Objetivo general Estudiar los efectos y vías de señalización involucradas en el preacondicionamiento isquémico (PI) y postacondicionamiento isquémico (POS) en corazones de ratas hipertensas espontáneas (SHR) sometidas a protocolos isquemia-reperfusión. Objetivos específicos 1.- Examinar los efectos del PI (con 1 y 3 ciclos) y POS sobre el tamaño infarto y la función miocárdica postisquémica en corazones aislados de SHR sometidos a 45 min de isquemia global y 60 min de reperfusión. 2.- Determinar el papel de la enzima glucógeno sintetasa quinasa 3β (GSK-3 β), en el citosol y en la mitocondria, en los efectos de las intervenciones aplicadas. Para ello, utilizaremos una herramienta farmacológica como es el inhibidor específico de GSK-3β, indirubina- 3-monoxima5-yodo (IMI). 3.- Evaluar la participación de la fosfatidilinositol-3'-quinasa (PI3K/Akt), en el citosol y en la mitocondria, en los efectos de las intervenciones aplicadas. Para ello, usaremos como herramienta farmacológica a la wortmanina, inhibidor de PI3K/Akt. 4.- Estudiar el rol de la isoforma ε de la proteína quinasa C (PKCε), en el citosol y en la mitocondria, en los efectos de las intervenciones aplicadas. Para ello, utilizaremos como herramienta farmacológica a la celeritrina, inhibidor de PKC. 5.- Estudiar la participación del poro de permeabilidad transitoria de la mitocondria (PPTM) en los efectos de las intervenciones aplicadas. Para ello, se usará la ciclosporina A (CsA), inhibidor específico de la ciclofilina D (componente citosólico del PPTM) para evitar la formación del poro. 6.- Evaluar la sensibilidad del PPTM al calcio en una suspensión de mitocondrias aisladas de corazones sometidos a los distintos protocolos. 7.- Evaluar el daño oxidativo analizando en homogenatos de corazones sometidos a los distintos protocolos, la peroxidación lipídica y el contenido de glutatión reducido (GSH). 8.- Determinar las posibles asociaciones físicas de P-GSK-3β y P- PKCε con el canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC) de la mitocondria en el PI y POS.

Tolueno y xileno son compuestos químicos presentes en varios solventes y otros productos industriales y de laboratorio; su toxicidad para el sistema nervioso central y el hígado ha sido bien documentada. En el presente trabajo, se han estudiado los efectos in vitro de tolueno y de xileno sobre la respiración de mitocondrias aisladas de hígado de rata energizadas con succinato evaluada por medición del consumo de oxígeno, el potencial de membrana usando safranina O como indicador, la liberación de Ca2+ usando Calcium Green 5N, la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs) con ácido homovanílico, y los cambios en el nivel de ATP utilizando el sistema luciferina-luciferasa. El hinchamiento mitocondrial, dependiente de Ca2+, sensible a ciclosporina A, un indicador de transición de permeabilidad de la membrana (TPM) mitocondrial, fue monitoreado con la medición de la disminución de la absorbancia aparente a 540 nm. Tolueno y xileno, a concentraciones 0.5-2.5 y 0.25-1 mM, respectivamente, estimularon la respiración de estado 4 en asociación aparente con la disipación del potencial de membrana y la liberación de Ca2+; estos efectos de ambos solventes indican desacoplamiento mitocondrial. A concentraciones mayores (2.5 y 5 mM, respectivamente), tolueno y xileno también inhibieron el estado 3 de respiración. A concentraciones 0.1-1 mM, xileno ocasionó una producción significante de EROs y un hinchamiento mitocondrial parcialmente dependiente de Ca2+ y parcialmente sensible a ciclosporina A. A una concentración 1mM, tolueno o xileno causaron depleciones del ATP mitocondrial hasta niveles del 66.3% y 40.3%, respectivamente; las depleciones fueron sólo ligeramente dependientes de Ca2+. Se concluyó que el desacoplamiento mitocondrial causante de la depleción de ATP puede ser responsable de la toxicidad celular de tolueno y en particular, de xileno, descrita por otros investigadores. En el último caso, parecen también estar involucrados la TPM y la generación de EROs. Palabras Clave: Tolueno, Xileno, Mitocondria, Desacoplamiento, Especies Reactivas de Oxígeno. / Toluene and xylene are chemicals present in various solvents and other industrial and laboratory products; their toxicity to the nervous system and to the liver has been well documented. In the present work, we have studied in vitro effects of toluene and xylene on the respiration of succinate-energized isolated rat liver mitochondria, evaluated by measuring oxygen consumption, membrane potential using safranine O as indicator, Ca2+ release using calcium green 5N, reactive oxygen species (ROS) by homovanillic acid, and ATP level changes using the luciferin-luciferase system. Ca2+-dependent, cyclosporine A-sensitive mitochondrial swelling, an indicator of mitochondrial permeability transition (MPT), was followed by measuring the decrease of apparent absorbance at 540 nm. At 0.5-2.5 and 0.25-1 mM concentrations respectively, toluene and xylene stimulated state 4 respiration in apparent association with mitochondrial membrane potential dissipation and Ca2+ release; these effects of both solvents indicate mitochondrial uncoupling. At higher concentrations (2.5 and 5 mM respectively) toluene and xylene also inhibited state 3 respiration. At 0.1-1 mM concentrations, xylene elicited significant ROS generation and partly Ca2+-dependent and partly cyclosporine A-sensitive mitochondrial swelling. At 1 mM concentration, toluene or xylene caused depletions of mitochondrial ATP, amounting to respectively 66.3% and 40.3%; depletions were only slightly dependent on Ca2+. It was concluded that mitochondrial uncoupling via ATP depletion migth be responsible for the earlier described cell toxicity of toluene and in particular, of xylene. In the latter case, mitochondrial generated ROS and MPT also appear to be involved. Key Words: Toluene; Xylene; Mitochondria; Uncoupling; Reactive oxygen species.

