O gênero Aspergillus tem se destacado na produção de enzimas de aplicação industrial, destacando-se dentre estas, as amilases, capazes de hidrolisar as ligações -glicosídicas do amido. As amilases são usadas nos processos industriais para a produção de etanol, glicose e xarope de frutose, além da indústria têxtil, de papéis e detergentes. Neste contexto, este trabalho visou a prospecção de fungos filamentosos para a produção de amilase e a padronização das condições de cultura do Aspergillus japonicus. A otimização das condições de reação da amilase produzida pelo fungo, a purificação, caracterização e teste de diferentes concentrações de íons na atividade enzima pura, a determinação do conteúdo de carboidratos, das constantes cinéticas e análise dos aminoácidos que compõem a glucoamilase purificada e a aplicação da amilase bruta produzida pelo fungo A. japonicus no processo de branqueamento do papel reciclado. Os resultados do screening de fungos filamentosos bons produtores de enzimas amilolíticas evidenciaram dois fungos com alta produção de amilase, os quais foram identificados como Aspergillus parasiticus e Aspergillus japonicus. Os estudos prosseguiram com o A. japonicus como fungo selecionado. Este fungo mostrou melhor produção enzimática no meio de cultura KHANNA e máxima produção amilolítica após 4 dias de crescimento em condições estáticas obtendo uma atividade de 44.65 (± 0.49) U/mL. O pH ideal do meio de cultivo foi de 5,5 e a temperatura ótima de 25°C. As melhores fontes de carbono para a produção enzimática foram o amido de batata e a maltose, respectivamente, e o melhor resíduo de alimento foi a casca e bagaço de laranja. Após a caracterização das condições de cultivo do fungo, vieram as caracterizações dos parâmetros físico-químicos da amilase. A temperatura e pH ótimo de ensaio enzimático foram padronizados sendo, respectivamente, 50C e 5,5. A amilase manteve a sua atividade em torno de 90% de 30º a 50ºC após uma hora de incubação, aproximadamente 95% de sua atividade nos pH de 4,0 a 6,0 e 50% nos pH de 6,5 à 9,0 após uma hora de incubação. Os produtos da hidrólise da amilase mostraram a formação apenas de glicose, na cromatografia de placa delgada de silica, podendo-se supor que esta enzima trata-se de uma glucoamilase, o que foi comprovado por experimentos subsequentes. A enzima bruta foi submetida a eluição em DEAE-cellulose e uma glucoamilase com massa molecular de 72 kDa foi purificada conforme determinado por SDS-PAGE. A temperatura ótima desta glucoamilase purificada foi de 65°C e o pH foi de 5.0. A enzima também demonstrou alta estabilidade a diferentes temperaturas e pH, assim como, uma grande quantidade de produtos gerados quando usada a amilopectina como substrato de reação. A glucoamilase mostrou uma alta ativação na presença de 10 mM de MnCl2, KCl, Pb(C2H3O2)2.3H2O, and 2-mercaptoetanol e um valor de Km de 0,59 mg/mL, Vmáx de 308,01 U/mg e Kcat de 369,58 (s-1). A quantidade de carboidratos que compõem a estrutura da enzima bruta e purificada foram quantificados sendo de 15% e 5,5%, respectivamente. A enzima pura teve seus aminoácidos identificados por análise comparativa com outros gêneros e espécies de fungos produtores de glucoamilase, a enzima também apresentou identidade com o domínio de ligação ao amido existente no fungo Neosartorya fischeri NRRL 181. Quando a glucoamilase bruta foi aplicada no processo de biobranqueamento do papel reciclado impresso por tinta ao jato, a enzima apresentou uma média de 23,34% de aumento da alvura relativa quando comparada ao controle, já na polpa de papel de revista a enzima levou a uma média de 23,89% de aumento na alvura relativa. Os resultados apresentados abrem a possibilidade da utilização destas enzimas no biobranqueamento de polpa de celulose, para a produção e reciclagem de papel pelas indústrias. / The genus Aspergillus has been highlighted in the production of enzymes for industrial application, standing out among these, amylases, capable of hydrolyzing the ?