Orientador: José Luiz Rybarczyk Filho / Resumo: Sequenciar um organismo, atualmente, pode ser financeiramente custoso. A quantidade de dados gerada por uma única corrida é grande. Analisá-los não é trivial, exigindo, cada vez mais, técnicas computacionais e métodos estatísticos robustos, capazes de extrair o máximo possível de informações. Normalmente, alguns estudos visam à busca por genes diferencialmente expressos mediante diferentes condições experimentais. É importante conhecer perfis de expressão, porém, faz-se necessário entender como os genes relacionam-se entre si funcionalmente, o que só é possível por meio de uma análise de enriquecimento funcional. Dessa forma, desenvolvemos um pacote em ambiente de programação R chamado EntropyClusterGenes. Ele é capaz de enriquecer conjuntos amostrais comparativos sob o ponto de vista da atividade e diversidade gênica utilizando a teoria da informação de Shannon. A ferramenta apresenta uma nova perspectiva de enriquecimento funcional, buscando por grupos de genes funcionalmente associados (GFAGs) através do conceito de entropia relacionado à ontologias e KEGG pathways. Para cada GFAG encontrado, através da técnica de bootstrap, calcula-se um p-valor, que é validado via FDR (False Discovery Rate) para determinar se o grupo encontrado é ou não significativo em uma dada comparação amostral (controle versus experimento). Através de uma nova análise de RNA-seq com o protocolo Tuxedo, quantificamos os transcritos de forma bruta e diferencial em 46 amostras de Aedes aegypti e 8 amos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: An organism sequencing is still expensive. The amount of data generated by a single run is massive. Analyzing them is not trivial, requiring computational techniques and robust statistical methods capable of extracting as much information as possible. Usually, some studies aim to search for genes differentially expressed by different experimental conditions. It is important to know the expression profiles, however, it is necessary to understand how the genes are functionally related to each other, which is only possible through a functional enrichment analysis. In this context, we have developed a package in the R programming environment called EntropyClusterGenes. It is able to enrich comparative sample sets from the perspective of gene activity and gene diversity using Shannon’s information theory. The tool presents a new approach of functional enrichment, searching for groups of functionally associated genes (GFAGs) related to ontologies and KEGG pathways classifying them according to their entropy. For each GFAG found, by means of the bootstrap technique, a p-value is calculated, which is validated by FDR (False Discovery Rate) to determine if the group found is significant or not in a given sample comparison (control vs. experiment). Using a new analysis of RNA-seq with the Tuxedo protocol, we quantified the raw and differential transcripts in 46 samples of Aedes aegypti and 8 samples of Drosophila melanogaster, later regrouped in 40 combinations (control and experiment)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O complexo de espécies crípticas de Anastrepha fraterculus compreende oito morfotipos dos quais três ocorrem no Brasil. Anastrepha sp.1 aff. fraterculus é o morfotipo Brasil-1 e é uma espécie de ampla distribuição no planalto sudeste/sul do Brasil e no norte da Argentina. O comportamento reprodutivo dessa espécie é complexo, envolvendo uma série de movimentos desempenhados pelos machos para atrair as fêmeas para acasalamento, e ocorre, preferencialmente, nas primeiras horas do dia. Dois genes, period e fruitless, entre outros, são conhecidos por participar do controle do comportamento reprodutivo de vários organismos, incluindo algumas espécies de moscas-das-frutas. O presente trabalho buscou informações sobre a atuação desses genes no comportamento reprodutivo de A. sp.1, utilizando o silenciamento transitório desses genes pela metodologia de RNA interferente. Foram, primeiramente, desenhados iniciadores específicos para amplificar fragmentos do DNA genômico desses genes, sendo demonstrado que apresentaram uma similaridade entre 97 a 99% com os genes equivalentes de outras espécies de Anastrepha. A seguir, após padronização e adaptação de protocolos, foram sintetizados os RNA de dupla-fita (dsRNA) dos dois genes, que foram, então, utilizados nos experimentos de silenciamento. Análises, para verificação se os