Le ribosome est un organite essentiel de la cellule qui assure la synthèse des protéines. C'est une structure très conservée, composée d'ARN et de protéines ribosomiques organisés en deux sous-unités. Les expériences de reconstitution in vitro du ribosome d'E. coli ont montré que l'assemblage est un processus coordonné impliquant de nombreuses interactions entre les différents constituants. En particulier, les premières étapes de l'assemblage de la grande sous-unité dépendent fortement de la fixation coopérative de cinq protéines ribosomiques à l'ARN 23S, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents sont mal connus.Cette étude à l'échelle de la molécule unique vise à préciser ces mécanismes et porte sur un fragment constitué des hélices H18, H19 et H20 du domaine I de l'ARN ribosomique 23S contenant les sites de fixation des protéines uL24 et uL4. Ce fragment d'ARN a été préparé dans une configuration qui permet la mesure de force via un double piège optique. Les courbes de force obtenues ont permis de dresser une cartographie de la stabilité des structures du fragment d'ARN.Ces cartes ont été comparées en absence et en présence des protéines ribosomiques uL24 et/ou uL4, démontrant ainsi que le fragment d'ARN est stabilisé par la fixation des protéines uL24 et/ou uL4. Leur fixation est coopérative et la présence conjointe des deux protéines sur-stabilise les structures du fragment d'ARN.Ces résultats sont discutés dans la perspective de préciser le rôle du fragment d'ARN et des protéines ribosomiques uL24 et uL4 dans l'assemblage de la grande sous-unité du ribosome. / Ribosomes are essential organelles of the cell responsible for the synthesis of proteins. Their well conserved structure made of RNA and proteins is organized into two subunits. In vitro reconstitution of E. coli ribosomes showed that their assembly is a coordinated process which involves many interactions between the components. More specifically, the early stages of the large subunit assembly depend strongly on the cooperative binding of five ribosomal proteins to the 23S RNA. The underlying molecular mechanisms however remain poorly understood.The aim of this study is to shine new light on these mechanisms at the single molecule level. It focuses on a 23S ribosomal RNA fragment composed of the helices H18, H19 and H20 in domain I which encompasses the binding sites of the ribosomal proteins uL24 and uL4. This RNA fragment has been prepared in a dumbbell configuration and force versus displacement measurements have been performed using a dual optical trap. From these measurements, a map summarizing the mechanical stability of the RNA fragment has been determined.The maps obtained in absence and in presence of the ribosomal proteins uL24 and/or uL4 have been compared consequently demonstrating mechanical stabilization of the RNA fragment induced by the binding of uL24 and/or uL4. Moreover, their binding is cooperative and when both are present, the mechanical stabilization of the RNA fragment is enhanced.These results are discussed to specify the role of the RNA fragment and proteins uL24 and uL4 in the large ribosomal subunit assembly.

La thèse présentée est centrée sur des mesures de force appliquées à des ARN seuls ou en interaction avec une protéine. L'un des plus grands défis posé par l'ARN provient de sa structure, notamment parce que les interactions de ses bases ne se limitent pas aux paires de type Watson-Crick et que les interactions tertiaires sont courantes. Les mesures de force donnent des informations complémentaires aux mesures classiques, car elles permettent de sonder directement les interactions complexes de l'ARN et fournissent des paramètres thermodynamiques inaccessibles autrement. L'étude de l'interaction protéine-ARN par mesure de force permet également d'accéder à des caractéristiques que les autres techniques ne peuvent pas offrir. Néanmoins avant d'atteindre les promesses de ce type de mesure, il faut concevoir un montage adapté et optimisé. Une première partie de la thèse a été dédiée à la conception d'une double pince optique permettant l'étude des ARN avec une résolution proche de la paire de base, en implantant notamment des améliorations techniques jusque là absentes de la littérature. La suite de la thèse s'est attachée à des études biologiques. Nous avons commencé par sonder l'interaction de la protéine ribosomique L20 avec son ARN cible dans le ribosome. Nous avons montré que cette protéine très importante dans les premiers stades de la formation du ribosome, stabilise fortement son ARN cible. Nous avons également déterminé son site de fixation à trois bases près. Nous avons ensuite débuté une étude sur des ARN synthétisés pour l'étude d'une hélicase à motif DEAD en caractérisant leurs réponses à une sollicitation mécanique.

La synthèse du ribosome est un processus compliqué, très hiérarchisé et essentiel à toutes les cellules vivantes. La complexité de ce processus tient notamment au fait que les différentes étapes de la biogenèse du ribosome eucaryote sont temporellement et spatialement organisées dans des compartiments cellulaires différents (le nucléole, le nucléoplasme et le cytoplasme). Il est toutefois connu que le pré-ARNr 35S (le précurseur de trois des quatre ARNr, les ARNr 18S, 5.8S et 25S) est pris en charge dès sa synthèse par des facteurs impliqués dans sa maturation. Ainsi, la formation d’un ribosome requiert l’association, sur le transcrit naissant, des facteurs de synthèse, au nombre de 400. Ces facteurs essentiels interagissent transitoirement avec l’ARNr et ne font pas partie des particules ribosomiques matures impliquées dans la traduction. Leur rôle est d’assister le remodelage constant du pré-ribosome et le processus d’assemblage des sous-unités.<p>Parmi ces facteurs de synthèse, nous avons caractérisé en détail, chez la levure et chez l’homme, la protéine Las1 impliquée dans la maturation des deux extrémités de l’ITS2, séquence qui sépare les ARNr 5.8S et 25S/28S. Chez la levure, en absence de la protéine Las1, les analyses de profils de polysomes révèlent un déficit de sous-unité 60S et l’apparition d’« halfmères ». Les techniques de purification d’affinité et de gradient de sédimentation nous indiquent que Las1 est associée aux pré-ribosomes 60S et qu’elle interagit avec de nombreux facteurs de synthèse de la petite, de la grande sous-unité ou des deux. De plus, Las1 copurifie avec des pré-ribosomes qui contiennent aussi les exoribonucléases 5’-3’ Rat1/Rai1 et Xrn1. Rai1 coordonne la maturation aux deux extrémités de l’ARNr 5.8S. Nous suggérons que Las1 appartient à un macrocomplexe connectant spatialement des sites de clivages éloignés sur la séquence primaire du pré-ARNr qui seraient rapprochés suite au reploiement de l’ITS2.<p>Un autre aspect de ce travail de thèse consiste en l’étude de l’assemblage des particules ribonucléoprotéiques et plus spécifiquement du pré-ribosome et des sous-unités ribosomiques eucaryotes. Nous avons utilisé la technique d’immunoprécipitation de chromatine (Ch-IP) pour caractériser l’assemblage d’une structure appelée le « SSU processome ». Celui-ci correspond à un pré-ribosome en formation ainsi que l’assemblage des protéines ribosomiques sur l’ARNr naissant.<p>Enfin, nous avons étudié le rôle d’une plateforme d’activation de méthyltransférases d’ARN et de protéines, la protéine Trm112 dans la ribogenèse. Nous avons montré que chez la levure, Trm112 est impliquée dans la synthèse du ribosome et dans la progression de la mitose. En absence de cette protéine, les pré-ARNr sont dégradés par un mécanisme de surveillance. Trm112 copurifie avec plusieurs facteurs de synthèse du ribosome dont la méthyltransférase Bud23, impliquée dans la modification post-transcriptionnelle de l’ARNr18S. Trm112 est requise pour cette méthylation et nous postulons que la protéine Bud23 est incapable de se lier aux pré-ribosomes en l’absence de Trm112.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished