature could be obtained from the UV absorbance measured. The DNA structures combining self-complementary oligonucleotides and split-aptamer dangling ends have two melting temperatures, one correspond to the oligonucleotides and the other to the split-aptamer. In presence of Adenosine in the solution the strength in the binding is increased. As a result, the melting peak of the split-aptamer shifted to higher temperature while the second melting peak correspond the oligonucleotide remains the same as an internal reference. The detection limit achieved for this method was 1 µM. The DNA structures we proposed varied from 1D to 3D: the 1D structure was a DNA chain formed by a series of dimers connected through split-aptamer dangling ends; the 2D structure was a Y shape structure formed by three single-strand DNA with a split-aptamer dangling end on each branch of the “Y”; the 3D structure was a tetrahedron formed by four single-strand DNA with split-aptamer dangling ends on the four vertexes. With presence of Adenosine, 2D and 3D structures can further form a network with the dangling ends. The 1D structure has been maturely developed for the two detection methods, the 2D and 3D structures have been proven effective for detection but still require more efforts to reach perfection.

The purpose of this thesis project was to demonstrate the ability to utilize the capabilities of aptamers so that they may act as capture reagents for paper microfluidic devices. Several characterization experiments were conducted as a precursor before the final experimentation was performed. Paper characterization, manufacturing protocols for printing and heating, as well as 3D chip fabrication were all performed and analyzed. The results confirmed that the control of fluid through a 3D microfluidic device based in nitrocellulose is possible. For the biochemistry portion of this thesis report, antibodies and aptamers were chosen to react with IgE, an antibody that is present in high concentrations in the urine of patients diagnosed with respiratory distress. Antibody chips were successfully created as a baseline lateral flow assay for comparison to new aptamer detector reagents. The aptamer experiments were able to demonstrate that it is possible to utilize the capabilities of aptamers so that they may behave as capture reagents in paper microfluidic devices. Overall, the experiments performed were extremely supportive of the ability to develop the field of paper microfluidics with the use of aptamers so that patient populations across the globe can be more accurately and effectively diagnosed.

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