Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, onde é popularmente conhecida como "unha-de-gato". Sua casca é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento de diversas doenças, como gastrite, asma e artrite. Quanto à sua composição química é descrita a presença de alcalóides indólicos e oxindólicos, compostos polifenólicos e derivados do ácido quinóvico. Este trabalho teve como objetivo obter em separado frações enriquecidas dos referidos grupos químicos de Uncaria tomentosa, empregando o procedimento de extração em fase sólida, bem como a validação dos métodos analíticos aplicados a cada fração bioativa. Adicionalmente, as frações enriquecidas foram avaliadas quanto ao potencial efeito antiproliferativo contra linhagens de células de glioma e atividade imunoadjuvante empregando como modelo vacinas virais contendo BoHV-5, respectivamente em ensaios in vitro e in vivo. Todos os métodos de análise necessários para o acompanhamento e controle de qualidade da matéria-prima e produtos de transformação foram validados de forma satisfatória. O procedimento de separação/purificação empregando resina de poliestireno demonstrou resultados robustos e reprodutíveis e permitiu a separação de frações ricas em compostos fenólicos, alcalóides e triterpenos. Em outro plano, foi possível constatar a isomerização dos alcalóides pentacíclicos em meio aquoso por efeito do processo de secagem empregando elevadas temperaturas. O método de análise para a quantificação de polifenóis foi discriminatório quando aplicado aos extratos obtidos de diferentes órgãos de U. tomentosa. As frações fenólica e alcaloídica foram capazes de diminuir a porcentagem de células viáveis das linhagens de glioma C6 e U138-MG após período de tratamento de 48 e 72 h, respectivamente. Complementarmente, estas frações não afetaram as células não-tumorais na mesma extensão em que afetam as células cancerosas. No tocante à avaliação da atividade imunoadjuvante, um pequeno efeito foi observado apenas na resposta imune dos animais imunizados com a fração triterpênica. / Uncaria tomentosa (Willd) DC. is a climbing tree native from Central and South America, where is commonly known as “uña-de-gato” or “cat’s claw”. Its bark is widely used in traditional medicine for the treatment of gastritis, asthma and arthritis. Concerning its chemical composition is worth mentioning the presence of indole and oxindole alkaloids, phenolic compounds and quinovic acid derivatives. This work aims to obtain enriched fractions of the three main chemical groups of Uncaria tomentosa above described using solid phase extraction procedure, as well as the validation of specific assay methods. In parallel, potential antiproliferative effect against glioma cell lines and imunoadjuvant activity using BoHV-5 viral vaccine are evaluated by in-vitro and in-vivo models, in that order. All analytical methods required for monitoring and end-process quality control were validated satisfactorily. The separation/purification procedure using a polystyrene resin gave promising results and allowed the separation of phenolics, alkaloids and triterpenes fractions. Fractions yield were in all satisfactory and the processes were robust and reproducible. It could confirm the alkaloid isomerization in aqueous milieu by effect of the temperature process. The LC method for assay of polyphenols was discriminatory when applied to extracts from different organs of U. tomentosa. The fractions of phenolic and alkaloids compounds were able to decrease the percentage of cells in C6 and U138-MG glioma lineages after a 48h and 72h-treatment, respectively. Moreover, these fractions did not affect non-tumoral cells to the extent that they affect tumor cells. With regard to the imunoadjuvant activity evaluation a moderate effect was detected on immune responses of immunized animals with triterpenes fraction.

As sementes de Chenopodium quinoa (quinoa) são conhecidas pelo seu elevado teor de proteína bem como de saponinas. Quimicamente as saponinas de quinoa são triterpenos sendo ácido fitolacagênico, hederagenina, ácido oleanólico e ácido serjânico, as agliconas mais comumente encontradas. Para as saponinas de quinoa existem relatos contraditórios de atividade imunoadjuvante. Complexos imunoestimulantes têm sido bastante estudados nos últimos anos por atuarem como carreadores de antígenos. Esses complexos são constituídos, de saponinas, colesterol, fosfolipídios e um antígeno (ISCOM); na ausência de um antígeno são denominados de matrizes ISCOM. Para as saponinas de quinoa a possibilidade de formação de matrizes ISCOM não está completamente elucidada. Esse trabalho teve como objetivo a caracterização química das principais saponinas presentes nas sementes de C. quinoa bem como a avaliação das atividades antifúngica e imunoadjuvante. Agregados micelares formados por auto-associação das saponinas, bem como os complexos formados quando da formulação com colesterol e fosfatidilcolina também foram avaliados. O método de purificação das saponinas de quinoa utilizando resina poliaromática permitiu a obtenção de duas frações saponosídicas principais denominadas FQ70 e FQ90. Nessas frações foram caracterizadas dez saponinas triterpênicas bidesmosídicas pela técnica de UPLC/Q-TOF-MS. Um método por CLAE foi desenvolvido e validado para a determinação do conteúdo de saponinas nas frações de quinoa. A atividade antifúngica das frações de quinoa foi avaliada pelo método da microdiluição em placa para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM). As frações foram inativas frente a todas as leveduras avaliadas. No entanto, todos os fungos dermatófitos testados foram suscetíveis às frações de quinoa. Os agregados formados por auto-associação das saponinas em solução aquosa bem como as nanoestruturas formadas após a complexação das saponinas de quinoa com colesterol (CHOL) e fosfatidilcolina (PC) foram estudados em diferentes proporções. As técnicas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) demonstraram estruturas esféricas e micelas filiformes. Em condições experimentais similares àquelas relatadas para a formação de matrizes ISCOM de saponinas de Quillaja saponaria, foram observadas estruturas tubulares e micelas anelares. A composição de saponinas das frações de quinoa parece determinar o tipo de nanoestrutura observada por MET. A toxicidade das frações de quinoa foi avaliada pela determinação da atividade hemolítica, toxicidade frente à Artemia salina e toxicidade aguda em camundongos. FQ70 foi praticamente atóxica frente à A. salina, no entanto, FQ90 apresentou toxicidade. Ambas as frações de quinoa foram menos hemolíticas quando comparadas com Quil A (extrato purificado Q. saponaria). Para avaliar a atividade imunoadjuvante camundongos foram imunizados somente com ovoalbumina (OVA) ou com OVA e os adjuvantes Quil A (adjuvante controle), FQ70 ou FQ90. Hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) foi avaliada 28 dias após o priming. A proliferação de esplenócitos com os mitógenos Concanavalina A (Con A)-, lipopolissacarídeo e OVA, foi avaliada 28 dias pós priming. Ambas as frações de quinoa promoveram um estímulo da resposta imune humoral e celular, porém de forma diferenciada. / Chenopodium quinoa (quinoa) seeds are a rich protein source and well-known for their high saponin content. Chemically, quinoa saponins are triterpene glycosides being phytolaccagenic, hederagenin, oleanolic and serjanic acids the most common aglycones found in seeds. Its immunoadjuvant properties have been examined and the results obtained were conflicting. Mixed micelles composed of saponin, cholesterol and phospholipids, either containing antigen (ISCOM) or not (ISCOM matrix), have been under intensive development in recent years due to their ability to act as antigen presenting-carriers with remarkable immunostimulating properties. The formation of ISCOM or other clearly defined micellar structures with quinoa saponins remained uncorroborated. The objectives of this study were the chemical structure characterization of main saponins present in C. quinoa seeds and the evaluation of antifungal and immunoadjuvant properties related to them. Also, micellar aggregates formed by self-association in aqueous solutions by quinoa saponins as well as nanostructures formed after their complexation with cholesterol (CHOL) and phosphatidylcholine (PC) were evaluated. The separation method of quinoa saponins using a polyaromatic resin allowed the preparation of two purified and enriched fractions, FQ70 and FQ90. Ten triterpenic saponins were chemically characterized by UPLC/Q-TOF-MS in quinoa saponin fractions. A LC-method was developed and validated aiming the saponin content assay in quinoa saponin fractions. The antifungal activity of quinoa fractions was evaluated by broth microdilution method for the determination of the minimal inhibitory concentration (MIC). Both fractions were inactive against all yeasts tested. However all dermatophyte fungi were susceptible to quinoa saponin fractions. The aggregates formed by self-association in aqueous solutions by two quinoa saponin fractions, as well as several distinctive nanostructures formed after their complexation with cholesterol and phosphatidylcholine at different ratios were studied. Dynamic Light Scattering (DLS) and Transmission Electron Microscopy (TEM) showed novel nanosized spherical vesicles formed by self-association and worm-like micelles in quinoa saponin fractions. When experimental conditions, similar to those reported for the preparation of Quillaja saponaria ISCOM matrices, tubular and ring-like micelles arose from quinoa saponin fractions. The saponin composition of quinoa fractions seems determines the nanosized structures viewed by TEM. The toxicity of quinoa fractions were assayed by haemolytic, toxicity to brine shrimps, and acute toxicity in mice tests. FQ70 was almost atoxic however, for FQ90 presented toxicity against shrimps. The quinoa saponin fractions were less haemolytic than Quil A (purified extract from Q. saponaria). To evaluate immunoadjuvant activity, mice were immunized subcutaneously with ovoalbumin (OVA) alone or adjuvanted with Quil A (adjuvant control), FQ70 or FQ90. Delayed-Type Hypersensitivity (DTH) were assayed 28 days post-priming and Concanavalin A (Con A)-, Lipopolysaccharide-, and OVA-stimulated splenocyte proliferation were also measured 28 days post-priming. The results suggested that the two quinoa saponin fractions enhanced significantly the production of humoral and cellular immune responses to OVA in mice.

Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, onde é popularmente conhecida como "unha-de-gato". Sua casca é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento de diversas doenças, como gastrite, asma e artrite. Quanto à sua composição química é descrita a presença de alcalóides indólicos e oxindólicos, compostos polifenólicos e derivados do ácido quinóvico. Este trabalho teve como objetivo obter em separado frações enriquecidas dos referidos grupos químicos de Uncaria tomentosa, empregando o procedimento de extração em fase sólida, bem como a validação dos métodos analíticos aplicados a cada fração bioativa. Adicionalmente, as frações enriquecidas foram avaliadas quanto ao potencial efeito antiproliferativo contra linhagens de células de glioma e atividade imunoadjuvante empregando como modelo vacinas virais contendo BoHV-5, respectivamente em ensaios in vitro e in vivo. Todos os métodos de análise necessários para o acompanhamento e controle de qualidade da matéria-prima e produtos de transformação foram validados de forma satisfatória. O procedimento de separação/purificação empregando resina de poliestireno demonstrou resultados robustos e reprodutíveis e permitiu a separação de frações ricas em compostos fenólicos, alcalóides e triterpenos. Em outro plano, foi possível constatar a isomerização dos alcalóides pentacíclicos em meio aquoso por efeito do processo de secagem empregando elevadas temperaturas. O método de análise para a quantificação de polifenóis foi discriminatório quando aplicado aos extratos obtidos de diferentes órgãos de U. tomentosa. As frações fenólica e alcaloídica foram capazes de diminuir a porcentagem de células viáveis das linhagens de glioma C6 e U138-MG após período de tratamento de 48 e 72 h, respectivamente. Complementarmente, estas frações não afetaram as células não-tumorais na mesma extensão em que afetam as células cancerosas. No tocante à avaliação da atividade imunoadjuvante, um pequeno efeito foi observado apenas na resposta imune dos animais imunizados com a fração triterpênica. / Uncaria tomentosa (Willd) DC. is a climbing tree native from Central and South America, where is commonly known as “uña-de-gato” or “cat’s claw”. Its bark is widely used in traditional medicine for the treatment of gastritis, asthma and arthritis. Concerning its chemical composition is worth mentioning the presence of indole and oxindole alkaloids, phenolic compounds and quinovic acid derivatives. This work aims to obtain enriched fractions of the three main chemical groups of Uncaria tomentosa above described using solid phase extraction procedure, as well as the validation of specific assay methods. In parallel, potential antiproliferative effect against glioma cell lines and imunoadjuvant activity using BoHV-5 viral vaccine are evaluated by in-vitro and in-vivo models, in that order. All analytical methods required for monitoring and end-process quality control were validated satisfactorily. The separation/purification procedure using a polystyrene resin gave promising results and allowed the separation of phenolics, alkaloids and triterpenes fractions. Fractions yield were in all satisfactory and the processes were robust and reproducible. It could confirm the alkaloid isomerization in aqueous milieu by effect of the temperature process. The LC method for assay of polyphenols was discriminatory when applied to extracts from different organs of U. tomentosa. The fractions of phenolic and alkaloids compounds were able to decrease the percentage of cells in C6 and U138-MG glioma lineages after a 48h and 72h-treatment, respectively. Moreover, these fractions did not affect non-tumoral cells to the extent that they affect tumor cells. With regard to the imunoadjuvant activity evaluation a moderate effect was detected on immune responses of immunized animals with triterpenes fraction.

As sementes de Chenopodium quinoa (quinoa) são conhecidas pelo seu elevado teor de proteína bem como de saponinas. Quimicamente as saponinas de quinoa são triterpenos sendo ácido fitolacagênico, hederagenina, ácido oleanólico e ácido serjânico, as agliconas mais comumente encontradas. Para as saponinas de quinoa existem relatos contraditórios de atividade imunoadjuvante. Complexos imunoestimulantes têm sido bastante estudados nos últimos anos por atuarem como carreadores de antígenos. Esses complexos são constituídos, de saponinas, colesterol, fosfolipídios e um antígeno (ISCOM); na ausência de um antígeno são denominados de matrizes ISCOM. Para as saponinas de quinoa a possibilidade de formação de matrizes ISCOM não está completamente elucidada. Esse trabalho teve como objetivo a caracterização química das principais saponinas presentes nas sementes de C. quinoa bem como a avaliação das atividades antifúngica e imunoadjuvante. Agregados micelares formados por auto-associação das saponinas, bem como os complexos formados quando da formulação com colesterol e fosfatidilcolina também foram avaliados. O método de purificação das saponinas de quinoa utilizando resina poliaromática permitiu a obtenção de duas frações saponosídicas principais denominadas FQ70 e FQ90. Nessas frações foram caracterizadas dez saponinas triterpênicas bidesmosídicas pela técnica de UPLC/Q-TOF-MS. Um método por CLAE foi desenvolvido e validado para a determinação do conteúdo de saponinas nas frações de quinoa. A atividade antifúngica das frações de quinoa foi avaliada pelo método da microdiluição em placa para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM). As frações foram inativas frente a todas as leveduras avaliadas. No entanto, todos os fungos dermatófitos testados foram suscetíveis às frações de quinoa. Os agregados formados por auto-associação das saponinas em solução aquosa bem como as nanoestruturas formadas após a complexação das saponinas de quinoa com colesterol (CHOL) e fosfatidilcolina (PC) foram estudados em diferentes proporções. As técnicas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) demonstraram estruturas esféricas e micelas filiformes. Em condições experimentais similares àquelas relatadas para a formação de matrizes ISCOM de saponinas de Quillaja saponaria, foram observadas estruturas tubulares e micelas anelares. A composição de saponinas das frações de quinoa parece determinar o tipo de nanoestrutura observada por MET. A toxicidade das frações de quinoa foi avaliada pela determinação da atividade hemolítica, toxicidade frente à Artemia salina e toxicidade aguda em camundongos. FQ70 foi praticamente atóxica frente à A. salina, no entanto, FQ90 apresentou toxicidade. Ambas as frações de quinoa foram menos hemolíticas quando comparadas com Quil A (extrato purificado Q. saponaria). Para avaliar a atividade imunoadjuvante camundongos foram imunizados somente com ovoalbumina (OVA) ou com OVA e os adjuvantes Quil A (adjuvante controle), FQ70 ou FQ90. Hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) foi avaliada 28 dias após o priming. A proliferação de esplenócitos com os mitógenos Concanavalina A (Con A)-, lipopolissacarídeo e OVA, foi avaliada 28 dias pós priming. Ambas as frações de quinoa promoveram um estímulo da resposta imune humoral e celular, porém de forma diferenciada. / Chenopodium quinoa (quinoa) seeds are a rich protein source and well-known for their high saponin content. Chemically, quinoa saponins are triterpene glycosides being phytolaccagenic, hederagenin, oleanolic and serjanic acids the most common aglycones found in seeds. Its immunoadjuvant properties have been examined and the results obtained were conflicting. Mixed micelles composed of saponin, cholesterol and phospholipids, either containing antigen (ISCOM) or not (ISCOM matrix), have been under intensive development in recent years due to their ability to act as antigen presenting-carriers with remarkable immunostimulating properties. The formation of ISCOM or other clearly defined micellar structures with quinoa saponins remained uncorroborated. The objectives of this study were the chemical structure characterization of main saponins present in C. quinoa seeds and the evaluation of antifungal and immunoadjuvant properties related to them. Also, micellar aggregates formed by self-association in aqueous solutions by quinoa saponins as well as nanostructures formed after their complexation with cholesterol (CHOL) and phosphatidylcholine (PC) were evaluated. The separation method of quinoa saponins using a polyaromatic resin allowed the preparation of two purified and enriched fractions, FQ70 and FQ90. Ten triterpenic saponins were chemically characterized by UPLC/Q-TOF-MS in quinoa saponin fractions. A LC-method was developed and validated aiming the saponin content assay in quinoa saponin fractions. The antifungal activity of quinoa fractions was evaluated by broth microdilution method for the determination of the minimal inhibitory concentration (MIC). Both fractions were inactive against all yeasts tested. However all dermatophyte fungi were susceptible to quinoa saponin fractions. The aggregates formed by self-association in aqueous solutions by two quinoa saponin fractions, as well as several distinctive nanostructures formed after their complexation with cholesterol and phosphatidylcholine at different ratios were studied. Dynamic Light Scattering (DLS) and Transmission Electron Microscopy (TEM) showed novel nanosized spherical vesicles formed by self-association and worm-like micelles in quinoa saponin fractions. When experimental conditions, similar to those reported for the preparation of Quillaja saponaria ISCOM matrices, tubular and ring-like micelles arose from quinoa saponin fractions. The saponin composition of quinoa fractions seems determines the nanosized structures viewed by TEM. The toxicity of quinoa fractions were assayed by haemolytic, toxicity to brine shrimps, and acute toxicity in mice tests. FQ70 was almost atoxic however, for FQ90 presented toxicity against shrimps. The quinoa saponin fractions were less haemolytic than Quil A (purified extract from Q. saponaria). To evaluate immunoadjuvant activity, mice were immunized subcutaneously with ovoalbumin (OVA) alone or adjuvanted with Quil A (adjuvant control), FQ70 or FQ90. Delayed-Type Hypersensitivity (DTH) were assayed 28 days post-priming and Concanavalin A (Con A)-, Lipopolysaccharide-, and OVA-stimulated splenocyte proliferation were also measured 28 days post-priming. The results suggested that the two quinoa saponin fractions enhanced significantly the production of humoral and cellular immune responses to OVA in mice.

Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, onde é popularmente conhecida como "unha-de-gato". Sua casca é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento de diversas doenças, como gastrite, asma e artrite. Quanto à sua composição química é descrita a presença de alcalóides indólicos e oxindólicos, compostos polifenólicos e derivados do ácido quinóvico. Este trabalho teve como objetivo obter em separado frações enriquecidas dos referidos grupos químicos de Uncaria tomentosa, empregando o procedimento de extração em fase sólida, bem como a validação dos métodos analíticos aplicados a cada fração bioativa. Adicionalmente, as frações enriquecidas foram avaliadas quanto ao potencial efeito antiproliferativo contra linhagens de células de glioma e atividade imunoadjuvante empregando como modelo vacinas virais contendo BoHV-5, respectivamente em ensaios in vitro e in vivo. Todos os métodos de análise necessários para o acompanhamento e controle de qualidade da matéria-prima e produtos de transformação foram validados de forma satisfatória. O procedimento de separação/purificação empregando resina de poliestireno demonstrou resultados robustos e reprodutíveis e permitiu a separação de frações ricas em compostos fenólicos, alcalóides e triterpenos. Em outro plano, foi possível constatar a isomerização dos alcalóides pentacíclicos em meio aquoso por efeito do processo de secagem empregando elevadas temperaturas. O método de análise para a quantificação de polifenóis foi discriminatório quando aplicado aos extratos obtidos de diferentes órgãos de U. tomentosa. As frações fenólica e alcaloídica foram capazes de diminuir a porcentagem de células viáveis das linhagens de glioma C6 e U138-MG após período de tratamento de 48 e 72 h, respectivamente. Complementarmente, estas frações não afetaram as células não-tumorais na mesma extensão em que afetam as células cancerosas. No tocante à avaliação da atividade imunoadjuvante, um pequeno efeito foi observado apenas na resposta imune dos animais imunizados com a fração triterpênica. / Uncaria tomentosa (Willd) DC. is a climbing tree native from Central and South America, where is commonly known as “uña-de-gato” or “cat’s claw”. Its bark is widely used in traditional medicine for the treatment of gastritis, asthma and arthritis. Concerning its chemical composition is worth mentioning the presence of indole and oxindole alkaloids, phenolic compounds and quinovic acid derivatives. This work aims to obtain enriched fractions of the three main chemical groups of Uncaria tomentosa above described using solid phase extraction procedure, as well as the validation of specific assay methods. In parallel, potential antiproliferative effect against glioma cell lines and imunoadjuvant activity using BoHV-5 viral vaccine are evaluated by in-vitro and in-vivo models, in that order. All analytical methods required for monitoring and end-process quality control were validated satisfactorily. The separation/purification procedure using a polystyrene resin gave promising results and allowed the separation of phenolics, alkaloids and triterpenes fractions. Fractions yield were in all satisfactory and the processes were robust and reproducible. It could confirm the alkaloid isomerization in aqueous milieu by effect of the temperature process. The LC method for assay of polyphenols was discriminatory when applied to extracts from different organs of U. tomentosa. The fractions of phenolic and alkaloids compounds were able to decrease the percentage of cells in C6 and U138-MG glioma lineages after a 48h and 72h-treatment, respectively. Moreover, these fractions did not affect non-tumoral cells to the extent that they affect tumor cells. With regard to the imunoadjuvant activity evaluation a moderate effect was detected on immune responses of immunized animals with triterpenes fraction.