Tolueno y xileno son compuestos químicos presentes en varios solventes y otros productos industriales y de laboratorio; su toxicidad para el sistema nervioso central y el hígado ha sido bien documentada. En el presente trabajo, se han estudiado los efectos in vitro de tolueno y de xileno sobre la respiración de mitocondrias aisladas de hígado de rata energizadas con succinato evaluada por medición del consumo de oxígeno, el potencial de membrana usando safranina O como indicador, la liberación de Ca2+ usando Calcium Green 5N, la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs) con ácido homovanílico, y los cambios en el nivel de ATP utilizando el sistema luciferina-luciferasa. El hinchamiento mitocondrial, dependiente de Ca2+, sensible a ciclosporina A, un indicador de transición de permeabilidad de la membrana (TPM) mitocondrial, fue monitoreado con la medición de la disminución de la absorbancia aparente a 540 nm. Tolueno y xileno, a concentraciones 0.5-2.5 y 0.25-1 mM, respectivamente, estimularon la respiración de estado 4 en asociación aparente con la disipación del potencial de membrana y la liberación de Ca2+; estos efectos de ambos solventes indican desacoplamiento mitocondrial. A concentraciones mayores (2.5 y 5 mM, respectivamente), tolueno y xileno también inhibieron el estado 3 de respiración. A concentraciones 0.1-1 mM, xileno ocasionó una producción significante de EROs y un hinchamiento mitocondrial parcialmente dependiente de Ca2+ y parcialmente sensible a ciclosporina A. A una concentración 1mM, tolueno o xileno causaron depleciones del ATP mitocondrial hasta niveles del 66.3% y 40.3%, respectivamente; las depleciones fueron sólo ligeramente dependientes de Ca2+. Se concluyó que el desacoplamiento mitocondrial causante de la depleción de ATP puede ser responsable de la toxicidad celular de tolueno y en particular, de xileno, descrita por otros investigadores. En el último caso, parecen también estar involucrados la TPM y la generación de EROs. Palabras Clave: Tolueno, Xileno, Mitocondria, Desacoplamiento, Especies Reactivas de Oxígeno. / --- Toluene and xylene are chemicals present in various solvents and other industrial and laboratory products; their toxicity to the nervous system and to the liver has been well documented. In the present work, we have studied in vitro effects of toluene and xylene on the respiration of succinate-energized isolated rat liver mitochondria, evaluated by measuring oxygen consumption, membrane potential using safranine O as indicator, Ca2+ release using calcium green 5N, reactive oxygen species (ROS) by homovanillic acid, and ATP level changes using the luciferin-luciferase system. Ca2+-dependent, cyclosporine A-sensitive mitochondrial swelling, an indicator of mitochondrial permeability transition (MPT), was followed by measuring the decrease of apparent absorbance at 540 nm. At 0.5-2.5 and 0.25-1 mM concentrations respectively, toluene and xylene stimulated state 4 respiration in apparent association with mitochondrial membrane potential dissipation and Ca2+ release; these effects of both solvents indicate mitochondrial uncoupling. At higher concentrations (2.5 and 5 mM respectively) toluene and xylene also inhibited state 3 respiration. At 0.1-1 mM concentrations, xylene elicited significant ROS generation and partly Ca2+-dependent and partly cyclosporine A-sensitive mitochondrial swelling. At 1 mM concentration, toluene or xylene caused depletions of mitochondrial ATP, amounting to respectively 66.3% and 40.3%; depletions were only slightly dependent on Ca2+. It was concluded that mitochondrial uncoupling via ATP depletion migth be responsible for the earlier described cell toxicity of toluene and in particular, of xylene. In the latter case, mitochondrial generated ROS and MPT also appear to be involved. Key Words: Toluene; Xylene; Mitochondria; Uncoupling; Reactive oxygen species. / Tesis

El 17β-estradiol, una hormona clásicamente asociada a funciones reproductivas, ha adquirido trascendencia por sus efectos en varios tejidos no asociados a la reproducción. Asimismo, se ha propuesto que el 17β-estradiol contribuiría a la supervivencia celular en varios tejidos. En músculo esquelético ha sido descripta la presencia de receptores de estrógenos (ER) aunque el mecanismo molecular activado por la hormona y el rol fisiológico de la misma en este tejido no han sido totalmente dilucidados. En este laboratorio, utilizando la línea celular de músculo esquelético murino C2C12 se demostró que, sumado a la localización citosólica-nuclear, los ER se encuentran en mitocondria y fracción microsomal. En esta tesis, se investigó el rol del 17β-estradiol sobre las cascadas de señalización que se activan durante la apoptosis en mioblastos esqueléticos, caracterizando los mecanismos moleculares involucrados y enfatizando sobre la modulación de funciones mitocondriales. Los estudios realizados sugieren que la inducción de apoptosis con H2O2 en células C2C12 activa diferentes vías de señalización que incluyen la fosforilación temprana de PKD, y posteriormente las de JNK, PKCδ, PKCθ, p53 y p66Shc, efectos que son revertidos con el pretratamiento con 17β-estradiol. En particular, PKCδ actúa upstream JNK que, a su vez, conduce a la fosforilación y translocación mitocondrial de p66Shc en