O câncer de pele é um dos mais frequentes entre humanos, sendo o melanoma o tipo menos comum, mas com grande importância devido à agressividade que ele apresenta. Um dos principais agentes etiológicos deste tipo de tumor é a radiação ultravioleta proveniente da luz solar. A fração de radiação ultravioleta B (UVB) gera dano no DNA e induz alterações nas células da pele após a exposição prolongada e sem proteção. A resposta à luz UVB em melanócitos e melanomas é diferente, mostrando a importância do perfil celular. O efeito genotóxico da luz UVB pode alterar a expressão de moléculas como galectina-3 e MAPKs, desencadeando respostas UVB-dependentes. Galectina-3 é uma lectina que reconhece beta-galactosídeos e está envolvida na regulação de diversos processos celulares que modificam a viabilidade celular e a proliferação. Esta molécula é ubiquamente expressa apresentando um comportamento específico dependendo da sua localização subcelular. No presente trabalho mostramos que a distribuição de galectina-3 em melanoma e melanócitos é ampla, encontrando-se tanto no núcleo como no citoplasma, podendo ser modificada após irradiação UVB ou ainda secretada para o meio extracelular. Além disso, observamos que a luz UVB ativa a via de MAPKs, proteínas quinases ativadas por mitógenos envolvidas no crescimento, sobrevivência, diferenciação e resposta a estresse, em melanócitos e em melanomas poucos minutos após a exposição à UVB. Uma maior atividade de p38 e de ERK é evidenciada em melanomas, enquanto que em melanócitos a via de p38 é a mais ativa, corroborando a noção de que a resposta celular à luz UVB difere entre melanócitos e melanoma. As moléculas p38 e JNK são proteínas quinases ativada pelo estresse (SAPK). A via de JNK não é tão responsiva em alguns melanomas, mas ativação desta molécula parece estar envolvida com a sobrevivência celular e a translocação mitocondrial após UVB. Em adição, a inibição de JNK leva ao aumento de morte celular em linhagens melanocíticas irradiadas e não irradiadas, e em melanoma induz morte e aumenta autofagia após irradiação. Esta molécula parece interagir com galectina-3 em modelos murinos, mas não em melanomas humanos, enquanto que ERK interage fisicamente com galectina-3 em melanócitos e melanomas humanos, independente de UVB. Através do silenciamento de galectina-3 pela técnica de RNA de interferência, mostramos o aumento da ativação da via de ERK após irradiação e de proteínas downstream de ERK, promovendo a proliferação celular em melanomas nessas condições. Em melanócitos parece existir uma regulação negativa da via de ERK por galectina-3 acompanhada de uma diminuição da viabilidade celular após o silenciamento dessa lectina, independente de UVB. Estes resultados mostram que galectina-3 é uma importante reguladora de eventos associados com sobrevivência e morte celular em melanoma. Por outro lado, em melanomas a ausência de galectina-3 induz aumento da proliferação associada à ativação de ERK, evidenciando a importância do tipo celular na ação de galectina-3 / Skin cancer is the most common cancer among humans, melanoma being the least common type but very important due to its aggressive behavior. A major etiologic agent of this type of tumor is ultraviolet radiation from the sunlight. The ultraviolet B rays (UVB) cause DNA damage and induce alterations over the skin cells after prolonged exposition without protection. The UVB response in melanocytes and melanoma cells is different. This shows the importance of the cellular profile. The genotoxic effect of UVB light can alter the expression of molecules such as galectine-3 and MAPKs and also triggers multiple responses UVB-dependent. Galectin-3 is a lectin that recognizes beta-galactosides. It is involved in the regulation of many cellular processes that modify cellular viability and proliferation and presents specific behavior depending on its subcellular localization. In the present study we showed that galectine-3 distribution in melanoma cells and melanocytes is large, lying both in the nucleus and in the cytoplasm. After UVB irradiation this distribution could be modified or even galactine-3 secreted itself into the extracellular space. Moreover, we observed that UVB light activates the mitogen-activated protein kinase pathway (MAPK) involved in growth, survival, differentiation and stress-response in melanocytes and in melanoma cells just a few minutes after exposure. An increased activity of p38 and ERK was observed in melanomas, while in melanocytes just p38 pathway was highly active, supporting the notion that the cellular response to UVB light differs between melanocytes and melanoma cells. The molecules p38 and JNK are stress-activated protein kinases (SAPK). The JNK pathway is not responsive in some melanoma cells, but the activation of this molecule appears to be involved in cell survival and mitochondrial translocation after being exposed to UVB. Inhibition of JNK leads to increased cell death in irradiated and non-irradiated melanocytic lineage, but in melanoma cells induces cell death and increased autophagy only after irradiation. This molecule seems to interact with galectin-3 in mouse models but not in human melanomas, whereas ERK physically interacts with galectin-3 in human melanocytes and melanoma cells, regardless of UVB exposure. Through the knockdown of galectin-3 by siRNA, we showed increased activation of the ERK and its downstream pathway after irradiation, thus inducing cell proliferation. In melanocytes seems to be a negative regulation of the ERK pathway by galectin-3 accompanied by a decrease in cell viability after its knockdown regardless of UVB exposure. These results show that galectin-3 is an important regulatory molecule of events associated with cell death and survival in melanoma, which has different behavior depending on the cell type

[ES] Los dobles haploides son una gran herramienta para la mejora genética de híbridos debido a que se puede alcanzar la homocigosis completa en una sola generación. Entre las técnicas usadas para obtener estas plantas, la inducción de la embriogénesis de microsporas, mediante el cultivo de anteras o de microsporas, es la más eficiente y la más usada. La embriogénesis de microsporas es también un ejemplo de totipotencia de las células vegetales gracias a su habilidad de reprogramar su desarrollo gametofítico hacia una ruta esporofítica, donde las células proliferan de forma organizada para crear un nuevo organismo. Como en muchos otros procesos in vitro, las condiciones de cultivo deben ser optimizadas para incrementar la eficiencia. En la presente Tesis Doctoral, hemos usado dos especies como sistemas experimentales para estudiar y optimizar el cultivo de microsporas. Por un lado, usamos berenjena (Solanum melongena) como un ejemplo de cultivo de importancia económica en el que los protocolos todavía tienen mucho margen de mejora. La optimización de la densidad celular y los reguladores de crecimiento han demostrado ser útiles para modificar la eficiencia del cultivo de microsporas de berenjena. Por otra parte, hemos utilizado el cultivo de microsporas de Brassica napus para estudios básicos puesto que ha sido ampliamente usado como modelo para entender procesos celulares que ocurren durante este cambio en el desarrollo. Se detalla un protocolo estandarizado para el cultivo de microsporas de B. napus, el cual ha sido utilizado en todos los cultivos en esta Tesis para explorar una serie de procesos y estructuras celulares potencialmente implicados en el cambio de desarrollo hacia embriogénesis. Estos procesos incluyen estrés del retículo endoplásmico, muerte celular programada, autofagia y estructura y composición de la pared celular. Estudiamos en paralelo el cultivo de microsporas de dos genotipos de B. napus con diferente respuesta androgénica en condiciones estándar y añadiendo Tricostatina A, un modulador epigenético que ha mostrado ser beneficioso para la respuesta androgénica en algunos casos. En conjunto, esta Tesis representa un avance en la optimización del cultivo de microsporas en estas especies y arroja luz sobre el papel de algunos procesos en el contexto de embriogénesis de microsporas. / [CA] Els dobles haploides són una gran eina en millora vegetal per a la producció d'híbrids, a causa de la seua total homozigosi, que es pot aconseguir en només una generació in vitro. Entre les diverses tècniques que s'utilitzen per tal d'obtenir aquestes plantes, la inducció de l'embriogènesi de microspores, mitjançant cultiu d'anteres o microspores, és la més comuna i eficient. L'embriogènesi de microspores també és un exemple de la totipotència de les cèl·lules vegetals, capaços de reprogramar-se d'una via gametofítica a una via esporofítica, on proliferen de manera organitzada per crear un nou organisme. Com en moltes altres tecniques in vitro, s'han d'optimitzar les condicions del cultiu per tal d'augmentar l'eficiència. En la present Tesi Doctoral, hem utilitzat dues espècies de plantes com a sistemes experimentals per estudiar i optimitzar el cultiu de microspores. Per una banda, hem utilitzat l'albergínia (Solanum melongena) com a exemple de cultiu d'importància econòmica on els protocols encara tenen marge per a l'optimització. La optimització de la densitat de cèl·lules en cultiu i la concentració de reguladors de creixement van demostrar ser útils per modificar l'eficiència de la resposta dels cultius de microspores d'albergínia. D'altra banda, hem utilitzat cultius de microspores de Brassica napus principalment per a estudis bàsics, ja que s'utilitza àmpliament com a model per entendre els processos cel·lulars que es produeixen durant aquest canvi de desenvolupament. Es detalla un protocol estandarditzat per al cultiu de microspores de B. napus, que s'ha utilitzat en tots els cultius inclosos en aquesta Tesi per explorar una sèrie de processos i estructures cel·lulars potencialment implicades en el canvi de desenvolupament cap a l'embriogènesi. Aquests inclouen l'estrès del reticle endoplasmàtic, la mort cel·lular programada, l'autofàgia i l'estructura i composició de la paret cel·lular. Vam estudiar en paral·lel cultius de microspores de dos genotips de B. napus amb diferent resposta androgènica, cultivats en condicions estàndard i afegint-hi Tricostatina A, un modulador epigenètic que s¿ha demostrat beneficiós per a la resposta androgènica en alguns casos. En conjunt, aquesta Tesi representa un avanç en l'optimització dels cultius de microsporas en aquestes espècies i aporta llum sobre el paper d'alguns processos en el context de l'embriogènesi de microspores. / [EN] Doubled haploids are a great tool for hybrid breeding due to their complete homozygosity achievable in only one in vitro generation. Among the several techniques used to obtain these plants, induction of microspore embryogenesis, via anther or microspore culture, is the most common and efficient approach. Microspore embryogenesis is also an example of totipotency of plant cells due to their ability to reprogram themselves from a gametophytic to a sporophytic pathway, where cells proliferate in an organized way to create a new organism. As in many other in vitro procedures, culture conditions must be optimized in order to increase efficiency. In the present Doctoral Thesis, we used two plant species as experimental systems to study and optimize microspore culture. On one hand, we used eggplant (Solanum melongena) as an example of economically important crop where protocols have still room for optimization. Optimization of cell density and growth regulators demonstrated to be useful to modify the efficiency of eggplant microspore cultures. On the other hand, we used B. napus microspore cultures principally for basic studies since it is widely used as a model to understand cellular processes occurring during this developmental switch. A standardized protocol for Brassica napus microspore culture is detailed, which was used in all the cultures included in this Thesis to explore a series of processes and cellular structures potentially involved in the developmental switch towards embryogenesis. These included endoplasmic reticulum stress, programmed cell death, autophagy, and cell wall structure and composition. We studied in parallel microspore cultures from two B. napus genotypes with different androgenic response cultured in standard conditions and adding Trichostatin A, a epigenetic modulator shown to be beneficial for the androgenic response in some cases. Together, this Thesis represents an advance in the optimization of microspore cultures in these species, and sheds light on the role of some processes within the context of microspore embryogenesis. / Thanks are due to the Electron Microscopy Service of Universitat Politècnica de València, Marisol Gascón (IBMCP Microscopy Service). This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MICINN jointly funded by FEDER and by a Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (656579) to PC-M This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MINECO jointly funded by FEDER. / Camacho Fernández, C. (2021). Microspore embryogenesis: cell wall dynamics and reprogramming of cell fate [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/163698