genes foram realmente silenciados foram feitas a partir a injeção dos dsRNAfru e/ou dsRNAper no abdomên de machos sexualmente maduros, tendo sido demonstrado que os genes estavam silenciados ao máximo, sete a oito dias após a injeção. Interferências no comportamento de machos sexualmente maduros, com um ou outro gene silenciado, foram avaliados por testes relacionados com dois parâmetros do comportamento reprodutivo: alterações nas atividades gerais (qualquer tipo de movimentação dos insetos) dos machos durante o ciclo circadiano (dia/noite) e mais especificamente, a atividade relacionada ao comportamento reprodutivo. Ao injetar dsRNAfru em machos adultos de A. sp.1 foi observado que não houve alteração significativa nas suas atividades gerais. Porém, foi observado que houve uma diminuição significativa no número de machos que realizavam atividades reprodutivas, sugerindo que o silenciamento de fruitless no macho adulto altera o funcionamento normal do comportamento sexual masculino. Em contrapartida, ao injetar dsRNAper em machos adultos de A. sp.1 não foi observada alteração significativa tanto nas suas atividades reprodutivas quanto nas atividades gerais. O silenciamento dos genes aparentemente não afeta a produção de espermatozóides. Apesar de controverso, esses dados corroboram com o que foi observado em D. melanogaster, em que o mutante nulo per04 não apresenta alteração significativa nos seus comportamentos em relação aos machos selavagens em um regime cíclico Dia/Noite. Dessa forma, análises adicionais serão necessárias com o objetivo de elucidar as implicações desses dois genes no comportamento locomotor e reprodutivo de Anastrepha sp.1 aff. fraterculus. / The complex of cryptic species Anastrepha fraterculus comprises eight morphotypes three of which occur in Brazil. Anastrepha sp.1 aff. fraterculus correspond to the morphotype Brazil-1 and is a species of wide distribution in the southeast/south plateau of Brazil and in north of Argentina. The reproductive behavior of this species is complex, involving a series of movements performed by males to attract females for mating, and occurs in the early hours of the day. Two genes, period and fruitless, among others, are known to participate in the control of reproductive behavior of various organisms, including some species of fruit flies. The present work aimed to get information about the presumable role of these genes in the reproductive behavior of A. sp.1, using transient silencing of these genes by interfering RNA methodology. Specific primers were first designed to amplify fragments of the genomic DNA of these genes, showing they have a similarity between 97 to 99% with the equivalent genes of other Anastrepha species. After standardization and adaptation of protocols, the double-stranded RNA (dsRNA) of the two genes were synthesized, and used in the silencing experiments. Tests to verify that the genes were actually silenced, were made after injection of the dsRNAfru and/or dsRNAper into the abdomens of sexually mature males. These tests showed that the genes were silenced to the maximum, seven to eight days after the injection. Interferences in the behavior of sexually mature males with one or other silenced gene were evaluated by tests related to two parameters of reproductive behavior: changes in the general activities (any type of movement of insects) of males during the circadian cycle (day/night) and more specifically, activity related to reproductive behavior. Injection of dsRNAfru in adult males of A. sp.1 showed that they did not cause significant alterations in general activities, but it was observed that they cause a significant decrease in the number of males that performed reproductive activities, suggesting that silencing of fruitless. alters the normal functioning of male sexual behavior. In contrast, when injecting dsRNAper. in adult males of A. sp.1, no significant alteration was observed neither in their reproductive activities nor in their general activities. Moreover, silencing of the genes seems not to affect the production of spermatozoa. Although controversial, the data are in line with observations in D. melanogaster, in which the null mutant per04 did not present significant alterations in behaviors relatives to the control males in a Day/Night cyclic regime. Thus, additional analyzes will be needed to elucidate the participation of the two genes in the coordination of behaviors in Anastrepha sp.1 aff fraterculus.

