Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-13T19:08:11Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_DOUTORADO 2012 - Cynarha Daysy Cardoso da Silva.pdf: 3444226 bytes, checksum: a9c71962304b89acd2a0635de279f563 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T19:08:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_DOUTORADO 2012 - Cynarha Daysy Cardoso da Silva.pdf: 3444226 bytes, checksum: a9c71962304b89acd2a0635de279f563 (MD5) Previous issue date: 2012-07 / CNPQ / As lectinas são um grupo de proteínas que se ligam especificamente a carboidratos e aglutina diferentes células através da ligação a glicoconjugados da superfície celular. A propriedade de ligação a carboidratos determina a classe da lectina que é promovida pelo domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD). O estudo com lectinas de peixes propriedade, funções e eventos biológicos foi apresentado em forma de artigo de revisão. A lectina do soro de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), OniL, foi parcialmente purificada e caracterizada. A pré-purificação foi realizada por precipitação com sulfato de amônio (fração 20-40%), F2, seguida de diálise, atividade hemaglutinante e inibição da atividade hemaglutinante. A fração foi cromatografada em matriz de afinidade (Con A-Sepharose 4B) e eluída com metil-α-D-mannopyranosideo (200 mM) em TBS seguida de diálise para avaliar suas características bioquímicas como: especificidade a caboidratos, teste de temperatura e íons, SDS-PAGE e PAGE. Nos ensaios imunológicos, in vitro, foram analisados índices de citotoxidade e proliferação, produção de citocinas, viabilidade celular e tipo de resposta imune em culturas de esplenócitos de camundongos BALB/c. No ensaio de citotoxidade, seis concentrações (100, 50, 25, 10, 5 e 1 μg/mL) de OniL foram analisadas por 24 h; saponina foi empregada como um controle positivo; para avaliar a atividade proliferativa, células foram tratadas por 72 h com OniL (2,5, 5 e 10 μg/mL) ou Con A (2,5 μg/mL) comparando com o controle; a citotoxidade e proliferação dos compostos foi determinada comparando o percentual de incorporação da [3H]-timidina como indicador de viabilidade celular usando radiação beta counter. A produção de citocinas (IL-2, IL-6, IL-10 e IFN-γ) foi determinada por ELISA; sobrenadantes de cultura não tratadas foram considerados controles; as culturas foram estimuladas durante 24, 48, 72 h e 6 dias com concentrações de 10 μg/mL de OniL e 2,5 μg/mL de Con A, este último tratamento considerado o controle positivo. A morte celular, analisada por citometria de fluxo, foi verificada com marcadores Anexina V-FITC e Iodeto de Propídeo. Os esplenócitos foram estimulados por 24 e 48 h com OniL (10 μg/mL) e Con A (2,5 μg/mL); células marcadas com Anexina-FITC (negativa) e Iodeto de propídeo (positivo) foram consideradas necróticas; Anexina-FITC (positiva) e Iodeto de Propídeo (negativa), apoptóticas. O método colorimétrico de Griess avaliou a concentração de nitritos dos sobrenadantes de culturas tratadas com OniL (10 μg/mL) e Con A (2,5 μg/mL) nos tempos de 24, 48, 72 h e 6 dias de incubação. F2 e OniL apresentou atividade hemaglutinante específica de 330,3 e 94,7, respectivamente. A lectina purificada apresentou um rendimento de 31,1%; OniL, aglutina eritrócitos de coelho (título, 64-1) e eritrócitos humanos A, B, AB e O (título, 8-1, 64-1, 4-1 e 32-1, respectivamente); a atividade hemaglutinate foi detectada numa faixa de pH entre 7,0 e 11,0 e foi completamente preservada após o aquecimento de 10 min a 25, 30, 40, 50 e 60 °C, porém a atividade foi completamente abolidas após 70 °C. A adição de um agente quelante de Ca2+, EDTA, diminuiu a atividade revelando que OniL é uma lectina cálcio-dependente. O peso molecular foi de 17 kDa na SDS-PAGE em condições não redutoras; e 11 e 6,6 kDa na presença de uma agente redutor a proteína apresentou duas subnidades ligadas por pontes disulfeto; OniL apresentou-se, através de PAGE, como uma proteína ácida com banda única de polipeptídeo. Os ensaios imunológicos revelaram que OniL não é citotóxica para esplenócitos de camundongos e induziu alta