Vor zirka 45 Jahren wurde das La Protein (SS-B) erstmals als Autoantigen von Patienten mit Systemischen Lupus Erythematodes (SLE) oder Primären Sjögren’s Syndrom beschrieben. Jahrzehntelange Forschungen befassten sich mit seiner Struktur- und Funktionsaufklärung, sowie der Untersuchung von monoklonalen anti-La Antikörpern (anti-La mAK). Doch noch immer werfen nukleäre Antigene wie das La Protein und die gegen sie gerichteten Autoantikörper verschiedene Fragen auf. Diese betreffen besonders deren Entstehung und die pathophysiologische Bedeutung. So war es die Zielsetzung dieser Arbeit, die pathophysiologische Bedeutung des La Proteins in der Autoimmunkrankheit und der Krankheitsentstehung bei SLE-Patienten weiter aufzuklären. Im Zentrum der Untersuchungen stand dabei die Redoxsensitivität des La Proteins und deren Einfluss auf die räumliche Proteinstruktur, die zelluläre Lokalisation, die Funktion der Nukleinsäurebindung, sowie die Antigenität. Dabei konnte erstmals mit Hilfe von CD-Spektroskopieanalysen deutlich gezeigt werden, dass die drei Cysteine (C18, C232 und C245) des La Proteins für die Struktur eine zentrale Rolle spielen. Es konnte demonstriert werden, dass die Fähigkeit zur redoxabhängigen Strukturumfaltung zum Verlust der protektiven Wirkung des La Proteins auf gebundene Nukleinsäure führt, wodurch diese für Nukleasen zugänglich gemacht wird und abgebaut werden kann. Dies ließ sich in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe verschiedener Experimente verifizieren, beispielsweise durch die Anwesenheit von Kupferionen (Cu2+), oder auch durch die Änderung des pH-Wertes von 7,0 auf 4,5. Parallel hierzu wurden neben Wildtyp La Protein auch verschiedene Cysteinmutanten getestet, um die Redoxabhängigkeit auch durch den Austausch der Cysteine C18, C232 und C245 zu zeigen. Die Änderungen des Redoxzustands beeinflussten jedoch nicht nur Sekundär- und Tertiär-struktur des La Proteins, sondern auch sein Di- und Oligomerisationsverhalten, sowie die Antigenerkennung durch bestimmte anti-La mAK (mAK der 312B Gruppe). Erstmals konnte in dieser Arbeit auch gezeigt werden, dass Patientenautoantikörper nicht nur gegen die nor-malerweise nukleär vorliegende, reduzierte Form des La Proteins existieren. Es waren eben-so Patientenautoantikörper gegen die zytoplasmatische, oxidierte Form nachweisbar. Auch auf zellulärer Ebene wurde die Wirkung einer redoxabhängigen Umfaltung des La Proteins deutlich. Durch den Einfluss von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) konnte eine zytoplasmatische Anreicherung beobachtet werden. Die dazu bereits bekannten Daten aus der Literatur konnten mit dieser Arbeit nochmals belegt und darüber hinaus ergänzt werden. Die zytoplasmatische Anreicherung wurde in der vorliegenden Arbeit für verschiedene ROS Stimuli gezeigt, darunter H2O2, Cu(II)SO4, Fe(II)Cl2 und darüber hinaus auch für NO-Glutathion (Stimulus reaktiver Stickstoffspezies NO). Des Weiteren konnte erstmals eine zytoplasmatische La Anreicherung durch eine Veränderung des intrazellulären ROS Levels nach Rezeptorstimulation gezeigt werden. Spannender Weise gelang dies für dendritische Zellen, wie moDCs und slanDCs, als auch für Endothelzellen (HUVECs). Die Induktion erfolgte dabei über Toll-like Rezeptoren (TLR), wie TLR4 (LPS-abhängiger Toll-like Rezeptor) und auch über TLR7/8, zwei Toll-like Rezeptoren, die für die Bindung von ssRNA, beispielsweise nach Virusinfektion zuständig sind. Unter dem Einfluss dieser Stimuli, kommt es zur Umfaltung des La Proteins, zum Loslösen von seinem potentiellen, indirekt über den anti-La mAK 7B6 nachgewiesenen Bindepartner und zum Verlust der nukleären Lokalisation. Im Zytoplasma kann die oxidierte Proteinvariante ihre protektive Aufgabe bezüglich der gebundenen Nukleinsäure nicht weiter ausführen. Es kommt unter normalen Umständen zu Dissoziation der gebundenen Nukleinsäuren und einem potentiellen Abbau dieser. Da bei Autoimmunpatienten jedoch sehr häufig eine Reduktion der Nukleaseaktivität nachweisbar ist, könnte der Nukleinsäureabbau in diesen Patienten gestört sein, was zu einem oxidierten La Protein mit noch gebundener Nukleinsäure führen würde. Neben der zytoplasmatischen Lokalisation wurde für das La Protein auch eine Lokalisation an der Zelloberfläche diskutiert. Die hier durchgeführten Studien mit den verschiedenen Sauerstoff- oder Stickstoffstressstimuli zeigten jedoch unter den gewählten Bedingungen keine Exposition des La Proteins auf die Zelloberfläche. Daher wurden apoptotische und nekrotische Zellen als mögliche La Proteinquelle für die Dekoration lebender Nachbarzellen untersucht. War in der Literatur noch über „apototic bodies“ als Quelle des La Proteins als Autoantigen spekuliert wurden, so konnte hier gezeigt werden, dass das La Protein aus humanen, apoptotischem Zellmaterial zu keiner nachweislichen Oberflächendekoration lebender Zellen führte. Anders verhielt es sich bei nekrotischem Zellmaterial. Hier konnte zum Beispiel humanes oxidiertes La Protein auf den murinen Zellen nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Analysen zeigte sich darüber hinaus, dass sowohl oxidiertes als auch reduziertes La Protein auf die Oberfläche verschiedener Zelltypen binden kann. Insgesamt konnte jedoch mehr oxidiertes La Protein auf den verschiedensten Zellentypen nachge-wiesen werden, als reduziertes La Protein unter gleichen Bedingungen. Auch ergaben sich Unterschiede bezüglich der Proteinbindung zwischen einzelnen Zelltypen. Vertreter von Anti-gen präsentierenden Zellen, wie Monozyten oder B-Zellen (Radji), sowie Endothelzellen (HUVECs), aber auch murine A9 Fibroblasten konnten im Vergleich zu T-Zellen und NK-Zellen, mehr La Protein auf ihrer Oberfläche binden. Diese Resultate lassen eine pathophysiologische Bedeutung des La Proteins bei SLE Patienten erkennen. Im Zuge von Zellschä-digungen, wie beispielsweise nach UV-Stress, kommt es zu einem nekrotischen Zellzerfall. Dieser führt zur Freisetzung von oxidiertem La Protein, welches auf benachbarte Zellen bindet. Dadurch können sie zum Ziel einer komplementsystemvermittelten Immunreaktion, sowie einer antikörpervermittelten, NK-Zellen gestützten Zelllyse (ADCC) werden. Für die Initiation einer Immunantwort, und im Besonderen für die Reifung autoreaktiver B-Zellen zu autoantikörpernproduzierenden Plasmazellen, bedarf es jedoch zunächst einer Aktivierung von dendritischen Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass lösliches La Protein dendritische Zellen aktivieren kann, belegt über die dokumentierte, finale TNFα Sekretion. Dabei war jedoch nicht entscheidend, ob La in einem reduzierten oder oxidierten Zustand vorlag, sondern das es assoziierte Nukleinsäuren aufwies. Experimentell führten an La Protein gebundene Nukleinsäuren zur Aktivierung von dendritischen Zellen (slanDCs). Wurde die Nukleinsäuren jedoch zuvor durch RNaseA Behandlung oder die Inkubation in Serum eines gesunden Spenders abgebaut, so lag keine oder eine nur sehr geringe Aktivierung von slanDCs vor. Eine Inkubation von La Protein in SLE Patientenserum hatte keine solche verminderte Aktivierung dendritischer Zellen zur Folge. Unter Berücksich-tigung der oben geschilderten Versuchsergebnisse ließ sich dieses Resultat mit der geringeren Nukleaseaktivität bei SLE Patienten begründen, was bereits aus der Literatur bekannt ist. Diese reduzierte Nukleaseaktivität stellt somit offensichtlich einen entscheidenden Faktor bei der Aktivierung einer Autoimmunantwort in Zusammenhang mit dem La Protein und anti-La Autoantikörpern dar. Mit dieser Arbeit konnte also eindeutig gezeigt werden, dass das La Protein unter sich wechselnden Redoxbedingungen seine Struktur ändert. Dabei spielen die drei enthaltenden Cysteine eine bedeutende Rolle. Derartige Strukturveränderungen beeinflussen die Nukleinsäureschutzfunktion und die Erkennung durch Antikörper. Darüber hinaus bestätigte sich eine ROS induzierte Anreicherung von La im Zytoplasma. Auch die Fähigkeit des La Proteins, aus nekrotischem Zellmaterial auf die Oberflächen von lebenden Zellen zu binden, wurde gezeigt. Dadurch wäre es für Autoantikörper bei SLE Patienten zugänglich und somit pathophysiologisch relevant. Außerdem konnte auch die Eigenschaft von nukleinsäurege-koppelten La Proteins zur Aktivierung dendritischer Zellen belegt werden, was zur krankheitsauslösenden Aktivierung von autoreaktiven T- und im weiteren Verlauf von B-Zellen führen kann. Dadurch konnten die in dieser Arbeit erhaltenen Resultate deutliche Hinweise auf die pathophysiologische Bedeutung des La Proteins, nicht nur während der Autoimmunerkrankung, sondern auch für die Frühphase der Krankheitsentstehung, geben.

Kürzlich wurden bei immunvermittelten Neuropathien Autoantikörper gegen Proteine des paranodalen axoglialen Komplexes beschrieben. Deren Charakteristika, Prävalenzen, pathophysiologische Relevanz sowie Bedeutung für Diagnostik und Therapie sind jedoch noch nicht abschließend erforscht. In dieser Studie wurden daher Seren und Plasmapheresematerial (PE-Material) von 150 Patienten mit inflammatorischen Neuropathien, nämlich 105 mit chronisch inflammatorischer demyelinisierender Polyneuropathie (CIDP), 21 mit Guillain- Barré-Syndrom (GBS) und 24 mit multifokaler motorischer Neuropathie (MMN), welche etablierte diagnostische Kriterien der jeweiligen Krankheit erfüllen, sowie 74 Kontrollen mittels immunhistochemischen Färbungen an murinen Zupfnervenpräparaten und/oder ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) auf Autoantikörper gegen die paranodalen Proteine Caspr, Contactin-1 und Neurofascin- 155 untersucht. Bei positivem Ergebnis wurde deren Spezifität mittels immunhistochemischen Färbungen an transfizierten HEK (Human embryonic kidney)- 293-Zellen und Präinkubationsversuchen bestätigt. Es wurden die IgG-Subklassen und die Antikörpertiter bestimmt und das Komplementbindungsverhalten unter Zugabe von intravenösen Immunglobulinen (IVIG) mit zellbasierten und ELISA-basierten Methoden analysiert. Klinische Merkmale und das Therapieansprechen Antikörper-positiver Patienten wurden ermittelt und mit den experimentellen Ergebnissen in Zusammenhang gesetzt. IgG-Autoantikörper gegen Contactin-1 konnten bei vier Patienten mit CIDP nachgewiesen werden, IgG-Autoantikörper gegen Caspr bei einem Patienten mit CIDP und einer Patientin mit GBS. Es konnten keine weiteren Autoantikörper bei CIDP-Patienten, GBS-Patienten, MMN-Patienten oder bei den Kontrollen detektiert werden. Die Prävalenz von Autoantikörpern gegen axogliale paranodale Proteine liegt somit in dieser Studie bei jeweils 4,76% bei CIDP und GBS und 0% bei MMN. Die Antikörper gehörten bei Patienten in der akuten Erkrankungsphase (zwei der CIDP-Patienten mit Anti-Contactin-1-Autoantikörpern und eine GBS-Patientin mit Anti-Caspr-Autoantikörpern) hauptsächlich den Subklassen IgG1 und IgG3 an, bei Patienten in der chronischen Phase (zwei der CIDP-Patienten mit Anti-Contactin-1-Autoantikörpern, ein CIDP-Patient mit Anti-Caspr-Autoantikörpern) überwog die Subklasse IgG4. Experimentell kam es zur Komplementbindung und -aktivierung abhängig vom Gehalt der Subklassen IgG1-3, nicht aber IgG4; diese konnte durch die Zugabe von IVIG dosisabhängig gemindert werden. Alle Autoantikörper-positiven CIDP-Patienten zeigten einen GBS-artigen Beginn mit einer schweren motorischen Beteiligung. Anti-Contactin-1-positive Patienten kennzeichnete klinisch zusätzlich das Vorkommen einer Ataxie und eines Tremors, Anti-Caspr-positive Patienten das Vorkommen starker neuropathischer Schmerzen. Elektrophysiologisch standen neben Hinweisen auf eine Leitungsstörung Zeichen einer axonalen Schädigung im Vordergrund. Als histopathologisches Korrelat lagen eine nodale Architekturstörung und ein Axonverlust vor. Die Patienten zeigten nur in der Anfangsphase der Erkrankung ein Ansprechen auf IVIG. Bei drei CIDP-Patienten mit IgG4-Autoantikörpern (zwei Patienten mit Anti-Contactin-1-Antikörpern und ein Patient mit Anti-Caspr-Antikörpern) wurde eine Therapie mit Rituximab durchgeführt. Diese führte zu einer Titerreduktion und zur zeitgleichen klinischen und elektrophysiologischen Befundbesserung bei zwei Patienten. Die in dieser Arbeit angewandten Screeningmethoden führten zum erfolgreichen Nachweis von Autoantikörpern gegen paranodale axogliale Proteine. Die Patienten mit positivem Autoantikörpernachweis definieren eine kleine Untergruppe mit ähnlichen klinischen Merkmalen im Kollektiv der Patienten mit inflammatorischen Polyneuropathien. Histopathologische Merkmale sowie das Therapieansprechen auf antikörperdepletierende Therapie sprechen in Kombination mit den Ergebnissen weiterer Studien zu paranodalen Autoantikörpern für eine pathogenetische Relevanz der Autoantikörper. Mit einem charakteristischen, am Schnürring ansetzenden Pathomechanismus könnten Neuropathien mit Nachweis von paranodalen Autoantikörpern der kürzlich eingeführten Entität der Nodo-Paranodopathien angehören. Die Komplementaktivierung und das Therapieansprechen der Patienten auf IVIG stehen möglicherweise in Zusammenhang mit der prädominanten IgG-Subklasse. Diese könnte auch in Bezug auf die Chronifizierung eine Rolle spielen. Der Nachweis von Autoantikörpern gegen paranodale Proteine hat wohlmöglich in Zukunft direkte Konsequenzen auf das diagnostische und therapeutische Prozedere bei Patienten mit CIDP und GBS; weitere klinische und experimentelle Daten aus größeren, prospektiven Studien sind jedoch zum weiteren Verständnis und zur Charakterisierung dieser Entität notwendig. / Autoantibodies against proteins of the paranodal axoglial complex have been described in recent studies on immune-mediated neuropathies. Nevertheless, their characteristics, prevalences, pathophysiological relevance and impact on diagnostics and therapy have not been fully investigated. Therefore, sera and plasmapheresis material (PE-material) of 150 patients with inflammatory neuropathy, including 105 patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP), 21 patients with Guillain-Barré-Syndrome (GBS) and 24 patients with multifocal motor neuropathy (MMN), fulfilling established diagnostic criteria for the respective disease, as well as 74 controls were screened for autoantibodies against the paranodal proteins caspr, contactin-1 and neurofascin-155 via immunohistochemic staining of murine teased fiber preparations and/or ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). In the event of a positive result, their specificity was confirmed via immunohistochemic staining on transfected HEK (human embryonic kidney)-293-cells and preincubation experiments. IgG subclasses and antibody titers in human material were analysed and complement binding to the autoantibodies, also under the influence of therapeutic immunoglobulins (IVIG), was investigated in cell based assays and ELISA based assays. Clinical features and therapy response in antibody-positive patients were evaluated and compared to the experimental results. IgG-autoantibodies against contactin-1 were found in four patients with CIDP, IgG-autoantibodies against caspr were found in one patient with CIDP and one with GBS. No further autoantibodies were detected neither in patients with CIDP, GBS and MMN nor in the controls. The prevalences of autoantibodies against axoglial paranodal proteins in this study therefore are at 4,76% in CIDP and GBS and 0% in MMN. In the acute phase of the disease, autoantibodies of the IgG1 and IgG3 subclass could be detected (in two CIDP patients with anti-contactin-1 antibodies and one GBS patient with anti-caspr antibodies), whereas patients in the chronic phase of the disease showed IgG4-autoantibodies (two CIDP patients with anti-contactin-1 antibodies and one CIDP patient with anti-caspr antibodies). Complement binding and activation in vitro depended on the amount of the IgG subclasses IgG1-IgG3, but not IgG4. Complement binding could be reduced by IVIG dose-dependently. All CIDP-patients with autoantibodies showed a GBSlike onset with severe motor involvement. Additional features of anti-contactin-1 positive neuropathy were ataxia and tremor, of anti-caspr positive disease neuropathic pain. Electrophysiological studies revealed signs of conduction failure accompanied by striking signs of axonal damage. As a histopathologic correlate, a disruption of the nodal architecture and axonal loss were found. Patients only responded well to IVIG in the beginning of the disease. Three patients with autoantibodies of the IgG4 subclass (two patients with anti-contactin-1 and one patient with anti-caspr) were treated with rituximab, leading to a titer reduction accompanied by clinical and electrophysiological improvement in two patients. The screening methods used in this study are suitable for the detection of autoantibodies against paranodal proteins. Antibody-positive patients define a small subgroup of patients with inflammatory polyneuropathy that is characterized by distinct clinical features. Histopathological findings and therapy response to antibody- depleting treatment in this study as well as findings of further studies argue in favour of a pathogenetic relevance of the autoantibodies. Neuropathies associated with paranodal autoantibodies could belong to the new entity of nodo-paranodopathies, sharing a characteristic pathomechanism with the node of Ranvier being the site of attack. Complement binding and activation as well as response to IVIG could be related to the predominant IgG subclass of the autoantibodies. It could also influence the course and chronification of the disease. Therefore, detection of autoantibodies against paranodal proteins might have a direct impact on diagnostic and therapeutic strategies in patients with CIDP and GBS in the future. Nevertheless, further clinical and experimental data, including data from bigger and prospective studies are needed to understand and fully characterize this novel entity.

Objective: Type 1 diabetes is associated with autoantibodies to different organs that include the gut. The objective of the study was to determine the risk of developing gastric parietal cell autoimmunity in relation to other autoimmunity in individuals with a family history of type 1 diabetes. Methods: Autoantibodies to the parietal cell autoantigen, H+/K+ ATPase subunit A (ATP4A) was measured in 2218 first-degree relatives of patients with type 1 diabetes, who were prospectively followed from birth for a median of 14.5 years. All were also tested regularly for the development of islet autoantibodies, transglutaminase autoantibodies, and thyroid peroxidase autoantibodies. Results: The cumulative risk to develop ATP4A autoantibodies was 8.1% (95% CI, 6.6–9.6) by age 20 years with a maximum incidence observed at age 2 years. Risk was increased in females (HR, 1.9; 95% CI, 1.3–2.8; p = 0.0004), relatives with the HLA DR4-DQ8/DR4-DQ8 genotype (HR, 3.4; 95% CI, 1.9–5.9; p < 0.0001) and in participants who also had thyroid peroxidase autoantibodies (HR, 3.7; 95% CI, 2.5– 5.5; p < 0.0001). Risk for at least one of ATP4A-, islet-, transglutaminase-, or thyroid peroxidase-autoantibodies was 24.7% (95% CI, 22.6–26.7) by age 20 years and was 47.3% (95% CI, 41.3–53.3) in relatives who had an HLA DR3/DR4-DQ8, DR4-DQ8/ DR4-DQ8, or DR3/DR3 genotype (p < 0.0001 vs. other genotypes). Conclusions: Relatives of patients with type 1 diabetes who have risk genotypes are at very high risk for the development of autoimmunity against gastric and other organs.

Das La-Protein wurde als Autoantigen bei Autoimmunpatienten, die an SLE oder Sjögren-Syndrom erkrankt sind, entdeckt. Es kommt in phosphorylierter Form im Zellkern aller Eukaryonten vor und nimmt Aufgaben bei der Faltung, Prozessierung und nukleären Retention von RNA-Polymerase III-Transkripten wahr. Unter normalen zellulären Bedingungen ist das La-Protein außerdem in der Lage, zwischen Zellkern und Zytoplasma zu pendeln. Bei Zellstress, der nach UV-Exposition oder während einer viralen Infektion entsteht, wird das Protein verstärkt im Zytoplasma beobachtet, wo es an der Cap-unabhängigen Translation zellulärer und ggf. viraler Proteine beteiligt ist. Wird in der Zelle daraufhin Apoptose induziert, so ist das La-Protein auf der Zellmembran bzw. in apoptotischen Körperchen nachweisbar. Ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit war die Untersuchung verschiedener monoklonaler anti-La-Antikörper. Einige wenige konnten durch wiederholte Immunisierung von Mäusen mit rhLa-Protein generiert werden. Im Gegensatz dazu resultierte die einmalige Übertragung von gegen das hLa-Protein aktivierten CD4+ T-Zellen auf eine hLaTg-Maus in der Gewinnung mehrerer La-spezifischer Antikörper. Die Sequenzanalyse der Gene, die für die variablen Antikörperdomänen codieren, bestätigte, dass es sich um individuell rekombinierte und hypermutierte Immunglobuline handelt. Die Antikörper zeichneten sich außerdem durch unterschiedliche Eigenschaften bei der Bindung von humanem und murinem La-Protein in der Immunfluoreszenz, im Immunoblot oder während der Immunpräzipitation aus. Für die IgG-Antikörper konnten die Epitopbereiche innerhalb des La-Proteins eingegrenzt werden. Auffällig waren die kurzen linearen Peptidepitope, die von den auf konventionelle Art erzeugten Antikörpern gebunden wurden. Hingegen erkannten alle Antikörper, die aus dem adoptiven T-Zell-Transfer hervorgegangen waren, Konformationsepitope. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass einige mAks aber auch anti-La-Patientenseren die reduzierte von der oxidierten Form des La-Proteins unterscheiden können. Unerwartet ist die Erkenntnis, dass sich offensichtlich zahlreiche B-Zellen mit anti-La-Spezifität von wenigen variablen Ketten ableiten und dass diese bei einer herkömmlichen Immunisierung entweder nicht aktiviert werden (und deshalb nicht in der Milz zu finden sind) oder sogar eliminiert werden. Der Import des La-Proteins in den Zellkern wird durch die klassischen Transportmoleküle Karyopherin-α und Karyopherin–β vermittelt. Für den Shuttlingprozess muss das Protein auch wieder aus dem Kern exportiert werden. Da es kontroverse Daten bezüglich eines Crm1-abhängigen Kernexports gab, wurde das Shuttlingverhalten von GFP-La-Fusionsproteinen in dieser Arbeit genauer analysiert. Mit Hilfe von Heterokaryonexperimenten konnte bestätigt werden, dass sowohl das hLa- als auch das mLa-Protein zwischen humanen und murinen Zellkernen pendeln kann und dass der Export unabhängig von Crm1 stattfindet. Aufgrund der kurzen Verweildauer im Zytoplasma schienen die Proteine quantitativ im Zellkern vorzuliegen, doch ein Teil konnte stets in den im Heterokaryon enthaltenen Nachbarzellkernen detektiert werden. Die Verwendung von N-terminal deletierten La-Fragmenten, die alle über das C-terminale NLS verfügten, gab Aufschluss über die Regulation des Shuttlings. Es zeigte sich, dass die Menge des exportierten Proteins von einem nukleären Retentionspartner festgelegt wird, der das La-Protein bindet und dadurch im Zellkern festhält. Wird diese Assoziation aufgehoben, gelangt das La-Protein in das Zytoplasma. Dort ist es allerdings nicht detektierbar, da das NLS einen umgehenden Import zurück in den Zellkern hervorruft. Zusätzlich wurde die Auswirkung von zellulärem Stress (z. B. durch ROS) auf die intrazelluläre Lokalisation des Proteins untersucht. Unter oxidativen zellulären Bedingungen wird einerseits die Wechselwirkung mit dem nukleären Retentionspartner aufgehoben und andererseits findet kein Kernimport über Karyopherin-α mehr statt. Aus diesem Grund reichert sich das La-Protein nun verstärkt im Zytoplasma an. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass das La-Protein von apoptotischen Zellen freigesetzt wird und daraufhin auf die Membran von Nachbarzellen binden kann. Die Bindungs-eigenschaften wurden mit rhLa-Protein genauer untersucht. Das La-Protein war auf Endothel- und Epithelzellen nachweisbar und die Bindung fand sowohl bei Inkubation auf Eis als auch bei 37 °C statt. Da das La-Protein auch über DNA-Bindungseigenschaften verfügt, war es in der Lage, DNA auf der Zelloberfläche zu immobilisieren. Innerhalb von PBMCs wurde es selektiv auf Antigen-präsentierenden Zellen nachgewiesen. Diese Eigenschaften lassen eine Beteiligung des Proteins bei der Induktion von anti-dsDNA-Antikörpern in Autoimmunpatienten vermuten. Es ist bekannt, dass die Bedingungen (Virusinfektion, UV-Exposition), die zur Translokation des La-Proteins auf die Zelloberfläche führen, bei SLE-Patienten Krankheitsschübe auslösen können. Bisher wurden anti-La-Autoantikörper aber eher nicht als pathophysiologisch erachtet, da sie bei der Bindung an bereits apoptotische Zellen keine weiteren Schäden verursachen können. Jedoch wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das La-Protein apoptotischer Zellen auf der Oberfläche von lebenden Zellen in der Umgebung nachgewiesen werden kann. Daran könnten anti-La-Autoantikörper binden und eine Komplement- oder NK-Zell-vermittelte Zerstörung der Nachbarzellen hervorrufen. Dadurch entstehen zusätzliche Gewebeschäden. Im Chromfreisetzungstest waren NK-Zellen tatsächlich in der Lage, La-dekorierte Zielzellen Antikörper-abhängig zu lysieren, sofern zusätzliche in vitro Stimuli präsent waren, die z. B. eine virale Infektion simulierten. Die Immuntherapie von Tumoren ist auf bestimmte Zielstrukturen auf den Tumorzellen angewiesen, über welche die Wirkstoffe spezifisch zu den maligne transformierten Zellen gebracht werden. Die Therapeutika, die sich oft von mAks gegen diese Zielstrukturen ableiten, müssen für verschiedene Tumorarten individuell entwickelt werden. Da das La-Protein von apoptotischen Zellen freigesetzt wird und auf die Membran benachbarter (bestrahlungsresistenter) Zellen binden kann, ist es in Kombination mit einer vorangegangenen Bestrahlung als universelle Zielstruktur für die Immuntherapie nutzbar. Aus diesem Grund wurde unter Verwendung eines ausführlich in dieser Arbeit charakterisierten anti-La-Antikörpers ein rekombinantes bispezifisches Antikörperderivat entwickelt. Es ist in der Lage, das La-Protein auf der Oberfläche von Tumorzellen zu binden und auf diesen zytotoxische T-Lymphozyten zu immobilisieren. Durch die Quervernetzung werden die T-Lymphozyten aktiviert und induzieren in den Zielzellen Apoptose. Das neue Antikörperderivat verspricht eine vielseitige Anwendung in Kombination mit Strahlentherapie oder auch mit rekombinanten Antikörpermolekülen, die gegen spezifische Zielstrukturen auf den Tumorzellen gerichtet sind.

Das La-Protein wurde als Autoantigen bei Autoimmunpatienten, die an SLE oder Sjögren-Syndrom erkrankt sind, entdeckt. Es kommt in phosphorylierter Form im Zellkern aller Eukaryonten vor und nimmt Aufgaben bei der Faltung, Prozessierung und nukleären Retention von RNA-Polymerase III-Transkripten wahr. Unter normalen zellulären Bedingungen ist das La-Protein außerdem in der Lage, zwischen Zellkern und Zytoplasma zu pendeln. Bei Zellstress, der nach UV-Exposition oder während einer viralen Infektion entsteht, wird das Protein verstärkt im Zytoplasma beobachtet, wo es an der Cap-unabhängigen Translation zellulärer und ggf. viraler Proteine beteiligt ist. Wird in der Zelle daraufhin Apoptose induziert, so ist das La-Protein auf der Zellmembran bzw. in apoptotischen Körperchen nachweisbar. Ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit war die Untersuchung verschiedener monoklonaler anti-La-Antikörper. Einige wenige konnten durch wiederholte Immunisierung von Mäusen mit rhLa-Protein generiert werden. Im Gegensatz dazu resultierte die einmalige Übertragung von gegen das hLa-Protein aktivierten CD4+ T-Zellen auf eine hLaTg-Maus in der Gewinnung mehrerer La-spezifischer Antikörper. Die Sequenzanalyse der Gene, die für die variablen Antikörperdomänen codieren, bestätigte, dass es sich um individuell rekombinierte und hypermutierte Immunglobuline handelt. Die Antikörper zeichneten sich außerdem durch unterschiedliche Eigenschaften bei der Bindung von humanem und murinem La-Protein in der Immunfluoreszenz, im Immunoblot oder während der Immunpräzipitation aus. Für die IgG-Antikörper konnten die Epitopbereiche innerhalb des La-Proteins eingegrenzt werden. Auffällig waren die kurzen linearen Peptidepitope, die von den auf konventionelle Art erzeugten Antikörpern gebunden wurden. Hingegen erkannten alle Antikörper, die aus dem adoptiven T-Zell-Transfer hervorgegangen waren, Konformationsepitope. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass einige mAks aber auch anti-La-Patientenseren die reduzierte von der oxidierten Form des La-Proteins unterscheiden können. Unerwartet ist die Erkenntnis, dass sich offensichtlich zahlreiche B-Zellen mit anti-La-Spezifität von wenigen variablen Ketten ableiten und dass diese bei einer herkömmlichen Immunisierung entweder nicht aktiviert werden (und deshalb nicht in der Milz zu finden sind) oder sogar eliminiert werden. Der Import des La-Proteins in den Zellkern wird durch die klassischen Transportmoleküle Karyopherin-α und Karyopherin–β vermittelt. Für den Shuttlingprozess muss das Protein auch wieder aus dem Kern exportiert werden. Da es kontroverse Daten bezüglich eines Crm1-abhängigen Kernexports gab, wurde das Shuttlingverhalten von GFP-La-Fusionsproteinen in dieser Arbeit genauer analysiert. Mit Hilfe von Heterokaryonexperimenten konnte bestätigt werden, dass sowohl das hLa- als auch das mLa-Protein zwischen humanen und murinen Zellkernen pendeln kann und dass der Export unabhängig von Crm1 stattfindet. Aufgrund der kurzen Verweildauer im Zytoplasma schienen die Proteine quantitativ im Zellkern vorzuliegen, doch ein Teil konnte stets in den im Heterokaryon enthaltenen Nachbarzellkernen detektiert werden. Die Verwendung von N-terminal deletierten La-Fragmenten, die alle über das C-terminale NLS verfügten, gab Aufschluss über die Regulation des Shuttlings. Es zeigte sich, dass die Menge des exportierten Proteins von einem nukleären Retentionspartner festgelegt wird, der das La-Protein bindet und dadurch im Zellkern festhält. Wird diese Assoziation aufgehoben, gelangt das La-Protein in das Zytoplasma. Dort ist es allerdings nicht detektierbar, da das NLS einen umgehenden Import zurück in den Zellkern hervorruft. Zusätzlich wurde die Auswirkung von zellulärem Stress (z. B. durch ROS) auf die intrazelluläre Lokalisation des Proteins untersucht. Unter oxidativen zellulären Bedingungen wird einerseits die Wechselwirkung mit dem nukleären Retentionspartner aufgehoben und andererseits findet kein Kernimport über Karyopherin-α mehr statt. Aus diesem Grund reichert sich das La-Protein nun verstärkt im Zytoplasma an. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass das La-Protein von apoptotischen Zellen freigesetzt wird und daraufhin auf die Membran von Nachbarzellen binden kann. Die Bindungs-eigenschaften wurden mit rhLa-Protein genauer untersucht. Das La-Protein war auf Endothel- und Epithelzellen nachweisbar und die Bindung fand sowohl bei Inkubation auf Eis als auch bei 37 °C statt. Da das La-Protein auch über DNA-Bindungseigenschaften verfügt, war es in der Lage, DNA auf der Zelloberfläche zu immobilisieren. Innerhalb von PBMCs wurde es selektiv auf Antigen-präsentierenden Zellen nachgewiesen. Diese Eigenschaften lassen eine Beteiligung des Proteins bei der Induktion von anti-dsDNA-Antikörpern in Autoimmunpatienten vermuten. Es ist bekannt, dass die Bedingungen (Virusinfektion, UV-Exposition), die zur Translokation des La-Proteins auf die Zelloberfläche führen, bei SLE-Patienten Krankheitsschübe auslösen können. Bisher wurden anti-La-Autoantikörper aber eher nicht als pathophysiologisch erachtet, da sie bei der Bindung an bereits apoptotische Zellen keine weiteren Schäden verursachen können. Jedoch wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das La-Protein apoptotischer Zellen auf der Oberfläche von lebenden Zellen in der Umgebung nachgewiesen werden kann. Daran könnten anti-La-Autoantikörper binden und eine Komplement- oder NK-Zell-vermittelte Zerstörung der Nachbarzellen hervorrufen. Dadurch entstehen zusätzliche Gewebeschäden. Im Chromfreisetzungstest waren NK-Zellen tatsächlich in der Lage, La-dekorierte Zielzellen Antikörper-abhängig zu lysieren, sofern zusätzliche in vitro Stimuli präsent waren, die z. B. eine virale Infektion simulierten. Die Immuntherapie von Tumoren ist auf bestimmte Zielstrukturen auf den Tumorzellen angewiesen, über welche die Wirkstoffe spezifisch zu den maligne transformierten Zellen gebracht werden. Die Therapeutika, die sich oft von mAks gegen diese Zielstrukturen ableiten, müssen für verschiedene Tumorarten individuell entwickelt werden. Da das La-Protein von apoptotischen Zellen freigesetzt wird und auf die Membran benachbarter (bestrahlungsresistenter) Zellen binden kann, ist es in Kombination mit einer vorangegangenen Bestrahlung als universelle Zielstruktur für die Immuntherapie nutzbar. Aus diesem Grund wurde unter Verwendung eines ausführlich in dieser Arbeit charakterisierten anti-La-Antikörpers ein rekombinantes bispezifisches Antikörperderivat entwickelt. Es ist in der Lage, das La-Protein auf der Oberfläche von Tumorzellen zu binden und auf diesen zytotoxische T-Lymphozyten zu immobilisieren. Durch die Quervernetzung werden die T-Lymphozyten aktiviert und induzieren in den Zielzellen Apoptose. Das neue Antikörperderivat verspricht eine vielseitige Anwendung in Kombination mit Strahlentherapie oder auch mit rekombinanten Antikörpermolekülen, die gegen spezifische Zielstrukturen auf den Tumorzellen gerichtet sind.

The second meeting for the International Consensus on Antinuclear antibody (ANA) Pattern (ICAP) was held on 22 September 2015, one day prior to the opening of the 12th Dresden Symposium on Autoantibodies in Dresden, Germany. The ultimate goal of ICAP is to promote harmonization and understanding of autoantibody nomenclature, and thereby optimizing ANA usage in patient care. The newly developed ICAP website www.ANApatterns.org was introduced to the more than 50 participants. This was followed by several presentations and discussions focusing on key issues including the two-tier classification of ANA patterns into competent-level versus expert-level, the consideration of how to report composite versus mixed ANA patterns, and the necessity for developing a consensus on how ANA results should be reported. The need to establish on-line training modules to help users gain competency in identifying ANA patterns was discussed as a future addition to the website. To advance the ICAP goal of promoting wider international participation, it was agreed that there should be a consolidated plan to translate consensus documents into other languages by recruiting help from members of the respective communities.

Testing for autoantibodies (AABs) is becoming more and more relevant, not only for diagnosing autoimmune diseases (AIDs) but also for the differentiation of defined AID subtypes with different clinical manifestations, course and prognosis as well as the very early diagnosis for adequate management in the context of personalized medicine. A major challenge to improve diagnostic accuracy is to harmonize or even standardize AAB analyses. This review presents the results of the 12th Dresden Symposium on Autoantibodies that focused on several aspects of improving autoimmune diagnostics. Topics that are addressed include the International Consensus on ANA Patterns (ICAP) and the International Autoantibody Standardization (IAS) initiatives, the optimization of diagnostic algorithms, the description and evaluation of novel disease-specific AABs as well as the development and introduction of novel assays into routine diagnostics. This review also highlights important developments of recent years, most notably the improvement in diagnosing and predicting the course of rheumatoid arthritis, systemic sclerosis, idiopathic inflammatory myopathies, and of autoimmune neurological, gastrointestinal and liver diseases; the potential diagnostic role of anti-DFS70 antibodies and tumor-associated AABs. Furthermore, some hot topics in autoimmunity regarding disease pathogenesis and management are described.

Für die dilatative Kardiomyopathie gibt es bisher keine kausalen Therapiemöglichkeiten. Verschiedene kardiale Autoantikörper sind an der Pathogenese der Erkrankung beteiligt. Diese können durch eine Immunadsorptionsbehandlung entfernt werden. Das Ziel dieser Studie war es, die hämodynamischen Effekte einer Immunadsorption mit nachfolgender Immunglobulin-G-Substitution zu untersuchen. Dazu wurden 18 Patienten (NYHA III-IV, linksventrikuläre Ejektionsfraktion < 30 %) eingeschlossen und zufällig der Behandlungs- oder Kontrollgruppe zugeteilt. An drei aufeinanderfolgenden Tagen erfolgte eine Immunadsorptionsbehandlung. Abschließend wurde polyklonales Immunglobulin-G substituiert. Die Behandlung wurde insgesamt viermal in monatlichen Abständen durchgeführt. Die hämodynamischen Messungen erfolgten mit Hilfe eines Swan-Ganz Thermodilutionskatheters. Nach drei Monaten waren der Herzindex und der Schlagvolumenindex in der Behandlungsgruppe signifikant angestiegen. Der systemvaskuläre Widerstand wurde signifikant gesenkt. Außerdem wurde ein Anstieg der echokardiographischen linksventrikulären Ejektionsfraktion sowie eine Reduktion des linksventrikulären endsystolischen und enddiastolischen Durchmesser Index beobachtet. Die echokardiographischen Veränderungen waren auch im Verlauf nach einem halben Jahr stabil nachweisbar. Die günstige Beeinflussung der hämodynamischen Parameter wurde zudem von einer Verbesserung der klinischen Beschwerdesymptomatik - repräsentiert durch die Einteilung nach der NYHA-Klassifikation - begleitet. Hingegen wurden in der Kontrollgruppe für alle genannten Parameter keine signifikanten Veränderungen beobachtet. Die Effekte der Immunadsorption werden hauptsächlich auf die Elimination der Autoantikörpern zurückgeführt, wenngleich andere Einflüsse - wie ein Einfluss der Immunglobulinsubstitution oder anderer immunmodulatorischer Komponenten - nicht ganz ausgeschlossen werden können. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass Immunadsorptionsbehandlungen bei dilatativer Kardiomyopathie als Ergänzung zur medikamentösen Basistherapie zur Verbesserung der Herzfunktion und zur Linderung der Beschwerdesymptomatik beitragen. / There is no causal therapy for the treatment of dilated cardiomyopathy. Various cardiac antibodies have been detected. These antibodies are extractable by immunoadsorption. The aim of the study was to assess the hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin G substitution. 18 patients with dilated cardiomyopathy (New York Heart Association III-IV, left ventricular ejection fraction < 30%) were randomly assigned either to the treatment group or to the control group. The patients were treated by immunoadsorption on three consecutive days. After the final session polyclonal immunoglobulin G was substituted. The procedure was repeated four times at one-month intervals. Hemodynamic mesurements were made by Swan-Ganz-catheterization. After three months cardiac index and stroke volume index increased significantly. Systemic vascular resistence decreased. Although, the echocardiographic ejection fraction increased, while there was a reduction of the left ventricular endsystolic and enddiastolic diameter index. The echocardiographic changes persisted after six months. The hemodynamic changes were accompanied by an improvement regarding the New York Heart Association classes in the treatment group. In contrast, all parameters did not change throughout the six months in the control group. Presumably the hemodynamic effects result from elimimation of cardiac antibodies. Although there may be an influence of different immunmodulatory components or of the immunoglobulin G substitution, too. In conclusion, Immunoadsorption and subsequent immunoglobulin G substitution improves cardiovascular function in addition to conventional drug therapy.

HINTERGRUND: Das Ziel dieser Studie bestand darin, die mögliche Rolle von zirkulierenden humanen Monozyten in der Pathologie der essentiellen Hypertonie zu untersuchen. Wir verglichen die Expressionsmuster unterschiedlicher Adhäsionsmoleküle auf isolierten Monozyten des peripheren Blutes von Normalkontrollen und Hypertonikern. Wir bestimmten die Veränderungen durch Stimulation mit Lipopolysaccharide (LPS), Angiotensin II (AT) und agonistische Angiotensin Rezeptor Typ I-Autoantikörper (AT1-AK) sowie den Einfuß des AT1-Rezeptor-Antagonist Losartan und des auch an MAC-1 bindenden Glykoprotein IIb/IIIa Rezeptor-Antikörper Abciximab. METHODIK: Blutproben von 18 Patienten mit essentieller Hypertonie und 20 gesunden Normalkontrollen wurden verglichen. Die Monozyten wurden mittels Dynabead-Negativ-Isolierung gewonnen. Die Adhäsionsmolekül-Expression wurden nach Färbung mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gegen CD11a, CD11b, CD29, CD31, CD44, CD49d, CD54 und CD62L mittels FACS Messung bestimmt. ERGEBNISSE: Auf Monozyten hypertensiver Patienten ist die Expression von CD11a, CD11b und CD54 signifikant erhöht. Mit Inkubation erhöht sich die Expression von CD54 und CD44, während CD11b, CD31 und CD49d erniedrigt werden und CD11a konstant bleibt. LPS-Stimulation führt zu einer signifikanten Erhöhung der CD11b und CD54 Expression. Ausdruck der Aktivierung durch AT-Stimulation ist eine erhöhte CD11b Expression. AT1-AK erhöhen die Expression von CD11b, CD54 und CD49d signifikant. Losartan verringert nur tendenziell und teilweise die AT und AT1-AK bedingten Expressionsveränderungen. Der LPS bedingte Anstieg der CD11b Expression auf Monozyten wird durch Abciximab vermindert. SCHLUSSFOLGERUNG: Wir demonstrieren die Bedeutung voraktivierten Monozyten bei Hypertonie in der Pathogenese der Arteriosklerose. / BACKGROUND: The purpose of this study was to investigate the possible involvement of human peripheral blood monocytes in the pathology of hypertensive disease. We determined the in vitro expression patterns of adhesion molecules on isolated peripheral blood monocytes from normal controls and from hypertensive patients. We investigated and compared the ability of lipopolysaccharide (LPS), angiotensin II (Ang II) and Agonistic AT1 receptor autoantibodies (AT1-AA) to stimulate monocytes and the influence of preincubation with an Ang II type 1 receptor antagonist (losartan) or Glykoprotein IIb/IIIa rezeptor-antibody Abciximab. METHODS: Blood samples were obtained from 18 patients with essential hypertension and from 20 normotensive healthy individuals used as a control group. Peripheral blood monocytes were isolated by negative Dyna Bead Isolation. Adhesion molecules were measured using immunofluorescence of monocytes labelled with antibody against CD11a and b, CD29, CD31, CD44, CD49d, CD54 and CD62L by flow cytometry. RESULTS: The expression of CD11a, CD11b and CD54 was significantly higher in hypertensive patients versus healthy individuals directly after isolation. With incubation the expression of CD44 and CD54 was increased and the expression of CD 11b, CD31 and CD49d was decreased, whereas CD11a shows a constant expression. Monocytes showed increased expression of CD11b and CD54 after LPS stimulation. CD11b expression was significantly increased after stimulation with Ang II, after stimulation with AT1-AA Monocytes showed an increased expression of CD11b, CD54 and CD49. Losartan was partially but not significantly effective in blocking the effects of Ang II or AT1-AA stimulation. Incubation with Abciximab was reducing the LPS induced CD11b Epression. CONCLUSIONS: These data indicate that preactivated monocytes from hypertensives may be of pathogenic importance in atherosclerosis.

Die Knochenregeneration während der Frakturheilung beinhaltet das Zusammenspiel von Wachstumsfaktoren. In einigen Patienten kommt es zu einer verzögerten oder unvollständigen Heilung. Die Gründe hierfür sind bisher nicht komplett verstanden. Neutralisierende Autoantikörper (aAB) gegen Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren könnten den Heilungsprozess verzögern und potentiell beeinträchtigen In dieser Arbeit wurden 265 Frakturpatienten analysiert. Autoantikörper gegen IGF1 Rezeptor, Insulin Rezeptor, BMP7, BMP2, IGF1 und (Pro)Insulin wurden in den Seren dieser Frakturpatienten gemessen. In Frakturpatienten wurden in 5% der Seren aAB gegen den IGF1R und in 6% gegen den IR gefunden. Das Auftreten von IGF1R- und IR-aAB wurde nicht induziert und war nicht mit dem Heilungsergebnis assoziiert. BMP7-aAB wurden in 1-2,5% gesunder Probanden und Frakturpatienten, die nicht mit rhBMP7 behandelt wurden, detektiert. Patienten, die mit rhBMP7 behandelt wurden, zeigten ein höheres Auftreten der BMP7-aAB Positivität mit 6% zum Zeitpunkt der Operation und 18% vier Wochen nach der Operation. BMP2-aAB wurden in 2% der gesunden Kontrollen und 6% der mit rhBMP7-behandelten Frakturpatienten entdeckt. Bei der Charakterisierung des biologischen Effekts der BMP7-aAB durch einen zell-basierten Reporter-Assay, zeigte sich ein neutralisierender Effekt in Proben mit hohem BMP7-aAB Titer. Als das wichtigste Kriterium für klinische Relevanz wurde die Konsolidierung untersucht. Das Vorhandensein von BMP-aAB wurde nicht signifikant mit der Konsolidierung in Zusammenhang gebracht. Zusammenfassend wurden neue diagnostische Assays zur Detektion von aAB gegen Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren generiert und angewandt um aAB in Seren von Frakturpatienten zu messen. Keiner der identifizierten aAB war negativ mit dem Heilungsprozess assoziiert. Bedenken bezüglich der Sicherheit von rhBMP7 Behandlungen sind berechtigt, da die Anwendung aAB gegen BMP7 induziert, die den BMP7-Signalweg blockieren. / Regeneration of bone during fracture healing includes concerted actions of growth factors. Some fractures show delayed healing or non-union due to as yet unknown reasons. Neutralizing autoantibodies (aAB) against growth factors or their receptors might influence and potentially impair the bone healing capacity. In this study, a cohort of 265 fracture patients with different treatment regimen and healing outcomes were analysed. Autoantibodies against IGF1 receptor, insulin receptor, BMP7, BMP2, IGF1 and (pro)insulin were measured in sera of these fracture patients. The prevalence of aAB against IGF1R and IR was 5% and 6% in fracture patients, respectively. The appearance of IGF1R- and IR-aAB was not induced by the surgical intervention and was unrelated to the healing outcome. BMP7-aAB were found in 1-2.5% of healthy subjects and in fracture patients that were not treated with rhBMP7. Patients that had received rhBMP7 treatment showed a higher incidence of BMP7-aAB positivity of 6% at surgery and 18% four weeks post surgery. BMP2-aAB were found in 2% of healthy controls and 6% of the fracture patients that were treated with rhBMP7. Characterizing the biological effect of BMP7-aAB in a cell-based reporter assay, a neutralizing effect was observed for samples with high titres. As the most relevant clinical outcome, the criterion consolidation was analysed defining whether the fracture gap was closed after six months or not. The presence of BMP-aAB was not significantly associated with the healing outcome. In summary, novel diagnostic assays for the detection and quantification of growth factor and receptor aAB were generated and used to determine aAB in sera from fracture patients. None of the identified aAB were negatively associated with the regeneration process or healing outcome. Ongoing concerns regarding the safety of rhBMP7 treatment are justified as the biological treatment induces aAB against BMP7 that block the BMP signal transduction.