La proteína Alex3 forma parte de la familia de genes exclusiva de los mamíferos euterios Armcx, caracterizada por presentar una alta expresión en el SNC, por encontrarse localizada en clúster en el cromosoma X y porque se originaron a partir de la retrotransposición del gen Armc10 y una rápida duplicación en tándem en una evolución temprana de los mamíferos euterios. Las proteínas Armcx/Armc10 poseen primariamente una localización subcelular bimodal, encontrándose asociadas a la membrana externa mitocondrial y en el núcleo celular, localización que concuerda con sus secuencias proteicas que poseen putativos dominios de localización en estos compartimentos. La sobreexpresión de las proteínas Armcx/Armc10 produce una profunda alteración de la red mitocondrial, demostrando que esta familia de proteínas juega un papel importante en la regulación de la dinámica y agregación mitocondrial y al menos, la sobreexpresión de la proteína Alex3, no induce cambios en los parámetros bio-energéticos mitocondriales, tales como el consumo de oxígeno, el potencial de membrana, el contenido de DNA mitocondrial, la actividad de la citocromo c oxidasa o la recaptación de Ca2+, ni alteran el balance de fisión/fusión mitocondrial. Tanto la sobreexpresión como el silenciamiento de las proteínas Alex3 y Armc10 en neuronas hipocampales se ha visto alteran la distribución y transporte mitocondrial. Las proteínas Alex3 y Armc10 interaccionan con el complejo Kinesina/Miro/Trak2, regulador del transporte mitocondrial, lo cual sugiere que esta familia de proteínas regularían el transporte y dinámica mitocondrial a través de este complejo de proteínas. La interacción de Alex3 con este complejo también se ha visto es dependiente de los niveles de Ca2+, reduciéndose la interacción de estas proteínas cuando los niveles de Ca2+ son elevados. Por otra parte, la vía de señalización asociada a proteínas Wnt se ha visto induce la degradación de la proteína Alex3 por un proceso independiente del proteosoma. Esta degradación no depende de los componentes de la vía canónica Dishevelled, GSK3-β y β-catenina ni de los componentes no canónicos JNK, CAMKII y calcineurina, habiéndose demostrado que la PKC y la CK2 juegan un papel principal en el control y degradación de los niveles de la proteína Alex3 de forma dependiente e independiente de las vías de señalización de Wnt. De manera similar, la depleción de los niveles intracelulares de Ca2+ también reproduce la degradación de Alex3. Además, la degradación de Alex3 a través de las vías de señalización asociadas a las proteínas Wnt revierte los fenotipos de agregación mitocondrial inducidos por la sobreexpresión de Alex3 y es evitado por la activación de la PKC, lo que sugiere que las proteínas Wnt podrían jugar un papel en el control de la dinámica mitocondrial mediante la regulación de las proteínas Armcx. / Alex3 protein belongs to the eutherian specific family of genes Armcx, characterized by a high expression on the CNS, to be localized in a cluster on the X chromosome and to be originated by retrotransposition of Armc10 gene in a fast duplication in tandem. The Armcx/Armc10 proteins have a primary bimodal localization, both in nucleus and mitochondria as indicate their putative domains. Overexpression of Armcx/Armc10 proteins causes a profound alteration on the mitochondrial net showing that this family of proteins plays an important role in the regulation of the mitochondrial dynamics and at least, the overexpression of Alex3 protein neither change the bioenergetic parameters of mitochondria such as respiration, mitochondrial DNA content or calcium uptake nor alters the mitochondrial fusion/fission rate. Both the overexpression and knock-down of Alex3 and Armc10 proteins in hippocampal neurons alters the mitochondrial distribution and transport. Alex3 and Armc10 interact with the Kinesin/Miro/Trak2 mitochondrial transport regulator complex, suggesting that the Armcx protein family regulates mitochondrial dynamics through this complex. Moreover the interaction of Alex3 with this complex is dependent of calcium levels, diminishing the interaction when calcium levels are high. On the other hand, the Wnt signalling pathway induces the degradation of Alex3 protein in a proteosome independent process. This degradation is independent of the Wnt canonical and non-canonical members Dishevelled, GSK3β, β-catenin, JNK, calcineurin and CAMKII, but showing that the PKC and CKII members play a principal role in the control and degradation of Alex3 protein levels dependently and independently of Wnt pathways. Moreover, Alex3 degradation through Wnt signalling pathways, reverts the mitochondrial aggregation phenotypes and is avoided by PKC activation, suggesting that Wnt proteins can play a role in the control of mitochondrial dynamics through the regulation of Armcx proteins.