produção de citocinas em relação ao controle: IFN-γ (24 h), IL-2 e IL-6 em todos os tempos analisados. Porém, a produção de IL-10 e concentrações de nitritos foram baixas quando comparadas com o controle; OniL apresentou atividade proliferativa em relação ao controle para todas as concentrações e não induz morte celular significativa nos tempos analisados. A lectina purificada do soro de tilápia (Oreochromis niloticus) é manose-específica, não apresenta citotoxidade para esplenócitos, com atividade imunomoduladora induzindo produção de citocinas para diferenciação e proliferação de células preferencialmente Th1 CD4+, assim, esta proteína pode ser utilizada como um potente agente mitogênico em mamíferos.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T14:03:17Z No. of bitstreams: 2 Tese_Marília_Coriolano.pdf: 2264941 bytes, checksum: 2ab211450cc7168059a117568b535642 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T14:03:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese_Marília_Coriolano.pdf: 2264941 bytes, checksum: 2ab211450cc7168059a117568b535642 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / FACEPE / Lectinas constituem um grupo heterogêneo de proteínas e glicoproteínas que se ligam especificamente a carboidratos com alta afinidade. O beijupirá, Rachycentron canadum, pertence à família Rachycentridae, e é uma espécie que reune as melhores condições para o cultivo de peixe marinho. Uma lectina foi purificada do soro do peixe Rachycentron canadum (RcaL) através de cromatografia de afinidade com uma coluna Concanavalina A-Sepharose 4B. Um pico com atividade dessa lectina foi Ca2+ (20 mM) dependente. RcaL é uma proteína com atividade em pH 7.0-8.0 e resistente a 40 ºC por 10 min. A lectina mostrou maior especificidade pelos açúcares metil-α-D-manopiranosídeo e D-manose (200 mM); frações cromatografadas de RcaL eluídas aglutinaram eritrócitos de coelho (AH: 128-1), mantiveram 66% da atividade da lectina purificada e o fator de purificação obtido foi 1.14. Sob condições redutoras, uma banda de 19.2 kDa foi revelada em SDS-PAGE. PAGE confirmou que RcaL é uma proteína ácida revelada em um única banda. Ensaios citotóxicos e imunomodulatórios com RcaL em culturas de esplenócitos de camundongos foram realizados e mostraram que a lectina não foi citotóxica e induziu alta produção de IFN- e óxido nítrico. Além disso, também foi avaliada a resposta proliferativa e a produção de citocinas em esplenócitos de camundongos in vitro estimulados com as lectinas RcaL e Con A. Os resultados demonstraram altos índices de proliferação induzidos por RcaL em relação às células controles e a Con A. RcaL induziu alta produção de IL-2 e IL-6 em relação ao controle. Somente apoptose tardia foi promovida pelo tratamento com RcaL em relação ao controle, em 24 horas de ensaio; RcaL e Con A promoveram também apoptose tardia em 48 horas de ensaio. No entanto, a viabilidade celular foi superior a 90% em esplenócitos tratados com RcaL. Os resultados mostraram que a lectina RcaL induz preferencialmente resposta imune Th1 sugerindo que ela atua como um composto imunomodulador e também induz resposta proliferativa, revelando que esta lectina pode ser usada como agente mitogênico em ensaios imunoestimulatórios.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9504_1.pdf: 2191437 bytes, checksum: 16fae40cd934ddd16c686841334890d0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Lectinas constituem um grupo heterogêneo de proteínas e glicoproteínas que se ligam especificamente a carboidratos com alta afinidade. O beijupirá, Rachycentron canadum, pertence à família Rachycentridae, e é uma espécie que reune as melhores condições para o cultivo de peixe marinho. Uma lectina foi purificada do soro do peixe Rachycentron canadum (RcaL) através de cromatografia de afinidade com uma coluna Concanavalina A-Sepharose 4B. Um pico com atividade dessa lectina foi Ca2+ (20 mM) dependente. RcaL é uma proteína com atividade em pH 7.0-8.0 e resistente a 40 ºC por 10 min. A lectina mostrou maior especificidade pelos açúcares metil-α-D-manopiranosídeo e D-manose (200 mM); frações cromatografadas