-glycosidic linkages of starch. Amylases are used in industrial processes for the production of ethanol, glucose and fructose syrup, in addition to textiles, detergents and paper. In this context, this work aimed the prospecting of filamentous fungi to produce amylase and the standardization of Aspergillus japonicus culture conditions. The optimization of reaction conditions for amylase produced by the fungus, purification, characterization and testing different concentrations of ions in pure enzyme activity, determining the carbohydrate content, the kinetic constants, analysis of the amino acids that comprise the purified glucoamylase and the application of crude amylase in the bleaching process of the recycled paper. The results of the screening of filamentous fungi that produced good levels of amylolytic enzymes showed two fungi with high production of amylase, which were identified as Aspergillus parasiticus and Aspergillus japonicus. The studies continued with A. japonicus as selected fungus. This strain showed the best enzyme production in the culture medium Khanna and maximum amilolytic production after 4 days of growth under static conditions obtaining an activity of 44.65 (± 0:49) U/ml. The optimum pH of the medium was 5.5 and the optimum temperature of 25°C. The best carbon sources for the enzyme production were potato starch and maltose, respectively, and the best food residue was orange peel and bagasse. After the characterization of fungal culture conditions, came the characterization of physical and chemical parameters of amylase. The temperature and optimum pH of enzyme assay were standardized being, respectively, 5.5 and 50°C. Amylase retained its activity around 90% at 30 to 50°C after one hour of incubation, approximately 95% of its activity in the pH range of 4.0 to 6.0 and 50% in pH range of 6.5 to 9.0 after an hour of incubation. Amylase hydrolysis products showed only the formation of glucose, in thin layer chromatography on silica, and it can be assumed that it is a glucoamylase, which was confirmed by subsequent experiments. The crude enzyme was subjected to elution through DEAE-cellulose and a glucoamylase showing a molecular weight of 72 kDa as determined by SDS-PAGE was purified. The optimum temperature of this purified glucoamylase was 65°C and the pH was 5.0. The enzyme also showed high stability at different temperatures and pH, as well as a large amount of products generated when used as a reaction substrate the amylopectin. Glucoamylase showed a high activation in the presence of 10 mM de MnCl2, KCl, Pb(C2H3O2)2.3H2O, and 2-mercaptoethanol and a Km value of 0.59 mg/mL, Vmax of 308.01 U/mg and Kcat of 369.58 (s-1). The amount of carbohydrates that compose the structure of crude and purified enzyme were measured at 15% and 5.5%, respectively. The pure enzyme had its amino acids identified by comparison with other genera and species of fungi producers of glucoamylase, the enzyme also showed identity with the existing starch binding domain in Neosartorya fischeri NRRL 181 fungus. When the crude glucoamylase was applied in biobleaching process of the recycled paper printed by the ink jet, the enzyme showed an average of 23.34% increase in relative brightness as compared to control, in the journal paper pulp has led to the enzyme an average of 23.89% increase in the relative brightness. The results presented here open the possibility of using these enzymes in pulp biobleaching pulp for the production and recycling of paper by industry.

O gênero Aspergillus tem se destacado na produção de enzimas de aplicação industrial, destacando-se dentre estas, as amilases, capazes de hidrolisar as ligações -glicosídicas do amido. As amilases são usadas nos processos industriais para a produção de etanol, glicose e xarope de frutose, além da indústria têxtil, de papéis e detergentes. Neste contexto, este trabalho visou a prospecção de fungos filamentosos para a produção de amilase e a padronização das condições de cultura do Aspergillus japonicus. A otimização das condições de reação da amilase produzida pelo fungo, a purificação, caracterização e teste de diferentes concentrações de íons na atividade enzima pura, a determinação do conteúdo de carboidratos, das constantes cinéticas e análise dos aminoácidos que compõem a glucoamilase purificada e a aplicação da amilase bruta produzida pelo fungo A. japonicus no processo de branqueamento do papel reciclado. Os resultados do screening de fungos filamentosos bons produtores de enzimas amilolíticas evidenciaram dois fungos com alta produção de amilase, os quais foram identificados como Aspergillus parasiticus e Aspergillus japonicus. Os estudos prosseguiram com o A. japonicus como fungo selecionado. Este fungo mostrou melhor produção enzimática no meio de cultura KHANNA e máxima produção amilolítica após 4 dias de crescimento em condições estáticas obtendo uma atividade de 44.65 (± 0.49) U/mL. O pH ideal do meio de cultivo foi de 5,5 e a temperatura ótima de 25°C. As melhores fontes de carbono para a produção enzimática foram o amido de batata e a maltose, respectivamente, e o melhor resíduo de alimento foi a casca e bagaço de laranja. Após a caracterização das condições de cultivo do fungo, vieram as caracterizações dos parâmetros físico-químicos da amilase. A temperatura e pH ótimo de ensaio enzimático foram padronizados sendo, respectivamente, 50C e 5,5. A amilase manteve a sua atividade em torno de 90% de 30º a 50ºC após uma hora de incubação, aproximadamente 95% de sua atividade nos pH de 4,0 a 6,0 e 50% nos pH de 6,5 à 9,0 após uma hora de incubação. Os produtos da hidrólise da amilase mostraram a formação apenas de glicose, na cromatografia de placa delgada de silica, podendo-se supor que esta enzima trata-se de uma glucoamilase, o que foi comprovado por experimentos subsequentes. A enzima bruta foi submetida a eluição em DEAE-cellulose e uma glucoamilase com massa molecular de 72 kDa foi purificada conforme determinado por SDS-PAGE. A temperatura ótima desta glucoamilase purificada foi de 65°C e o pH foi de 5.0. A enzima também demonstrou alta estabilidade a diferentes temperaturas e pH, assim como, uma grande quantidade de produtos gerados quando usada a amilopectina como substrato de reação. A glucoamilase mostrou uma alta ativação na presença de 10 mM de MnCl2, KCl, Pb(C2H3O2)2.3H2O, and 2-mercaptoetanol e um valor de Km de 0,59 mg/mL, Vmáx de 308,01 U/mg e Kcat de 369,58 (s-1). A quantidade de carboidratos que compõem a estrutura da enzima bruta e purificada foram quantificados sendo de 15% e 5,5%, respectivamente. A enzima pura teve seus aminoácidos identificados por análise comparativa com outros gêneros e espécies de fungos produtores de glucoamilase, a enzima também apresentou identidade com o domínio de ligação ao amido existente no fungo Neosartorya fischeri NRRL 181. Quando a glucoamilase bruta foi aplicada no processo de biobranqueamento do papel reciclado impresso por tinta ao jato, a enzima apresentou uma média de 23,34% de aumento da alvura relativa quando comparada ao controle, já na polpa de papel de revista a enzima levou a uma média de 23,89% de aumento na alvura relativa. Os resultados apresentados abrem a possibilidade da utilização destas enzimas no biobranqueamento de polpa de celulose, para a produção e reciclagem de papel pelas indústrias. / The genus Aspergillus has been highlighted in the production of enzymes for industrial application, standing out among these, amylases, capable of hydrolyzing the ?-glycosidic linkages of starch. Amylases are used in industrial processes for the production of ethanol, glucose and fructose syrup, in addition to textiles, detergents and paper. In this context, this work aimed the prospecting of filamentous fungi to produce amylase and the standardization of Aspergillus japonicus culture conditions. The optimization of reaction conditions for amylase produced by the fungus, purification, characterization and testing different concentrations of ions in pure enzyme activity, determining the carbohydrate content, the kinetic constants, analysis of the amino acids that comprise the purified glucoamylase and the application of crude amylase in the bleaching process of the recycled paper. The results of the screening of filamentous fungi that produced good levels of amylolytic enzymes showed two fungi with high production of amylase, which were identified as Aspergillus parasiticus and Aspergillus japonicus. The studies continued with A. japonicus as selected fungus. This strain showed the best enzyme production in the culture medium Khanna and maximum amilolytic production after 4 days of growth under static conditions obtaining an activity of 44.65 (± 0:49) U/ml. The optimum pH of the medium was 5.5 and the optimum temperature of 25°C. The best carbon sources for the enzyme production were potato starch and maltose, respectively, and the best food residue was orange peel and bagasse. After the characterization of fungal culture conditions, came the characterization of physical and chemical parameters of amylase. The temperature and optimum pH of enzyme assay were standardized being, respectively, 5.5 and 50°C. Amylase retained its activity around 90% at 30 to 50°C after one hour of incubation, approximately 95% of its activity in the pH range of 4.0 to 6.0 and 50% in pH range of 6.5 to 9.0 after an hour of incubation. Amylase hydrolysis products showed only the formation of glucose, in thin layer chromatography on silica, and it can be assumed that it is a glucoamylase, which was confirmed by subsequent experiments. The crude enzyme was subjected to elution through DEAE-cellulose and a glucoamylase showing a molecular weight of 72 kDa as determined by SDS-PAGE was purified. The optimum temperature of this purified glucoamylase was 65°C and the pH was 5.0. The enzyme also showed high stability at different temperatures and pH, as well as a large amount of products generated when used as a reaction substrate the amylopectin. Glucoamylase showed a high activation