Els mitocondris són orgànuls citoplasmàtics que tenen un paper fonamental en múltiples processos biològics com l’oxidació de substrats i la producció d’ATP, la senyalització cel•lular, l’apoptosi, el control del cicle cel•lular i l’homeòstasi del calci. Els mitocondris són orgànuls dinàmics, que pateixen canvis de morfologia regulats per processos de fusió i de fissió. Existeix un equilibri entre ambdós processos que és indispensable per a la correcta funció mitocondrial. Les proteïnes que participen directament en la fusió mitocondrial en mamífers són les mitofusines (Mfn1 i Mfn2), localitzades a la membrana mitocondrial externa i OPA1, situada a la membrana mitocondrial interna. Diferents estudis han demostrat que la proteïna Mfn2, a més de promoure la fusió dels mitocondris, també està implicada en la interacció entre els mitocondris i el reticle endoplasmàtic i que participa en la regulació del cicle cel•lular i del metabolisme mitocondrial. Per altra banda, l’expressió de Mfn2 es troba disminuïda en múscul esquelètic en situacions de resistència a la insulina, com l’obesitat o la diabetis de tipus 2, que a la vegada es caracteritzen per una alterada activitat mitocondrial. En base a aquestes observacions, l’objectiu principal de la present tesi doctoral ha estat estudiar els efectes de la modulació de l’expressió de Mfn2 sobre el metabolisme i la bioenergètica mitocondrial en múscul esquelètic. Amb aquest propòsit hem expressat una forma truncada de Mfn2 (hMfn2Δ614-757) o bé hem reprimit l’expressió de Mfn2 endògena en el model cel•lular C2C12 i en múscul esquelètic de ratolí. Per dur a terme aquest objectiu hem generat 3 models de ratolí diferents: el model d’expressió transitòria de la forma hMfn2Δ614-757; el model de repressió transitòria de Mfn2 i el ratolí knockdown de Mfn2. Els dos primers models han estat generats mitjançant la tècnica de l’electrotransferència d’ADN en múscul esquelètic. La sobreexpressió de la forma hMfn2Δ614-757 en cèl•lules C2C12 diferenciades incrementa el consum d’oxigen mitocondrial en situació basal i també en desacoblar la cadena de transport d’electrons de la síntesi d’ATP, suggerint una major capacitat respiratòria dels miotubs que expressen la hMfn2Δ614-757. En múscul esquelètic de ratolí, l’expressió d’aquesta forma de Mfn2 causa una estimulació de la taxa d’oxidació de glucosa així com un increment de la Respiratory Control Ratio (RCR). La inducció del metabolisme mitocondrial observada en sobreexpressar la forma hMfn2Δ614-757 no és deguda a un augment de la massa mitocondrial, sinó a un increment en l’expressió i l’activitat d’alguns dels complexes de la cadena respiratòria mitocondrial. La repressió de Mfn2 en miotubs C2C12 produeix un increment en la respiració no associada a la producció d’ATP o proton leak i una disminució en el potencial de membrana mitocondrial. Aquests resultats indiquen que la repressió de Mfn2 provoca el desacoblament de la cadena de transport d’electrons i la síntesi d’ATP, suggerint una disminució de l’eficiència de la fosforilació oxidativa. Els músculs dels ratolins knockdown de Mfn2 presenten una reducció de la taxa d’oxidació de glucosa i de la Respiratory Control Ratio. A més, la repressió de Mfn2 disminueix l’activitat del complex IV de la cadena respiratòria. En conjunt aquests resultats suggereixen que la disminució de l’expressió de Mfn2 origina una disfunció del sistema de transport electrònic mitocondrial. També cal remarcar que els ratolins knockdown de Mfn2 presenten una major susceptibilitat a desenvolupar resistència a la insulina en resposta a l’envelliment o a una dieta rica en greixos. La disfunció mitocondrial i l’augment en la producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS) observats en el múscul esquelètic d’aquests ratolins podrien explicar aquesta major susceptibilitat. / Mitochondria are cellular organelles that play a fundamental role in many cellular functions, such as substrates oxidation, ATP production, apoptosis and calcium economy. Mitochondria are dynamic organelles that can fuse and divide; the balance between both processes is crucial for a correct mitochondrial function. The most relevant proteins described to date involved in the regulation of mitochondrial fusion are mitofusins 1 and 2 (Mfn1 and Mfn2, respectively) and OPA1. Substantial data indicates that Mfn2 is also a key regulator of cell cycle and mitochondrial metabolism. On the other hand, Mfn2 expression is reduced in skeletal muscle of obese subjects and type 2 diabetic patients, situations characterized by altered mitochondrial activity. Based on these observations, the main objective of this thesis was the study of the metabolic role of Mfn2 in skeletal muscle. We have studied the metabolic effects caused by the manipulation of Mfn2 expression in mice skeletal muscle in vivo. By means of DNA electrotransfer technologies, we have expressed a truncated Mfn2 mutant in skeletal muscle and we have also repressed endogenous Mfn2 expression with microRNAs. We have also generated a skeletal muscle Mfn2 knockout mouse model (Mfn2 KO). The expression of truncated Mfn2 mutant in tibialis stimulated glucose oxidation and increased the Respiratory Control Ratio (RCR). It also increased the expression of subunits Cox4 of OXPHOS complex IV and Atp5a1 of complex V. We observed these metabolic effects in absence of changes in mitochondrial content. The repression of Mfn2 in mice skeletal muscle caused a marked reduction in the expression of subunit Cox4 of OXPHOS complex IV, accompanied with a 20% of decrease in COX activity. In this case we neither observed differences in mitochondrial content. Skeletal muscle from Mfn2 KO mice showed a decrease in glucose oxidation and in the RCR. In addition, Mfn2 KO mice showed a higher susceptibility to develop insulin resistance in response to aging or a high fat diet. Mitochondrial dysfunction and the increased ROS production observed in skeletal muscle of these mice could explain this higher susceptibility.

It is widely known that HIV and ARV drugs trigger mitochondrial impairment in adults. However, their effects in perinatally-infected children have been poorly explored. For this reason, the main hypothesis of the present Thesis was to demonstrate that mitochondrial abnormalities are present in HIV-infected pediatric patients treated with ARV. It is expected to find mitochondrial alterations in asymptomatic perinatally HIV-infected children. This mitochondrial lesion, manifested in a depletion of the mitochondrial genome, would lead to a reduction of the mitochondrial protein synthesis or to a mitochondrial dysfunction and, as a last resort, compromising the cellular viability. However, it is also possible that the presence of homeostatic mechanisms in mitochondria entails a proper function of some complexes, even in the presence of mitochondrial genome depletion. Rather than a localized mitochondrial alteration in a specific enzymatic activity, it is possible that HIV and ARV cause a diffuse damage in the organelle which may be observed in a general assessment of the respiratory chain. In case of a mitochondrial alteration, either in asymptomatic or symptomatic patients, it would be expected a more evident presentation of mitochondrial toxicity in case of the latter. If our hypothesis of an evidence of mitochondrial toxicity derived from HIV and ARV in children is confirmed, we believe that, once the detrimental agent is withdrawn, a recover of the mitochondrial affectation is possible. Mitochondrial impairment may change depending on the type of HAART regimen, leading us to use mitochondrial parameters as a biomarker or a trail to find the best therapeutic options in the choice of different HAART schedules. In this context, the intensity of mitochondrial impairment over time would be higher in children receiving first generation NRTI which, in turn, have been demonstrated to present a higher mitochondrial toxicity in vitro, than those under second generation NRTI. In order to study and test our hypothesis, the main objectives of the present Thesis are: A) General Objective To test if HIV and ARV mechanisms of mitochondrial toxicity found in adults are present in perinatally HIV-infected children. B) Specific Objectives - Objective 1: To elucidate whether ARV treatment or HIV infection were exerting a mitochondrial toxic effect in asymptomatic perinatally HIV-infected pediatric patients receiving HAART. - Objective 2: To investigate if hypothetic alterations in the mitochondrial genome of asymptomatic HIV-infected children receiving ARV are downstream reflected at transcriptional, translational and functional levels. In case of mitochondrial dysfunction was present, to test whether MRC alterations are focalized or diffuse. - Objective 3: To determine mitochondrial status in lipodystrophic HIV-children and compare them to a group of asymptomatic children and to a group of uninfected controls. - Objective 4: To evaluate whether a 12-month interruption of ARV is able to improve or revert these hypothetic mitochondrial alterations at molecular and/or clinical level. - Objective 5: To compare mitochondrial toxicity derived from different HAART schedules in a longitudinal 2-year follow-up assessment of immunovirological and mitochondrial status under first or second generation NRTI. To elucidate whether those NRTI demonstrated to present high mitochondrial toxicity in vitro present a major toxicity in vivo as well.

El síndrome de Down constituye la cromosomopatía más frecuente que ocurre en uno de cada 700 a 1000 nacimientos y está causado por la trisomía completa o por una parte del cromosoma 21 humano (HSA21). Aún se desconoce cómo la presencia del cromosoma 21 extra da lugar al fenotipo característico de este síndrome. En este sentido la participación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) ha sido propuesta como uno de los mecanismos que intervienen en la patogénesis del mismo. Dicho mecanismo se fundamenta en la sobreexpresión de al menos 16 genes del HSA21 relacionados con el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y con la generación de energía mitocondrial. Uno de estos genes es el que codifica una importante enzima del sistema antioxidante celular, el gen SOD1, propuesto como potencial culpable del estrés oxidativo inusual en los individuos con SD. En condiciones normales, los ROS, producidos in vivo principalmente por la respiración aeróbica, se eliminan de la célula por la acción de las enzimas antioxidantes, superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx). La Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD1) convierte el radical superóxido a peróxido de hidrógeno, el cual es eliminado por la glutatión peroxidasa y/o catalasa a agua y oxígeno. La sobreexpresión de la SOD1 puede producir un desequilibrio en la relación de las enzimas antioxidantes (SOD1, GPx y CAT) generando estrés oxidativo y podría resultar en el daño oxidativo a biomoléculas tales como ácidos grasos poliinsaturados en los lípidos de las membranas, proteínas esenciales y el DNA, ya que existe una variabilidad en los niveles de enzimas antioxidantes dentro de la población con SD, lo que puede estar relacionado con una desregulación compleja que afecte no sólo a los genes del HSA21 sino también en otros cromosomas. Así, el daño celular puede ser inducido por los ROS y asociarse a algunas de las alteraciones celulares en el SD, causando diversas patologías y conducir a un envejecimiento prematuro. Se obtuvieron 18 muestras de fibroblastos primarios fetales humanos, 9 de ellos con síndrome de Down (FT21) y 9 controles (FC), en los cuales se evaluó la disminución de la capacidad endógena antioxidante debido a la sobreexpresión de la SOD1, causando un exceso en la producción intracelular de ROS y el origen prematuro de estrés oxidativo asociado al daño oxidativo a lípidos y proteínas, así como a una disfunción mitocondrial. Se analizaron varios marcadores de senescencia celular con la finalidad de contribuir al conocimiento de un nuevo aspecto de la patología de este síndrome, el envejecimiento prematuro. Estos mecanismos fisiopatológicos podrían estar relacionados con la aparición y establecimiento de la senescencia celular prematura en los fibroblastos con trisomía del cromosoma 21 (FT21). / Down syndrome is the most common chromosomal disorder that occurs in 1 in 700 to 1,000 births and is caused by trisomy full or part of human chromosome 21 (HSA21). It is still unknown how the presence of the extra chromosome 21 results in the phenotype of this syndrome. In this sense the involvement of reactive oxygen species (ROS) has been proposed as one of the mechanisms involved in the pathogenesis of same. This mechanism is based on the overexpression of at least 16 genes related HSA21 metabolism of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial energy generation. One of these genes encoding is an important cellular antioxidant enzyme system, the SOD1 gene, proposed as a potential culprit unusual oxidative stress in individuals with DS. Under normal conditions, the ROS produced in vivo mainly by aerobic respiration of the cells are removed by the action of antioxidant enzymes, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx). The Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) converts the superoxide radical to hydrogen peroxide, which is eliminated by glutathione peroxidase and/or catalase into water and oxygen. SOD1 overexpression can produce an imbalance in the ratio of antioxidant enzymes (SOD1, GPx and CAT) generating oxidative stress and may result in oxidative damage to biomolecules such as polyunsaturated fatty acids in the membrane lipids, proteins and essential DNA, since there is a variability in the levels of antioxidant enzymes in the DS population, which can be related to a complex deregulation affects not only Hsa21 genes but also on other chromosomes. Thus, cell damage can be induced by ROS and associated with some of the cellular changes in the DS, causing various diseases and lead to premature aging. Eighteen samples were obtained from primary human fetal fibroblasts, 9 with Down syndrome (TF21) and 9 normal (NF), which was evaluated in decreasing endogenous antioxidant capacity due to overexpression of the SOD1, causing excess in intracellular production of ROS and oxidative stress origin associated premature oxidative damage to lipids and proteins, as well as mitochondrial dysfunction. We analyzed several markers of cellular senescence in order to contribute to the knowledge of a new aspect of the pathology of this syndrome, premature aging. These pathophysiological mechanisms may be related to the emergence and development of premature cellular senescence in fibroblasts with trisomy 21 (FT21).