O complexo de espécies crípticas de Anastrepha fraterculus compreende oito morfotipos dos quais três ocorrem no Brasil. Anastrepha sp.1 aff. fraterculus é o morfotipo Brasil-1 e é uma espécie de ampla distribuição no planalto sudeste/sul do Brasil e no norte da Argentina. O comportamento reprodutivo dessa espécie é complexo, envolvendo uma série de movimentos desempenhados pelos machos para atrair as fêmeas para acasalamento, e ocorre, preferencialmente, nas primeiras horas do dia. Dois genes, period e fruitless, entre outros, são conhecidos por participar do controle do comportamento reprodutivo de vários organismos, incluindo algumas espécies de moscas-das-frutas. O presente trabalho buscou informações sobre a atuação desses genes no comportamento reprodutivo de A. sp.1, utilizando o silenciamento transitório desses genes pela metodologia de RNA interferente. Foram, primeiramente, desenhados iniciadores específicos para amplificar fragmentos do DNA genômico desses genes, sendo demonstrado que apresentaram uma similaridade entre 97 a 99% com os genes equivalentes de outras espécies de Anastrepha. A seguir, após padronização e adaptação de protocolos, foram sintetizados os RNA de dupla-fita (dsRNA) dos dois genes, que foram, então, utilizados nos experimentos de silenciamento. Análises, para verificação se os genes foram realmente silenciados foram feitas a partir a injeção dos dsRNAfru e/ou dsRNAper no abdomên de machos sexualmente maduros, tendo sido demonstrado que os genes estavam silenciados ao máximo, sete a oito dias após a injeção. Interferências no comportamento de machos sexualmente maduros, com um ou outro gene silenciado, foram avaliados por testes relacionados com dois parâmetros do comportamento reprodutivo: alterações nas atividades gerais (qualquer tipo de movimentação dos insetos) dos machos durante o ciclo circadiano (dia/noite) e mais especificamente, a atividade relacionada ao comportamento reprodutivo. Ao injetar dsRNAfru em machos adultos de A. sp.1 foi observado que não houve alteração significativa nas suas atividades gerais. Porém, foi observado que houve uma diminuição significativa no número de machos que realizavam atividades reprodutivas, sugerindo que o silenciamento de fruitless no macho adulto altera o funcionamento normal do comportamento sexual masculino. Em contrapartida, ao injetar dsRNAper em machos adultos de A. sp.1 não foi observada alteração significativa tanto nas suas atividades reprodutivas quanto nas atividades gerais. O silenciamento dos genes aparentemente não afeta a produção de espermatozóides. Apesar de controverso, esses dados corroboram com o que foi observado em D. melanogaster, em que o mutante nulo per04 não apresenta alteração significativa nos seus comportamentos em relação aos machos selavagens em um regime cíclico Dia/Noite. Dessa forma, análises adicionais serão necessárias com o objetivo de elucidar as implicações desses dois genes no comportamento locomotor e reprodutivo de Anastrepha sp.1 aff. fraterculus. / The complex of cryptic species Anastrepha fraterculus comprises eight morphotypes three of which occur in Brazil. Anastrepha sp.1 aff. fraterculus correspond to the morphotype Brazil-1 and is a species of wide distribution in the southeast/south plateau of Brazil and in north of Argentina. The reproductive behavior of this species is complex, involving a series of movements performed by males to attract females for mating, and occurs in the early hours of the day. Two genes, period and fruitless, among others, are known to participate in the control of reproductive behavior of various organisms, including some species of fruit flies. The present work aimed to get information about the presumable role of these genes in the reproductive behavior of A. sp.1, using transient silencing of these genes by interfering RNA methodology. Specific primers were first designed to amplify fragments of the genomic DNA of these genes, showing they have a similarity between 97 to 99% with the equivalent genes of other Anastrepha species. After standardization and adaptation of protocols, the double-stranded RNA (dsRNA) of the two genes were synthesized, and used in the silencing experiments. Tests to verify that the genes were actually silenced, were made after injection of the dsRNAfru and/or dsRNAper into the abdomens of sexually mature males. These tests showed that the genes were silenced to the maximum, seven to eight days after the injection. Interferences in the behavior of sexually mature males with one or other silenced gene were evaluated by tests related to two parameters of reproductive behavior: changes in the general activities (any type of movement of insects) of males during the circadian cycle (day/night) and more specifically, activity related to reproductive behavior. Injection of dsRNAfru in adult males of A. sp.1 showed that they did not cause significant alterations in general activities, but it was observed that they cause a significant decrease in the number of males that performed reproductive activities, suggesting that silencing of fruitless. alters the normal functioning of male sexual behavior. In contrast, when injecting dsRNAper. in adult males of A. sp.1, no significant alteration was observed neither in their reproductive activities nor in their general activities. Moreover, silencing of the genes seems not to affect the production of spermatozoa. Although controversial, the data are in line with observations in D. melanogaster, in which the null mutant per04 did not present significant alterations in behaviors relatives to the control males in a Day/Night cyclic regime. Thus, additional analyzes will be needed to elucidate the participation of the two genes in the coordination of behaviors in Anastrepha sp.1 aff fraterculus.