respuesta al H2O2. Este efecto también es contrarrestado por 17β-estradiol, resultando en la protección del potencial de membrana mitocondrial y la prevención de la apertura prolongada del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial. Esta acción protectora del 17β-estradiol sobre la fisiología mitocondrial también incluye la inhibición de la translocación de Bax hacia mitocondria. Asimismo, se observó que uno de los sucesos en el inicio de la apoptosis disparados por H2O2 es el aumento en la formación de estructuras tipo-TNT (tunneling nanotubes) entre las células para promover la transferencia de mitocondrias sanas desde las células no estresadas a las estresadas, mientras que el pretratamiento con la hormona disminuye su formación, efecto probablemente relacionado con la reducción en la proporción de células estresadas que necesitarían revertir la disfunción mitocondrial. Estas mitocondrias disfuncionales producen mayor cantidad de especies reactivas del oxígeno y cuando sus niveles aumentan, las enzimas antioxidantes son fundamentales para contrarrestar sus efectos negativos. En esta tesis se observó que la disminución de la capacidad antioxidante inducida por H2O2 es revertida por el pretratamiento con 17β-estradiol mediante la regulación de las actividades enzimáticas y/o expresión proteica de MnSOD, GPx y CAT a través de ERs. Por otra parte, se evidenció la regulación de FoxOs por 17β-estradiol que induciría la inhibición de la transcripción de genes proapoptóticos, y además que el inductor de apoptosis regula negativamente a nivel transcripcional a Bcl-2, y positivamente a p66Shc, PUMA y PERP, acciones que son revertidas por 17β- estradiol. Por otro lado, la regulación transcripcional de MDM2 por el H2O2, que involucra a ERK, se relacionaría con la actividad de p53 y FoxO3a inactivo. Esta tesis aporta conocimientos básicos sobre los mecanismos moleculares activados por 17β-estradiol frente a la apoptosis inducida por H2O2 en células musculares esqueléticas que resultan en supervivencia celular. / 17β-estradiol, a hormone typically associated with reproductive functions, has gained significance for its effects on several tissues not associated with reproduction. Furthermore, it has been proposed that 17β-estradiol contributes to cell survival in various tissues. In skeletal muscle it has been described the presence of estrogen receptors (ER) but the molecular mechanism activated by the hormone and its physiological role over this tissue have not been fully elucidated. In this laboratory, using the murine skeletal muscle cell line C2C12 it was shown that, in addition to the cytosolic-nuclear localization, the ER was found in mitochondria and microsomal fraction. In this thesis, it was investigated the role of 17β-estradiol on the signaling cascades that are activated during apoptosis in skeletal myoblasts, characterizing the molecular mechanisms involved and emphasizing on modulation of mitochondrial functions. The studies suggest that induction of apoptosis with H2O2 in C2C12 cells activates different signaling pathways including early phosphorylation of PKD, and then the phosphorylation of JNK, PKCδ, PKCθ, p53 and p66Shc, effects that are reversed by pretreatment with 17β-estradiol. In particular, PKCδ acts upstream JNK which, in turn, leads to phosphorylation and mitochondrial translocation of p66Shc in response to H2O2. This effect is counteracted by 17β-estradiol, resulting in the protection of mitochondrial membrane potential and prevention of sustained opening of the mitochondrial permeability transition pore. This protective effect of 17β-estradiol on mitochondrial physiology also includes the inhibition of Bax translocation to mitochondria. It was also observed that one of the events in the beginning of apoptosis triggered by H2O2 is an augmented formation of TNT-like structures (tunneling nanotubes) between cells that promotes the transfer of healthy mitochondria from unstressed to stressed cells, whereas pretreatment with the hormone decreases its formation, effects that would probably be related to the reduction in the proportion of stressed cells that needs to reverse mitochondrial dysfunction. Since dysfunctional mitochondria produce more reactive oxygen species, when their levels are increased, antioxidant enzymes are essential to counteract their negative effects. In this thesis, it was observed that the decrease in H2O2-induced antioxidant capacity is reversed by pretreatment with 17β-estradiol by regulating enzyme activities and/or protein expression of MnSOD, GPx and CAT via ERs. Additionally, it was observed that the regulation of FoxOs mediated by 17β- estradiol would be related to the inhibition of transcription of proapoptotic genes, and moreover that the apoptotic inductor negatively regulates the transcriptional level of Bcl-2, and positively the transcriptional levels of p66Shc, PUMA and PERP. These actions are reversed by pretreatment with 17β-estradiol. Also, it was suggested that the transcriptional regulation of MDM2 by H2O2 involved ERK and that it could be related to p53 activity and inactive FoxO3a. This thesis provides basic information on the 17β-estradiol-activated mechanisms against H2O2-induced apoptosis in skeletal muscle cells resulting in cell survival molecular mechanisms.

Dirección General de Investigación Científica y Técnica (PB 87-0093)

[ES] La familia de proteínas Bcl-2 regula la apoptosis a través de una compleja red de interacciones. Las células tumorales suelen presentar mutaciones que afectan a su expresión o sus interacciones para mejorar la progresión tumoral. Además, alteraciones en su regulación también promueven la migración de células cancerígenas, la invasión y la metástasis. Para llevar a cabo sus funciones, las proteínas Bcl 2 interaccionan entre sí tanto en el citoplasma como en las membranas intracelulares. Los equilibrios de interacción de los dominios Bcl citosólicos se han investigado ampliamente y recientemente, se han propuesto como dianas terapéuticas. Sin embargo, el interactoma de los dominios transmembrana (TMD, del inglés transmembrane domains) sigue siendo poco conocido. Por ello, un conocimiento profundo de la biología de las proteínas Bcl-2 es necesario para explotar eficientemente sus superficies de unión en el tratamiento del cáncer. Para llevar a cabo este objetivo, nos hemos centrado en tres áreas: 1. La comprensión detallada de la contribución del TMD de Mcl-1 a su interactoma en membrana y su función. 2. El descubrimiento de nuevos inhibidores de Mcl-1 que actúen sobre su TMD y que permitan desarrollar una clase de drogas anticancerígenas aún por explorar. 3. La caracterización molecular de mutaciones relacionadas con el cáncer descritas en los TMD de Bcl-2 y Bcl-xL y sus implicaciones en la supervivencia de las células tumorales. La proteína antiapoptótica Mcl-1 inhibe a los miembros proapoptóticos Bak, Bax, Bok, Noxa, etc. Aunque se ha estudiado en detalle su actividad promoviendo la supervivencia celular, el mecanismo molecular por el cuál previene la apoptosis mediada por Bok aún no está claro. Además, el conocimiento de las actividades de Mcl-1, descritas hasta ahora, se basa exclusivamente en las estructuras resueltas de las regiones solubles en agua y en estudios centrados en los dominios citosólicos. Por primera vez, hemos demostrado la relevancia del TMD de Mcl-1 en su equilibrio de interacción. En este trabajo describimos su capacidad específica para homo- y hetero-oligomerizar con el TMD de Bok. También ponemos de manifiesto la influencia de estas interacciones en la modulación de apoptosis y resaltamos la relevancia clínica de los mutantes del TMD de Mcl-1 identificados en pacientes con cáncer. Muchos tumores hematológicos y sólidos sobre-expresan Mcl-1 como mecanismo para adquirir quimiorresistencia. Se han desarrollado miméticos de BH3 específicos para modular su actividad antiapoptótica en células cancerosas. Sin embargo, aún no disponemos de datos científicos que informen sobre su toxicidad y eficacia en humanos. En este trabajo, proponemos la novedosa interacción de los TMDs de Mcl-1 y Bok como un nuevo sitio de acción de fármacos quimioterapéuticos. Hemos identificado tres inhibidores de esta interacción con características que los hacen prometedores candidatos para el desarrollo farmacéutico, así como buenas herramientas moleculares para estudiar la interacción de los TMDs de Mcl-1 y Bok. Para modular la apoptosis, las células tumorales también presentan versiones mutadas de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL. En nuestro conocimiento, este es el primer estudio que analiza mutaciones somáticas de sus TMDs. Nuestro trabajo demuestra cómo estas mutaciones alteran el equilibrio en membrana de las proteínas. Además, nuestros resultados explican la influencia que algunos mutantes somáticos ejercen en la regulación de la apoptosis. En general, los resultados científicos que aparecen en esta tesis resaltan el papel de los Bcl TMDs en el interactoma de las proteínas Bcl-2. Estos hallazgos corroboran que las interacciones laterales entre los TMDs son específicas y contribuyen activamente a la funcionalidad de la proteína. Por lo tanto, comprender los Bcl TMDs puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología de las proteínas Bcl. / [CA] La família de proteïnes Bcl-2 regula l'apoptosi a través d'una complexa xarxa d'interaccions. Les cèl·lules tumorals solen presentar mutacions que afecten la seua expressió o les seues interaccions per a millorar la progressió tumoral. A més, alteracions en la seua regulació també promouen la migració de cèl·lules cancerígenes, la invasió i la metàstasi. Per a dur a terme les seues funcions, les proteïnes Bcl-2 interaccionen entre si tant en el citoplasma com en les membranes intracel·lulars. Els equilibris d'interacció dels dominis Bcl citosòlics s'han investigat àmpliament i recentment, s'han proposat com a dianes terapèutiques. No obstant això, l'interactoma dels dominis transmembrana (TMD, de l'anglés transmembrane domains) continua sent poc conegut. Per això, un coneixement profund de la biologia de les proteïnes Bcl-2 és necessari per a explotar eficientment les seues superfícies d'unió en el tractament del càncer. Per a dur a terme aquest objectiu, ens hem centrat en tres àrees: 1. La comprensió detallada de la contribució del TMD de Mcl-1 al seu interactoma en membrana i la seua funció. 2. El descobriment de nous inhibidors de Mcl-1 que actuen sobre el seu TMD i que permeten desenvolupar una classe de drogues anticanceroses encara per explorar. 3. La caracterització molecular de mutacions relacionades amb el càncer descrites en els TMD de Bcl-2 i Bcl-xL i les seues implicacions en la supervivència de les cèl·lules tumorals. La proteïna anti apoptòtica Mcl-1 inhibeix als membres pro apoptòtics Bak, Bax, Bok, Noxa, etc. Encara que s'ha estudiat detalladament la seua activitat promovent la supervivència cel·lular, el mecanisme molecular pel qual prevé l'apoptosi mediada per Bok encara no és clar. A més, el coneixement de les activitats de Mcl-1, descrites fins ara, es basa exclusivament en les estructures resoltes solubles en aigua i en estudis centrats en els dominis externs a la membrana. Per primera vegada, hem demostrat la rellevància del TMD de Mcl-1 el seu equilibri d'interacció. En aquest treball descrivim la seua capacitat específica per a unir-se amb si mateix i per a hetero-oligomeritzar amb el TMD de Bok. També expliquem la influència d'aquestes interaccions en l'apoptosi i ressaltem la rellevància clínica dels mutants del TMD de Mcl-1 identificats en pacients amb càncer. Molts tumors hematològics i sòlids sobre-expressen Mcl-1 com un mecanisme per a adquirir quimioresistència. S'han desenvolupat mimètics de BH3 específics per a modular la seua activitat anti apoptòtica en cèl·lules canceroses. No obstant això, encara no disposem de dades científiques que informen sobre la seua toxicitat i eficàcia en humans. Per això, proposem la nova interacció dels TMDs de Mcl-1 i Bok com un lloc d'actuació de fàrmacs quimioterapèutiques. Hem identificat tres inhibidors d'aquesta interacció amb característiques que els fan prometedors candidats per al desenvolupament farmacèutic, així com bones eines moleculars per a estudiar la interacció dels TMDs de Mcl-1 i Bok. Per a modular l'apoptosi, les cèl·lules tumorals també presenten versions mutades de les proteïnes anti apoptòtiques Bcl-2 i Bcl-xL. En el nostre coneixement, aquest és el primer estudi que analitza mutacions somàtiques de les seues TMDs. El nostre treball demostra com aquestes mutacions alteren l'equilibri en membrana de les proteïnes. A més, els nostres resultats expliquen la influència que alguns mutants somàtics exerceixen en la regulació de l'apoptosi. En general, els resultats científics que apareixen en aquesta tesi ressalten el paper dels Bcl TMDs en l'interactoma de les proteïnes Bcl-2. Aquestes troballes corroboren que les interaccions laterals entre els TMDs són específiques de la seqüència i contribueixen activament a la funcionalitat de la proteïna. Per tant, comprendre els Bcl TMDs pot proporcionar nous coneixements sobre la biologia de les proteïnes Bcl / [EN] The family of the Bcl-2 proteins modulates the apoptotic pathway by a complex network of interactions. Tumor cells frequently present mutations that affect Bcl-2 proteins expression or interactions to enhance cancer progression. Dysregulation of these proteins also promotes cancer cell migration, invasion, and metastasis. To execute their functions, Bcl-2 proteins interact in both the cytosol and intracellular membranes. Binding equilibria of Bcl extramembrane domains has been largely investigated and recently proposed as chemotherapeutic targets. However, the interactome of transmembrane domains (TMDs) remains poorly understood. In this scenario, a deep knowledge of the biology of Bcl-2 proteins is needed to exploit efficiently their binding surfaces for cancer treatment. To address this aim, our research focuses on three areas: 1. The detailed comprehension of the TMD contribution to both the Mcl-1 membrane interactome and protein functionality. 2. The discovery of new Mcl-1 inhibitors that target the transmembrane surface to develop a class of anticancer drugs currently unexplored. 3. The molecular characterization of cancer-related mutations within the Bcl-2 and Bcl-xL TMDs and their implications for the survival of cancer cells. Antiapoptotic Mcl-1 protein inhibits the proapoptotic members Bak, Bax, Bok, and Noxa, among others. Although its prosurvival activity has been well studied, the molecular mechanism to prevent Bok-mediated apoptosis remains unclear. Furthermore, understanding of Mcl-1 activities described to date is only based on water-soluble structures and studies focused on extramembrane domains. For the first time, we uncover the relevance of the Mcl-1 TMD in the interaction equilibria of the protein. In the present work, we describe its specific capacity to self-associate and hetero-oligomerize with the Bok TMD. We also explain the influence of these interactions in the apoptotic pathway and highlight the clinical relevance of Mcl-1 TMD mutants identified in tumor patients. Many hematological and solid malignancies overexpress Mcl-1 as an acquired chemoresistance mechanism. To modulate its antiapoptotic activity in cancer cells, specific BH3 mimetics have been developed; however, there is no scientific data yet regarding human toxicity and efficacy. In this work, we propose the novel Mcl-1 and Bok TMDs interaction interface as a drugging site in the development of chemotherapeutics. We identify three potential inhibitors of such molecular interface with promising features to become both drug candidates for pharmaceutical development and research toosl for the molecular study of the Mcl-1 and Bok TMDs interaction. To take advantage of apoptosis modulation, tumor cells also present mutated versions of the antiapoptotic members Bcl-2 and Bcl-xL. To our knowledge, this is the first study that analyzes patient-derived mutations within Bcl-2 and Bcl-xL TMDs and demonstrates how said mutations alter the membrane equilibria of these proteins. The results presented here also explain the functional influence of some somatic mutants in apoptosis regulation. Overall, the scientific results exhibited in this Thesis highlight the role of Bcl TMDs in the interactome of Bcl-2 proteins. These findings corroborate that lateral interactions between TMDs are sequence-specific and actively contribute to protein functionality. Therefore, understanding of Bcl transmembrane segments may provide new insights into the biology of Bcl 2 proteins for their pharmaceutical modulation in antitumoral therapy. / The student has been granted with a PhD fellowship and a short-term fellowship from the Generalitat Valenciana (Subvenciones para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral, 2016-2019, and Grant for predoctoral stays out of the Comunitat Valenciana, 2019). This work has been supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (projects SAF2014-52614-R and SAF2017-84689-R / Lucendo Gutiérrez, E. (2020). Understanding and Drugging the Bcl-2 Transmembrane Interactome for Tumor Treatment [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/155914

Las aves pueden vivir dos veces más tiempo y poseen tasas metabólicas específicas 2.3 veces mayores que las de los mamíferos de similar tamaño corporal. La temperatura del cuerpo está 3ºC por encima de la que presentan los mamíferos y los niveles de glucosa en sangre son 2 a 4 veces más altos. Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga como el ácido araquidónico (C20:4n6) y el ácido docosahexenoico (C22:6n3) juegan un papel importante en una variedad de funciones biológicas. Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), son biomoléculas muy susceptibles de ser atacadas por radicales libres, proceso que se denomina peroxidación lipídica. Los radicales libres son generados en las células a través de varios tipos de reacciones bioquímicas y aunque pueden ser potencialmente perjudiciales debido a su alta reactividad química, son especies intermediarias necesarias para la normal actividad metabólica de la célula viviente. La concentración intracelular de los radicales libres es controlada fisiológicamente por radicales secuestradores, por restricciones espaciales y limitaciones en su difusión intracelular. Sin embargo, en ciertos estados de enfermedad ó bajo la acción de xenobióticos, radiación ó durante los procesos de envejecimiento, la producción de dichas especies aumenta y esto conduce a la alteración de las funciones celulares. La peroxidación lipídica es una secuencia de reacciones caracterizada por 3 pasos diferentes conocidos como iniciación, propagación y terminación. Como modelo para estudiar los lípidos, nosotros utilizamos ensayos de peroxidación no enzimática cuantificada mediante quimioluminiscencia. Algunos productos de la peroxidación lipídica son emisores de luz, y la medida de esta se puede utilizar como un marcador interno del estrés oxidativo de lípidos que, es generalmente considerado como uno de los principales mecanismos de lesión de las células en los organismos aeróbicos. Las mitocondrias y microsomas obtenidas de mamíferos y aves son susceptibles a la peroxidación lipídica. La composición de los ácidos grasos de las membranas varía en las diferentes especies y tejidos de una misma especie lo que determina la mayor ó menor vulnerabilidad a la peroxidación lipídica. Datos previos realizados en mamíferos muestran que la composición de ácidos grasos y el índice de peroxidación varían en relación con la masa corporal. Si bien existen algunos trabajos que tratan de establecer dicha relación en las aves, los resultados no son concluyentes. Teniendo en cuenta estas consideraciones, los objetivos de este trabajo de tesis fueron estudiar la composición de ácidos grasos y peroxidación lipídica de mitocondrias y microsomas aislados de hígado, corazón y cerebro de aves de diferentes especies: relación con el tamaño corporal y máximo de vida.

La información respecto a la respuesta del corazón aislado de ratas hipertensas espontáneas (SHR) a la isquemia-reperfusión y a los mecanismos de protección descriptos para ratas normotensas [pre y postacondicionamiento isquémicos (PI y PCI, respectivamente) y farmacológicos], es escasa. Por lo tanto, la participación de la vía PI3K/Akt/GSK-3β y del poro de permeabilidad transitoria de la mitocondria (PPTM) en los mecanismos responsables de la muerte ó la sobrevida de los cardiomiocitos de SHR, no están debidamente aclarados. El objetivo general de este trabajo de tesis fue estudiar en corazones de SHR aislados y perfundidos con la técnica de Langendorff los efectos de la isquemia global (IG, 45 min)-reperfusión (R, 60 min), del PI y PCI y del tratamiento con ClLi e IMI (inhibidores de GSK-3β) sobre el tamaño del infarto, el daño oxidativo, la sensibilidad del PPTM al Ca2+, la liberación de citocromo c al citosol y la ultraestructura mitocondrial. El protocolo de IG-R produjo un tamaño del infarto de aproximadamente 50% del área de riesgo y daño oxidativo, evidenciado por un aumento de la peroxidación lipídica (TBARS), una disminución marcada del contenido de GSH y un aumento de la actividad de SODT y SODMn. El contenido de P-GSK-3β y P-Akt y la sensibilidad del PPTM al Ca2+ disminuyeron, mientras que la expresión de citocromo c en el citosol aumentó. La microscopia electrónica reveló que la mayor parte de las mitocondrias estaban dañadas, con edema y destrucción de sus crestas. Las intervenciones PI y PCI y el tratamiento con los inhibidores de GSK-3β protegieron a los corazones de SHR de los daños antes mencionados. Por lo tanto, en los corazones intervenidos y tratados se observó una disminución del tamaño del infarto y del daño oxidativo evidenciado por la disminución de la peroxidación lipídica (TBARS), preservación parcial del contenido de GSH y disminución de la actividad de SODT y SODMn. La expresión de P-GSK3β y de P-Akt y de la sensibilidad del PPTM al Ca2+ aumentó mientras que el contenido de citocromo c en el citosol disminuyó. Por microscopia electrónica fue posible encontrar en estos grupos la presencia de algunas mitocondrias con ultraestructura conservada. Los efectos beneficiosos del PI y PCI fueron anulados cuando la vía de señalización de PI3K/Akt fue inhibida con wortmanina. Las variables mencionadas retornaron a los valores observados en los corazones isquémicos no tratados. De las relaciones examinadas surge que: a- el tamaño del infarto es mayor cuando la peroxidación lipídica aumenta y el contenido de GSH disminuye. En estas condiciones la sensibilidad del PPTM al Ca2+ es menor. La situación opuesta se da en presencia de intervenciones cardiorpotectoras. Por lo tanto, en ellas el tamaño del infarto es menor cuando la peroxidación lipídica disminuye y el contenido de GSH aumenta. En estas condiciones la sensibilidad del PPTM al Ca2+ tiende a recuperarse. En base a los datos obtenidos se concluye que las alteraciones de la formación y/ó apertura del PPTM, participan y determinan la muerte ó la sobrevida celular en el corazón hipertrófico de SHR sometido a isquemia-reperfusión. Así, la disminución del tamaño del infarto obtenida con las intervenciones y/ó tratamientos utilizados fue el resultado de la disminución del daño oxidativo íntimamente asociada a la recuperación parcial de la integridad mitocondrial -menor apertura del PPTM- vía P-Akt/P-GSK-3β. Otro hallazgo interesante fue que la protección por el tratamiento con ClLi (fármaco ampliamente utilizado en psiquiatría) fue similar a la obtenida con las intervenciones de acondicionamiento isquémico (PI y PCI). Por lo tanto, esta droga podría ser una posible herramienta terapéutica para atenuar la injuria por isquemia y reperfusión. / Information regarding to the response to ischemia-reperfusion in isolated hearts from spontaneously hypertensive rats (SHR) as well as the effect of the protective mechanisms described in normotensive rats (ischemic and pharmacological pre and postconditioning, IP and IPC), is scarce. Therefore, the participation of PI3K/Akt/GSK-3β pathway and the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in the mechanisms responsible for cardiomyocyte death or survival are not properly clarified. The objective of this investigation was to study in isolated hearts from SHR the effects of global ischemia (GI, 45 min) and reperfusion (R, 60 min), and the actions of IP, IPC, treatments with LiCl and IMI (GSK-3β inhibitors) on infarct size, oxidative damage, mPTP Ca2+ sensitivity, cytochrome c release to the cytosol and mitochondrial ultrastructure. The protocol of GI-R produced an infarct size of approximately 50%, increased oxidative damage as evidenced by an increase of lipid peroxidation (TBARS), a decrease of GSH content and an increase of Total SOD and MnSOD activity. The content of P-GSK-3β and P-Akt and the mPTP Ca2+ sensitivity decreased while the expression of cytochrome c in the cytosol increased. Electron microscopy showed that most of the mitochondria were damaged, presenting edema and destruction of the cristae. IP, IPC and pharmacologic treatments with both GSK-3β inhibitors protected the hearts against reperfusion injury. Therefore, in the hearts treated we observed a smaller infarct size and reduced oxidative damage (decreased lipid peroxidation (TBARS), partial preservation of GSH and decreased Total SOD and MnSOD activity) compared to non-treated ischemic hearts. The P-GSK-3β and P-Akt expression and mPTP Ca2+ sensitivity increased while the cytosolic cytochrome c content decreased. By electron microscopy it was possible to find some mitochondria with normal ultrastructure. The beneficial effects of IP and IPC were canceled when the PI3K/Akt was inhibited with wortmannin. All the parameters examined returned to the values observed in non-treated ischemic hearts. Analyzing the relationships: Infarct size vs. TBARS and GSH, and mPTP Ca2+ sensitivity vs. Infarct size and TBARS, it arises that: the Infarct size increased when lipid peroxidation increased and GSH content decreased. Under these conditions the mPTP Ca2+ sensitivity decreased. The opposite situation occurs in the presence of the cardioprotective interventions. Therefore, the infarct size decreased when lipid peroxidation decreased and GSH content increased. Under these conditions the mPTP Ca2+ sensitivity tended to recover. Based on the data obtained, we suggest that the alterations of formation and/or opening of the mPTP participate and determine cell death or survival in the hypertrophic heart of SHR subjected to ischemia-reperfusion. Thus, the reduction in infarct size obtained with the ischemic interventions and /or treatments derived from the decreased oxidative damage intimately linked to a partial recovery of mitochondrial integrity- less mPTP opening- via P-Akt/P-GSK-3β. Another interesting finding was that the protection by the treatment with LiCl (drug widely used in psychiatry) was similar to that obtained with ischemic interventions (IP and IPC). Therefore, this drug emerges as a potential therapeutic tool in reducing the post-ischemic changes.

As biotécnicas da reprodução na espécie equina avançaram na última década, tanto em conhecimento agregado por pesquisas como também pela demanda do mercado. No entanto, na espécie equina machos com subfertilidade são diagnosticados frequentemente com elevado número de espermatozoides com alterações morfológica e/ou imóveis. A utilização apenas de células viáveis para realizar o processo de resfriamento busca evitar perda de material (diluente) e produção de metabólitos tóxicos aos espermatozoides viáveis. O objetivo deste estudo foi utilizar a separação espermática (lã de vidro e centrifugação com Androcoll®) pré-resfriamento para incrementar a viabilidade do sêmen de garanhões pôneis refrigerados a 5ºC durante 48h. Os parâmetros motilidade, funcionalidade de membrana (HOST), viabilidade espermática (CFDA/PI), atividade mitocondrial e morfologia espermática foram avaliados no sêmen fresco e refrigerado (24 e 48h). A utilização da filtração por lã de vidro ou Androcoll® pré-resfriamento do sêmen equino selecionou espermatozoides com maior motilidade, funcionalidade de membrana, viabilidade espermática e atividade mitocondrial. Adicionalmente, a filtração por lã de vidro proporcionou refrigerar sêmen com elevado número de células morfologicamente normais sem perdas significativas de espermatozoides pelo processo de filtração. Tanto a técnica de lã de vidro como a centrifugação com Androcoll® mostraram-se eficientes em separar ejaculados com maior viabilidade para o resfriamento. Já a técnica de lã de vidro apresenta-se como uma técnica de baixo custo e de fácil execução para ser aplicada tanto para pequenos, ou grandes volumes de sêmen. / The reproduction biotechnologies in equine species have advanced in the last decade both in aggregate knowledge by research as well as the market demand. However, it in the equine species often with male subfertility where the ejaculate has a high number of sperm with morphological and / or property changes. The use of only viable cells to perform the cooling process seeks to avoid loss of material (diluent) and production of toxic metabolites to viable sperm. The aim of this study was to use the sperm separation (glass and spin wool with Androcoll®) pre-cooling to increase the viability of semen chilled ponies stallions at 5 ° C for 48 hours. We evaluated the motility parameters, membrane functionality (HOST), sperm viability (CFDA / PI), mitochondrial activity and morphology in fresh and chilled semen (24 and 48h). The use of filtration glass wool or Androcoll® pre-cooling of equine semen selected sperm with higher motility, functionality membrane, sperm viability and mitochondrial activity. In addition to filtration through glass wool afforded cooling semen with a high number of morphologically normal cells without significant losses of spermatozoids the filtration process. Both glass wool technique as centrifugation with Androcoll® were efficient in separating ejaculated more viability for cooling. Already glass wool technique presents itself as a low cost and simple technique to be applied to both small or large volumes of semen.

El síndrome de Down constituye la cromosomopatía más frecuente que ocurre en uno de cada 700 a 1000 nacimientos y está causado por la trisomía completa o por una parte del cromosoma 21 humano (HSA21). Aún se desconoce cómo la presencia del cromosoma 21 extra da lugar al fenotipo característico de este síndrome. En este sentido la participación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) ha sido propuesta como uno de los mecanismos que intervienen en la patogénesis del mismo. Dicho mecanismo se fundamenta en la sobreexpresión de al menos 16 genes del HSA21 relacionados con el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y con la generación de energía mitocondrial. Uno de estos genes es el que codifica una importante enzima del sistema antioxidante celular, el gen SOD1, propuesto como potencial culpable del estrés oxidativo inusual en los individuos con SD. En condiciones normales, los ROS, producidos in vivo principalmente por la respiración aeróbica, se eliminan de la célula por la acción de las enzimas antioxidantes, superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx). La Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD1) convierte el radical superóxido a peróxido de hidrógeno, el cual es eliminado por la glutatión peroxidasa y/o catalasa a agua y oxígeno. La sobreexpresión de la SOD1 puede producir un desequilibrio en la relación de las enzimas antioxidantes (SOD1, GPx y CAT) generando estrés oxidativo y podría resultar en el daño oxidativo a biomoléculas tales como ácidos grasos poliinsaturados en los lípidos de las membranas, proteínas esenciales y el DNA, ya que existe una variabilidad en los niveles de enzimas antioxidantes dentro de la población con SD, lo que puede estar relacionado con una desregulación compleja que afecte no sólo a los genes del HSA21 sino también en otros cromosomas. Así, el daño celular puede ser inducido por los ROS y asociarse a algunas de las alteraciones celulares en el SD, causando diversas patologías y conducir a un envejecimiento prematuro. Se obtuvieron 18 muestras de fibroblastos primarios fetales humanos, 9 de ellos con síndrome de Down (FT21) y 9 controles (FC), en los cuales se evaluó la disminución de la capacidad endógena antioxidante debido a la sobreexpresión de la SOD1, causando un exceso en la producción intracelular de ROS y el origen prematuro de estrés oxidativo asociado al daño oxidativo a lípidos y proteínas, así como a una disfunción mitocondrial. Se analizaron varios marcadores de senescencia celular con la finalidad de contribuir al conocimiento de un nuevo aspecto de la patología de este síndrome, el envejecimiento prematuro. Estos mecanismos fisiopatológicos podrían estar relacionados con la aparición y establecimiento de la senescencia celular prematura en los fibroblastos con trisomía del cromosoma 21 (FT21). / Down syndrome is the most common chromosomal disorder that occurs in 1 in 700 to 1,000 births and is caused by trisomy full or part of human chromosome 21 (HSA21). It is still unknown how the presence of the extra chromosome 21 results in the phenotype of this syndrome. In this sense the involvement of reactive oxygen species (ROS) has been proposed as one of the mechanisms involved in the pathogenesis of same. This mechanism is based on the overexpression of at least 16 genes related HSA21 metabolism of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial energy generation. One of these genes encoding is an important cellular antioxidant enzyme system, the SOD1 gene, proposed as a potential culprit unusual oxidative stress in individuals with DS. Under normal conditions, the ROS produced in vivo mainly by aerobic respiration of the cells are removed by the action of antioxidant enzymes, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx). The Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) converts the superoxide radical to hydrogen peroxide, which is eliminated by glutathione peroxidase and/or catalase into water and oxygen. SOD1 overexpression can produce an imbalance in the ratio of antioxidant enzymes (SOD1, GPx and CAT) generating oxidative stress and may result in oxidative damage to biomolecules such as polyunsaturated fatty acids in the membrane lipids, proteins and essential DNA, since there is a variability in the levels of antioxidant enzymes in the DS population, which can be related to a complex deregulation affects not only Hsa21 genes but also on other chromosomes. Thus, cell damage can be induced by ROS and associated with some of the cellular changes in the DS, causing various diseases and lead to premature aging. Eighteen samples were obtained from primary human fetal fibroblasts, 9 with Down syndrome (TF21) and 9 normal (NF), which was evaluated in decreasing endogenous antioxidant capacity due to overexpression of the SOD1, causing excess in intracellular production of ROS and oxidative stress origin associated premature oxidative damage to lipids and proteins, as well as mitochondrial dysfunction. We analyzed several markers of cellular senescence in order to contribute to the knowledge of a new aspect of the pathology of this syndrome, premature aging. These pathophysiological mechanisms may be related to the emergence and development of premature cellular senescence in fibroblasts with trisomy 21 (FT21).