As sementes de Chenopodium quinoa (quinoa) são conhecidas pelo seu elevado teor de proteína bem como de saponinas. Quimicamente as saponinas de quinoa são triterpenos sendo ácido fitolacagênico, hederagenina, ácido oleanólico e ácido serjânico, as agliconas mais comumente encontradas. Para as saponinas de quinoa existem relatos contraditórios de atividade imunoadjuvante. Complexos imunoestimulantes têm sido bastante estudados nos últimos anos por atuarem como carreadores de antígenos. Esses complexos são constituídos, de saponinas, colesterol, fosfolipídios e um antígeno (ISCOM); na ausência de um antígeno são denominados de matrizes ISCOM. Para as saponinas de quinoa a possibilidade de formação de matrizes ISCOM não está completamente elucidada. Esse trabalho teve como objetivo a caracterização química das principais saponinas presentes nas sementes de C. quinoa bem como a avaliação das atividades antifúngica e imunoadjuvante. Agregados micelares formados por auto-associação das saponinas, bem como os complexos formados quando da formulação com colesterol e fosfatidilcolina também foram avaliados. O método de purificação das saponinas de quinoa utilizando resina poliaromática permitiu a obtenção de duas frações saponosídicas principais denominadas FQ70 e FQ90. Nessas frações foram caracterizadas dez saponinas triterpênicas bidesmosídicas pela técnica de UPLC/Q-TOF-MS. Um método por CLAE foi desenvolvido e validado para a determinação do conteúdo de saponinas nas frações de quinoa. A atividade antifúngica das frações de quinoa foi avaliada pelo método da microdiluição em placa para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM). As frações foram inativas frente a todas as leveduras avaliadas. No entanto, todos os fungos dermatófitos testados foram suscetíveis às frações de quinoa. Os agregados formados por auto-associação das saponinas em solução aquosa bem como as nanoestruturas formadas após a complexação das saponinas de quinoa com colesterol (CHOL) e fosfatidilcolina (PC) foram estudados em diferentes proporções. As técnicas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) demonstraram estruturas esféricas e micelas filiformes. Em condições experimentais similares àquelas relatadas para a formação de matrizes ISCOM de saponinas de Quillaja saponaria, foram observadas estruturas tubulares e micelas anelares. A composição de saponinas das frações de quinoa parece determinar o tipo de nanoestrutura observada por MET. A toxicidade das frações de quinoa foi avaliada pela determinação da atividade hemolítica, toxicidade frente à Artemia salina e toxicidade aguda em camundongos. FQ70 foi praticamente atóxica frente à A. salina, no entanto, FQ90 apresentou toxicidade. Ambas as frações de quinoa foram menos hemolíticas quando comparadas com Quil A (extrato purificado Q. saponaria). Para avaliar a atividade imunoadjuvante camundongos foram imunizados somente com ovoalbumina (OVA) ou com OVA e os adjuvantes Quil A (adjuvante controle), FQ70 ou FQ90. Hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) foi avaliada 28 dias após o priming. A proliferação de esplenócitos com os mitógenos Concanavalina A (Con A)-, lipopolissacarídeo e OVA, foi avaliada 28 dias pós priming. Ambas as frações de quinoa promoveram um estímulo da resposta imune humoral e celular, porém de forma diferenciada. / Chenopodium quinoa (quinoa) seeds are a rich protein source and well-known for their high saponin content. Chemically, quinoa saponins are triterpene glycosides being phytolaccagenic, hederagenin, oleanolic and serjanic acids the most common aglycones found in seeds. Its immunoadjuvant properties have been examined and the results obtained were conflicting. Mixed micelles composed of saponin, cholesterol and phospholipids, either containing antigen (ISCOM) or not (ISCOM matrix), have been under intensive development in recent years due to their ability to act as antigen presenting-carriers with remarkable immunostimulating properties. The formation of ISCOM or other clearly defined micellar structures with quinoa saponins remained uncorroborated. The objectives of this study were the chemical structure characterization of main saponins present in C. quinoa seeds and the evaluation of antifungal and immunoadjuvant properties related to them. Also, micellar aggregates formed by self-association in aqueous solutions by quinoa saponins as well as nanostructures formed after their complexation with cholesterol (CHOL) and phosphatidylcholine (PC) were evaluated. The separation method of quinoa saponins using a polyaromatic resin allowed the preparation of two purified and enriched fractions, FQ70 and FQ90. Ten triterpenic saponins were chemically characterized by UPLC/Q-TOF-MS in quinoa saponin fractions. A LC-method was developed and validated aiming the saponin content assay in quinoa saponin fractions. The antifungal activity of quinoa fractions was evaluated by broth microdilution method for the determination of the minimal inhibitory concentration (MIC). Both fractions were inactive against all yeasts tested. However all dermatophyte fungi were susceptible to quinoa saponin fractions. The aggregates formed by self-association in aqueous solutions by two quinoa saponin fractions, as well as several distinctive nanostructures formed after their complexation with cholesterol and phosphatidylcholine at different ratios were studied. Dynamic Light Scattering (DLS) and Transmission Electron Microscopy (TEM) showed novel nanosized spherical vesicles formed by self-association and worm-like micelles in quinoa saponin fractions. When experimental conditions, similar to those reported for the preparation of Quillaja saponaria ISCOM matrices, tubular and ring-like micelles arose from quinoa saponin fractions. The saponin composition of quinoa fractions seems determines the nanosized structures viewed by TEM. The toxicity of quinoa fractions were assayed by haemolytic, toxicity to brine shrimps, and acute toxicity in mice tests. FQ70 was almost atoxic however, for FQ90 presented toxicity against shrimps. The quinoa saponin fractions were less haemolytic than Quil A (purified extract from Q. saponaria). To evaluate immunoadjuvant activity, mice were immunized subcutaneously with ovoalbumin (OVA) alone or adjuvanted with Quil A (adjuvant control), FQ70 or FQ90. Delayed-Type Hypersensitivity (DTH) were assayed 28 days post-priming and Concanavalin A (Con A)-, Lipopolysaccharide-, and OVA-stimulated splenocyte proliferation were also measured 28 days post-priming. The results suggested that the two quinoa saponin fractions enhanced significantly the production of humoral and cellular immune responses to OVA in mice.

Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. &Tul.) Mart. é uma espécie nativa do Rio Grande do Sul, conhecida popularmente como pau-sabão, devido à capacidade de suas folhas e cascas formarem abundante espuma em água. A espécie congênere chilena, Q. saponaria, é uma das principais fontes industriais de saponinas, as quais são utilizadas, entre outros, como adjuvantes em vacinas. Tendo em vista a presença de saponinas em Q. brasiliensis, métodos por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidos para a caracterização e o doseamento de fração purificada de saponinas, a partir do extrato aquoso de folhas, denominada QB-90. Ensaios para verificar a toxicidade subcutânea e o perfil dose-dependente para atividade adjuvante também foram realizados com esta fração. Para o doseamento de QB-90 no extrato aquoso foi desenvolvido e validado um método por CLAE empregando coluna de fase reversa C8, sistema isocrático acetonitrila:água, fluxo de 0,8 ml/min e detecção a 214 nm. Na validação do método, foram avaliados os parâmetros de linearidade e intervalo de variação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Em relação à toxicidade subcutânea de QB-90 em camundongos, não foram observados efeitos sistêmicos no intervalo de doses de 50 a 400 μg. Vacinas experimentais preparadas com herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) como antígeno e QB-90 (50-200 μg) foram capazes de aumentar a resposta imunológica em camundongos de modo comparável às saponinas de Q. saponaria (QUIL-A®, 100 μg). Com vistas à potencial utilização sustentável da espécie brasileira na obtenção de saponinas de interesse industrial, protocolos básicos de obtenção de plantas de Q. brasiliensis por micropropagação e por germinação de sementes foram desenvolvidos. Para melhor compreender o perfil de acúmulo de QB-90, seu conteúdo foi investigado em diferentes órgãos vegetais, em diferentes estações do ano e durante o desenvolvimento de plântulas, assim como em resposta a fatores de estresses bióticos e abióticos. O conteúdo de QB-90 não foi afetado pela aplicação de ácido salicílico exógeno (5 mM). No entanto, foi aumentado pela aplicação exógena de ácido jasmônico (40 μM e 400 μM), bem como pela exposição à radiação UVC. Tendência de aumento no teor de QB-90 foi observada com a aplicação de dano mecânico controlado e com a exposição à radiação UVB. A distribuição órgão-específica de QB-90 foi avaliada, detectando-se maiorconcentração nas folhas do que em raízes e caules de plantas propagadas em laboratório. O teor de QB-90 também foi analisado nas diferentes estações climáticas ao longo de dois anos, indicando que a redução da insolação, geralmente associada a períodos de baixa pluviosidade, está associada à maior produção de QB-90. / Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart. is a native tree of Rio Grande do Sul, the Southern state of Brazil, commonly known as soap tree due to the capacity of their leaves and barks to produce abundant foam in water. The related Chilean species, Q. saponaria, is one of the main sources of industrial saponins which are used as adjuvant formulation for vaccines. Considering the presence of saponins in Q. brasiliensis, thin-layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) methods were developed to characterize and quantify the purified saponin fraction named QB-90, obtained from the aqueous extract of leaves. Additionally, the subcutaneous toxicity and dose-response profile to adjuvant activity of QB-90 were evaluated in mice. An HPLC method was developed and validated to quantify QB-90 content in aqueous extract, employing RP-8 column, mobile phase acetonitrile:water, flow rate of 0.8 ml/min and detection at 214 nm. The validation parameters evaluated were linearity and range, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. In relation to QB-90 subcutaneous toxicity in mice, systemic effects were not observed in doses ranging from 50-400 μg. Experimental vaccines prepared with bovine herpesvirus type I (BoHV-1) antigen and QB-90 (50- 200 μg) were able to enhance the immune responses of mice in a comparable manner to saponins from Q. saponaria (QuilA, 100 μg). Considering the potential sustainable utilization of the Brazilian species as a source of saponins of industrial use, basic protocols for obtaining Q. brasiliensis plants by micropropagation and seed germination were developed. To better understand the accumulation patterns of QB-90, we investigated its content in different plant organs; throughout the seasons and during seedling development, as well as in response to potential biotic and abiotic stress factors. Content of QB-90 wasn’t affected by exogenous application of salicylic acid (5mM). However, it was increased by exogenous application of jasmonic acid (40 μM and 400 μM), as well as by exposure to UVC. Trends toward increase in QB-90 content were observed with exposure to UVB and wounding. The organ-specific QB-90 distribution was evaluated and higher amounts were observed in leaves than roots and stems of plants propagated in the laboratory. Variations inQB-90 content in different seasons for two years showed that lower insolation, generally combined with low precipitation periods, were associated with higher QB- 90 content.

Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. &Tul.) Mart. é uma espécie nativa do Rio Grande do Sul, conhecida popularmente como pau-sabão, devido à capacidade de suas folhas e cascas formarem abundante espuma em água. A espécie congênere chilena, Q. saponaria, é uma das principais fontes industriais de saponinas, as quais são utilizadas, entre outros, como adjuvantes em vacinas. Tendo em vista a presença de saponinas em Q. brasiliensis, métodos por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidos para a caracterização e o doseamento de fração purificada de saponinas, a partir do extrato aquoso de folhas, denominada QB-90. Ensaios para verificar a toxicidade subcutânea e o perfil dose-dependente para atividade adjuvante também foram realizados com esta fração. Para o doseamento de QB-90 no extrato aquoso foi desenvolvido e validado um método por CLAE empregando coluna de fase reversa C8, sistema isocrático acetonitrila:água, fluxo de 0,8 ml/min e detecção a 214 nm. Na validação do método, foram avaliados os parâmetros de linearidade e intervalo de variação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Em relação à toxicidade subcutânea de QB-90 em camundongos, não foram observados efeitos sistêmicos no intervalo de doses de 50 a 400 μg. Vacinas experimentais preparadas com herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) como antígeno e QB-90 (50-200 μg) foram capazes de aumentar a resposta imunológica em camundongos de modo comparável às saponinas de Q. saponaria (QUIL-A®, 100 μg). Com vistas à potencial utilização sustentável da espécie brasileira na obtenção de saponinas de interesse industrial, protocolos básicos de obtenção de plantas de Q. brasiliensis por micropropagação e por germinação de sementes foram desenvolvidos. Para melhor compreender o perfil de acúmulo de QB-90, seu conteúdo foi investigado em diferentes órgãos vegetais, em diferentes estações do ano e durante o desenvolvimento de plântulas, assim como em resposta a fatores de estresses bióticos e abióticos. O conteúdo de QB-90 não foi afetado pela aplicação de ácido salicílico exógeno (5 mM). No entanto, foi aumentado pela aplicação exógena de ácido jasmônico (40 μM e 400 μM), bem como pela exposição à radiação UVC. Tendência de aumento no teor de QB-90 foi observada com a aplicação de dano mecânico controlado e com a exposição à radiação UVB. A distribuição órgão-específica de QB-90 foi avaliada, detectando-se maiorconcentração nas folhas do que em raízes e caules de plantas propagadas em laboratório. O teor de QB-90 também foi analisado nas diferentes estações climáticas ao longo de dois anos, indicando que a redução da insolação, geralmente associada a períodos de baixa pluviosidade, está associada à maior produção de QB-90. / Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart. is a native tree of Rio Grande do Sul, the Southern state of Brazil, commonly known as soap tree due to the capacity of their leaves and barks to produce abundant foam in water. The related Chilean species, Q. saponaria, is one of the main sources of industrial saponins which are used as adjuvant formulation for vaccines. Considering the presence of saponins in Q. brasiliensis, thin-layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) methods were developed to characterize and quantify the purified saponin fraction named QB-90, obtained from the aqueous extract of leaves. Additionally, the subcutaneous toxicity and dose-response profile to adjuvant activity of QB-90 were evaluated in mice. An HPLC method was developed and validated to quantify QB-90 content in aqueous extract, employing RP-8 column, mobile phase acetonitrile:water, flow rate of 0.8 ml/min and detection at 214 nm. The validation parameters evaluated were linearity and range, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. In relation to QB-90 subcutaneous toxicity in mice, systemic effects were not observed in doses ranging from 50-400 μg. Experimental vaccines prepared with bovine herpesvirus type I (BoHV-1) antigen and QB-90 (50- 200 μg) were able to enhance the immune responses of mice in a comparable manner to saponins from Q. saponaria (QuilA, 100 μg). Considering the potential sustainable utilization of the Brazilian species as a source of saponins of industrial use, basic protocols for obtaining Q. brasiliensis plants by micropropagation and seed germination were developed. To better understand the accumulation patterns of QB-90, we investigated its content in different plant organs; throughout the seasons and during seedling development, as well as in response to potential biotic and abiotic stress factors. Content of QB-90 wasn’t affected by exogenous application of salicylic acid (5mM). However, it was increased by exogenous application of jasmonic acid (40 μM and 400 μM), as well as by exposure to UVC. Trends toward increase in QB-90 content were observed with exposure to UVB and wounding. The organ-specific QB-90 distribution was evaluated and higher amounts were observed in leaves than roots and stems of plants propagated in the laboratory. Variations inQB-90 content in different seasons for two years showed that lower insolation, generally combined with low precipitation periods, were associated with higher QB- 90 content.

Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. &Tul.) Mart. é uma espécie nativa do Rio Grande do Sul, conhecida popularmente como pau-sabão, devido à capacidade de suas folhas e cascas formarem abundante espuma em água. A espécie congênere chilena, Q. saponaria, é uma das principais fontes industriais de saponinas, as quais são utilizadas, entre outros, como adjuvantes em vacinas. Tendo em vista a presença de saponinas em Q. brasiliensis, métodos por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidos para a caracterização e o doseamento de fração purificada de saponinas, a partir do extrato aquoso de folhas, denominada QB-90. Ensaios para verificar a toxicidade subcutânea e o perfil dose-dependente para atividade adjuvante também foram realizados com esta fração. Para o doseamento de QB-90 no extrato aquoso foi desenvolvido e validado um método por CLAE empregando coluna de fase reversa C8, sistema isocrático acetonitrila:água, fluxo de 0,8 ml/min e detecção a 214 nm. Na validação do método, foram avaliados os parâmetros de linearidade e intervalo de variação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Em relação à toxicidade subcutânea de QB-90 em camundongos, não foram observados efeitos sistêmicos no intervalo de doses de 50 a 400 μg. Vacinas experimentais preparadas com herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) como antígeno e QB-90 (50-200 μg) foram capazes de aumentar a resposta imunológica em camundongos de modo comparável às saponinas de Q. saponaria (QUIL-A®, 100 μg). Com vistas à potencial utilização sustentável da espécie brasileira na obtenção de saponinas de interesse industrial, protocolos básicos de obtenção de plantas de Q. brasiliensis por micropropagação e por germinação de sementes foram desenvolvidos. Para melhor compreender o perfil de acúmulo de QB-90, seu conteúdo foi investigado em diferentes órgãos vegetais, em diferentes estações do ano e durante o desenvolvimento de plântulas, assim como em resposta a fatores de estresses bióticos e abióticos. O conteúdo de QB-90 não foi afetado pela aplicação de ácido salicílico exógeno (5 mM). No entanto, foi aumentado pela aplicação exógena de ácido jasmônico (40 μM e 400 μM), bem como pela exposição à radiação UVC. Tendência de aumento no teor de QB-90 foi observada com a aplicação de dano mecânico controlado e com a exposição à radiação UVB. A distribuição órgão-específica de QB-90 foi avaliada, detectando-se maiorconcentração nas folhas do que em raízes e caules de plantas propagadas em laboratório. O teor de QB-90 também foi analisado nas diferentes estações climáticas ao longo de dois anos, indicando que a redução da insolação, geralmente associada a períodos de baixa pluviosidade, está associada à maior produção de QB-90. / Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart. is a native tree of Rio Grande do Sul, the Southern state of Brazil, commonly known as soap tree due to the capacity of their leaves and barks to produce abundant foam in water. The related Chilean species, Q. saponaria, is one of the main sources of industrial saponins which are used as adjuvant formulation for vaccines. Considering the presence of saponins in Q. brasiliensis, thin-layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) methods were developed to characterize and quantify the purified saponin fraction named QB-90, obtained from the aqueous extract of leaves. Additionally, the subcutaneous toxicity and dose-response profile to adjuvant activity of QB-90 were evaluated in mice. An HPLC method was developed and validated to quantify QB-90 content in aqueous extract, employing RP-8 column, mobile phase acetonitrile:water, flow rate of 0.8 ml/min and detection at 214 nm. The validation parameters evaluated were linearity and range, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. In relation to QB-90 subcutaneous toxicity in mice, systemic effects were not observed in doses ranging from 50-400 μg. Experimental vaccines prepared with bovine herpesvirus type I (BoHV-1) antigen and QB-90 (50- 200 μg) were able to enhance the immune responses of mice in a comparable manner to saponins from Q. saponaria (QuilA, 100 μg). Considering the potential sustainable utilization of the Brazilian species as a source of saponins of industrial use, basic protocols for obtaining Q. brasiliensis plants by micropropagation and seed germination were developed. To better understand the accumulation patterns of QB-90, we investigated its content in different plant organs; throughout the seasons and during seedling development, as well as in response to potential biotic and abiotic stress factors. Content of QB-90 wasn’t affected by exogenous application of salicylic acid (5mM). However, it was increased by exogenous application of jasmonic acid (40 μM and 400 μM), as well as by exposure to UVC. Trends toward increase in QB-90 content were observed with exposure to UVB and wounding. The organ-specific QB-90 distribution was evaluated and higher amounts were observed in leaves than roots and stems of plants propagated in the laboratory. Variations inQB-90 content in different seasons for two years showed that lower insolation, generally combined with low precipitation periods, were associated with higher QB- 90 content.