in the presence of 10 mM de MnCl2, KCl, Pb(C2H3O2)2.3H2O, and 2-mercaptoethanol and a Km value of 0.59 mg/mL, Vmax of 308.01 U/mg and Kcat of 369.58 (s-1). The amount of carbohydrates that compose the structure of crude and purified enzyme were measured at 15% and 5.5%, respectively. The pure enzyme had its amino acids identified by comparison with other genera and species of fungi producers of glucoamylase, the enzyme also showed identity with the existing starch binding domain in Neosartorya fischeri NRRL 181 fungus. When the crude glucoamylase was applied in biobleaching process of the recycled paper printed by the ink jet, the enzyme showed an average of 23.34% increase in relative brightness as compared to control, in the journal paper pulp has led to the enzyme an average of 23.89% increase in the relative brightness. The results presented here open the possibility of using these enzymes in pulp biobleaching pulp for the production and recycling of paper by industry.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-26Bitstream added on 2014-06-13T20:24:23Z : No. of bitstreams: 1 cruz_vd_dr_rcla.pdf: 4198253 bytes, checksum: 4e0b97e54797784dc50d4ee9a1b575a5 (MD5) / O principal objetivo deste trabalho foi o de avaliar uma mistura de frutooligossacarídeos (FOS), sacarose residual, glicose e frutose, produzida por Aspergullus japonicus – 119, quanto à capacidade de produzir alterações nas populações de bactérias láticas e coliformes nos intestinos de ratos machos Wistar. Foram constituídos 13 grupos de animais, sendo um controle e 12 experimentais, cada grupo contendo 7 animais. Durante 3 meses os animais dos grupos experimentais foram suplementados com 350 mL diários de FOS I (49,7% de FOS) ou FOS II (34,3% de FOS), utilizando como excipiente de diluição: água, iogurte convencional e um extrato de soja (2,5% p:v). Estes constituíram os seguintes grupos: Ga; Gi e Gs. As bebidas formuladas com iogurte e extrato de soja foram submetidas a análises sensoriais para verificação de aceitabilidade, visando seu emprego em humanos, no futuro. Para efeito de comparação foram constituídos também 3 grupos de animais que receberam um FOS comercial purificado (ORAFTI) dissolvido nos mesmos excipientes. As médias de UFCs/g de fezes foram submetidas à análise de variância pelos testes de Wilcoxon e/ou Mann-Whitney. Em todos os subgrupos constituídos o FOS I foi mais eficiente que o FOS II para a desejável alteração da microbiota intestinal: aumento das bactérias láticas e diminuição dos coliformes. Os resultados apontam para a seguinte ordem de eficiência para a diminuição de coliformes: ORAFTI+Iogurte > FOS I+Iogurte > ORAFT+soja = ORAFTI+Água. Para o crescimento de bactérias láticas, a mistura de FOS I mostrou-se mais eficiente que o ORAFTI em todos os excipientes utilizados. Os resultados sugerem a possibilidade do emprego comercial da FOS I de Aspergillus japonicus – 119, independentemente de sua purificação / The main objective of this work was to evaluate a mixture of fructooligosaccharide (FOS), residual sucrose, glucose and fructose, from Aspergullus japonicus - 119, considering their ability to produce changes in populations of lactic acid bacteria and coliform bacteria in the intestines of male Wistar rats. The animals (91 at all) were divided in 13 groups with 7 rat in each group: one control group and 12 experimental groups. During three months the animals of experimental groups were daily supplemented with 350 mL of FOS I (49.7% FOS) or FOS II (31.3% FOS), using as a vehicle for dilution water, conventional yogurt and soybean extract ( 2.5% w: v). These were designed as Ga, Gi and Gs groups. The drinks made with yogurt and soy extract were subjected to sensory analysis for verification of acceptability, aiming at their employment in humans beings. For comparison were also formed three subgroups of animals that received a purified commercial FOS (Orafti) dissolved in the same dilution vehicle. The averages of CFU/g of feces were submitted to variance analysis by Wilcoxon's test and/or Mann-Whitney test. In all constituted subgroupes, the FOS I was more efficient than the FOS II for desirable change in intestinal microbiologic populations: increase of lactic acid bacteria and coliforms decreased. Overall, the results indicate the following order of efficiency for coliforms decreasing: ORAFTI+Yogurt > FOS I+Yogurt > ORAFT+soybean extract = ORAFTI+Água. For the increasing of lactic bacteria population the mixture of FOS I in all dissolution vehicle showed more efficient then ORAFTI I. The results suggest the possibility of commercial using of FOS I from Aspergillus japonicus - 119, even without purification