de RcaL eluídas aglutinaram eritrócitos de coelho (AH: 128-1), mantiveram 66% da atividade da lectina purificada e o fator de purificação obtido foi 1.14. Sob condições redutoras, uma banda de 19.2 kDa foi revelada em SDS-PAGE. PAGE confirmou que RcaL é uma proteína ácida revelada em um única banda. Ensaios citotóxicos e imunomodulatórios com RcaL em culturas de esplenócitos de camundongos foram realizados e mostraram que a lectina não foi citotóxica e induziu alta produção de IFN- e óxido nítrico. Além disso, também foi avaliada a resposta proliferativa e a produção de citocinas em esplenócitos de camundongos in vitro estimulados com as lectinas RcaL e Con A. Os resultados demonstraram altos índices de proliferação induzidos por RcaL em relação às células controles e a Con A. RcaL induziu alta produção de IL-2 e IL-6 em relação ao controle. Somente apoptose tardia foi promovida pelo tratamento com RcaL em relação ao controle, em 24 horas de ensaio; RcaL e Con A promoveram também apoptose tardia em 48 horas de ensaio. No entanto, a viabilidade celular foi superior a 90% em esplenócitos tratados com RcaL. Os resultados mostraram que a lectina RcaL induz preferencialmente resposta imune Th1 sugerindo que ela atua como um composto imunomodulador e também induz resposta proliferativa, revelando que esta lectina pode ser usada como agente mitogênico em ensaios imunoestimulatórios

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-04-20T15:09:26Z No. of bitstreams: 1 Lethicia Souza Tavares.pdf: 1585867 bytes, checksum: 5409eeb189a05f35fe911992f6371542 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-20T15:09:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lethicia Souza Tavares.pdf: 1585867 bytes, checksum: 5409eeb189a05f35fe911992f6371542 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Calotropis procera, is a medicinal plant known in Pernambuco as “silk-cotton”. Is laticífer plant belonging to the family Apocynaceae broadly found in the Brazilian Northeast. Current literature data show that proteins obtained from its latex harbour anti-inflammatory action. In the present study, a protein fraction obtained by ion-exchange chromatography named LPPII, which is rich in cysteine proteases, had its immunmodulatory activity evaluated in cultures of peritoneal macrophages infected by Salmonella enterica Sor. Typhimurium. Macrophages were obtained from the peritoneal cavity of Swiss mice using RPMI culture medium containing antibiotics. The cells obtained were adjusted to 1 x 106 cell/mL and incubated at 37° C and 5% CO2, in cell culture plates, and the adherent macrophages used in the assays. The bacterial quantification assays were performed in a preventive manner, where the macrophages were treated with LPPII (1 μg/ mL or 10 μg/ mL) or LPPII+IAA (10 μg / mL) (inactivated with iodoacetamide) followed by infection with S. Typhimurium (1 x 108 CFU / mL), and in a curative manner, where macrophages were first infected with S. typhimurium (1 x 108 CFU / mL) followed by treatment with LPPII (1 μg/ mL or 10 μg/ mL) or LPPII+IAA (10 μg/ ml). The cell viability assay was performed curatively with macrophages infected with S. Typhimurium (1 x 108 CFU / ml). For IL1β, TNF, IL-6, iNOS and TLR-4 cytokine gene expression assays, macrophages were only treated with LPPII (1 μg/ mL or 10 μg/ mL) or LP+IAA (10 μg / mL), or bacterial LPS stimulation, followed by curative or preventative treatments with LPPII (1 μg/ mL or 10 μg/ mL) or LP+IAA (10 μg/ mL). The results show that macrophages infected with a S. Typhimurium C5 and treated with LPPII in a preventative or curative manner, reduced the number of viable bacteria in the intracellular environment. In this case, macrophages treated preventively with LPPII 10 μg/ mL, showed a significant decrease (p <0.05) in the amount of intracellular bacteria when compared to the control, macrophages without LPPII treatment. In the curative form, significant decrease of intracellular S. Typhimurium was observed in LPPII1μg/ mL-treated macrophages compared to control cells, without LPPII treatment. On the other hand, the groups treated with LPPII+IAA had a greater number of intracellular bacteria, suggesting the action of cysteine proteases on the observed antimicrobial effect. Curative treatment with LPPII also increased the viability of infected macrophages relative to the untreated control groups. Thus, groups treated with LPPII1μg/ mL obtained viability 14.74% greater than the control group without treatment, whereas macrophages treated with LPPII10μg/ mL obtained 24.11%. Groups of macrophages stimulated with LPS and then treated with LPPII had a reduction in the gene expression of the inflammatory cytokines TNF, IL1-β and IL-6, in addition to Toll-like receptor 4. Taken together, we found that LPPII obtained from latex of C. procera presents biomolecules with immunomodulatory activity beneficial to the control of S. Typhimurium infections. / Calotropis procera, planta medicinal conhecida popularmente em Pernambuco como algodão-de-seda. É uma planta laticífera que pertence à família Apocynaceae, sendo encontrada com facilidade no nordeste brasileiro. Dados da literatura corrente mostram que proteínas obtidas de seu látex possuem ação anti-inflamatória. Diante disso, neste trabalho, uma fração proteica obtida por cromatografia de troca iônica, chamada LPPII, rica em proteases cisteínicas, foi avaliada quanto à sua atividade imunomodulatória em culturas de macrófagos peritoneais infectadas por Salmonella enterica Sor. Typhimurium. Os macrófagos foram obtidos a partir da lavagem peritoneal de camundongos Swiss com meio de cultura RPMI contendo antibióticos penicilina e estreptomicina. As células do fluido obtido foram ajustadas a 1 x 106 cél/ mL e incubadas em estufa a 37ºC e CO2 5%, em placas de cultura de células, e os macrófagos aderentes utilizados nos ensaios. Os ensaios de quantificação bacteriana se deram de forma preventiva, onde os macrófagos foram tratados com LPPII (1 μg/mL ou 10 μg/mL) ou LPPII+IAA (10 μg/mL) (inativada com iodoacetamida) seguido de infecção com S. Typhimurium (1 x 108 UFC/mL), e de forma curativa, onde primeiro se deu infecção dos macrófagos por S. Typhimurium (1 x 108 UFC/mL) seguido de tratamento com LPPII (1 μg/mL ou 10 μg/mL) ou LPPII+IAA (10 μg/mL). O ensaio de viabilidade celular foi realizado de forma curativa com macrófagos infectados com S. Typhimurium (1 x 108 UFC/mL). Para ensaios de expressão gênica de citocinas IL1- β, TNF, IL-6, iNOS e TLR-4, os macrófagos receberam apenas tratamento com LPPII (1 μg/mL ou 10 μg/mL) ou LP+IAA (10 μg/mL), ou houve estímulo de LPS bacteriano, seguidos de tratamentos de forma curativa ou preventiva com LPPII (1 μg/mL ou 10 μg/mL) ou LP+IAA (10 μg/mL). Os resultados mostram que macrófagos infectados com uma cepa de S. Typhimurium C5 e tratados com LPPII de forma preventiva ou curativa, reduziram o número de bactérias viáveis no ambiente intracelular. Neste caso, macrófagos tratados de forma preventiva com LPPII 10 μg/mL, demonstraram diminuição significativa (p<0,05) na quantidade de bactérias intracelulares quando comparados ao controle, macrófagos sem tratamento com LPPII. Na forma curativa, observou-se diminuição significativa de S. Typhimurium intracelular em macrófagos tratados com LPPII1μg/mL, quando comparados ao controle, células sem tratamento com LPPII. Por outro lado, os grupos tratados com LPPII+IAA tiveram um maior número de bactérias intracelulares, sugerindo a ação das proteases cisteínicas no efeito antimicrobiano observado. O tratamento curativo com LPPII também aumentou a viabilidade dos macrófagos infectados em relação aos grupos controles sem tratamento. Deste modo, grupos tratados com LPPII1μg/mL obtiveram viabilidade 14,74% maior que o grupo controle sem tratamento, enquanto que macrófagos tratados com LPPII10μg/mL obtiveram 24,11%. Grupos de macrófagos estimulados com LPS e, a seguir, tratados com LPPII, tiveram redução na expressão gênica das citocinas inflamatórias TNF, IL1-β e IL-6, além de receptor do tipo Toll-4. Tomados esses resultados em conjunto, observamos que LPPII obtida do látex de C. procera apresenta biomoléculas com atividade imunomodulatória benéfica ao controle de infecções por S. Typhimurium.