Hintergrund: Tumoren des zentralen Nervensystems zählen zu den seltenen Krebserkrankungen des Erwachsenenalters, aber haben eine vergleichsweise hohe Letalität. Bei allen Hirntumorerkrankungen inklusive der Hirnmetastasen bestehen zudem besondere Anforderungen aufgrund der intrakraniellen Lage hinsichtlich der chirurgischen Therapie. Eine Operation stellt meist eine Gratwanderung zwischen Tumorresektion und Schädigung des umgebenden Hirnparenchyms dar. Da maligne Hirntumoren das umgebende Hirngewebe infiltrieren, ist die optische und taktile Unterscheidung insbesondere von Gliomen und deren Infiltrationsrändern vom umgebenden Hirnparenchym durch Operierende aber nicht sehr sensitiv. Da der Residualtumor den größten prädiktiven Faktor des Patient:innen-Überlebens darstellt, wird klar, dass sensitive Methoden entwickelt werden müssen, um es Operierenden zu erleichtern, intraoperativ Residualtumor zu erkennen und zu resezieren. Neben den bereits etablierten Verfahren der intraoperativen Bildgebung wie der Neuronavigation, der intraoperativen MRT oder der 5-ALA-Fluoreszenzmikroskopie, ist die schnitt- und färbefreie Technik der Raman-Spektroskopie in den letzten Jahren zur Unterscheidung von Tumor und Hirnparenchym sowie zur Erkennung von infiltrativ wachsenden Tumoren hervorgetreten. Die Raman-Spektroskopie basiert auf der Detektion von inelastisch gestreutem Licht an Molekülen im Sinne des Raman-Effekts. So kann in Sekundenschnelle eine biochemische Signatur des untersuchten Gewebes erstellt werden. Darüber hinaus stellt die Raman-Spektroskopie ein Autofluoreszenzspektrum bereit, welches ebenso zur Analyse von Gewebe benutzt werden kann. Fragestellung: Aufgrund der Notwendigkeit einer besseren intraoperativen Visualisierung von Tumorgewebe in der Neurochirurgie, soll in dieser Arbeit das Potenzial der intraoperativen in-situ-Raman-Spektroskopie beurteilt werden. Neben den intraoperativ erhobenen Ramanspektren, sollen insbesondere die oft unbeachteten Autofluoreszenzeigenschaften von Tumor und umliegendem Gewebe auf mögliche Unterschiede genauer untersucht werden. Einerseits soll aufgrund der fehlenden Erfahrung mit der kommerziell erhältlichen fiberoptischen Sonde die spektrale Qualität untersucht werden sowie Validität und Reliabilität des Messsystems beurteilt werden. Für einen intraoperativen Einsatz muss andererseits die Prozedur der Sterilisation entwickelt sowie die Integration in bestehende Arbeitsabläufe und Störfaktoren bei Messungen im Operationssaal bewertet werden.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII Symbolverzeichnis IX 1 Einleitung 1 1.1 Hintergrund 1 1.2 Intraoperative Bildgebung 2 1.2.1 Neuronavigation 2 1.2.2 Intraoperative MRT 3 1.2.3 5-ALA-Fluoreszenz-gestützte Resektion 3 1.2.4 Raman-Spektroskopie 4 1.3 Motivation des Projektes 6 2 Material und Methoden 7 2.1 Gewebe 7 2.2 Histologie 7 2.2.1 Fixierung und Einbettung 7 2.2.2 Gefrierschnitte 8 2.2.3 Färbungen 8 2.2.4 Bestimmung der Zellzahl und des Proliferationsindex 11 2.3 Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 12 2.3.1 Aufbau des faserbasierten Messsystems 12 2.3.2 Faserbasierte Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 14 2.3.3 Referenz-Raman-Spektroskopie mit mikroskopischem System 17 2.4 Datenverarbeitung und -aufbereitung 17 2.4.1 Bestimmung der Autofluoreszenzintensität 18 2.4.2 Prozessierung des Rohspektrums 18 2.4.3 Ramanbandenintensität 19 2.4.4 Statistische Analyse 19 2.4.5 Clusteranalyse 19 3 Ergebnisse 20 3.1 Testung des faserbasierten Messsystems und Etablierung von Messprotokollen 20 3.1.1 Qualitative Beurteilung des Spektrums 20 3.1.2 Artefaktelimination 24 3.1.3 Festlegung optimaler Messparameter 27 3.1.4 Messtiefe 30 3.2 Ex-vivo-Autofluoreszenz und Raman-Spektroskopie 31 3.2.1 Autofluoreszenzintensität 32 3.2.2 Ramanspektren 35 3.3 Intraoperative in-situ-Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 47 3.3.1 Sondenaufbereitung 47 3.3.2 Evaluation der Signalstärke nach 9, 16, 21 und 31 vollständigen Wiederaufbereitungszyklen 47 3.3.3 Spektrale Qualität im Operationssaal 48 3.3.4 Analyse der Spektren 53 3.3.5 Histopathologie 63 3.3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse 64 3.3.7 Darstellung ausgewählter Patient:innen 66 4 Diskussion 74 4.1 Testung des faserbasierten Messsystems und Etablierung von Messprotokollen 74 4.2 Ex-vivo-Autofluoreszenz und Raman-Spektroskopie 79 4.3 Intraoperative in-situ-Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 81 4.4 Schlussfolgerung 89 5 Zusammenfassung 91 6 Summary 95 Literaturverzeichnis X Danksagungen XVIII Anhang XIX / :Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII Symbolverzeichnis IX 1 Einleitung 1 1.1 Hintergrund 1 1.2 Intraoperative Bildgebung 2 1.2.1 Neuronavigation 2 1.2.2 Intraoperative MRT 3 1.2.3 5-ALA-Fluoreszenz-gestützte Resektion 3 1.2.4 Raman-Spektroskopie 4 1.3 Motivation des Projektes 6 2 Material und Methoden 7 2.1 Gewebe 7 2.2 Histologie 7 2.2.1 Fixierung und Einbettung 7 2.2.2 Gefrierschnitte 8 2.2.3 Färbungen 8 2.2.4 Bestimmung der Zellzahl und des Proliferationsindex 11 2.3 Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 12 2.3.1 Aufbau des faserbasierten Messsystems 12 2.3.2 Faserbasierte Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 14 2.3.3 Referenz-Raman-Spektroskopie mit mikroskopischem System 17 2.4 Datenverarbeitung und -aufbereitung 17 2.4.1 Bestimmung der Autofluoreszenzintensität 18 2.4.2 Prozessierung des Rohspektrums 18 2.4.3 Ramanbandenintensität 19 2.4.4 Statistische Analyse 19 2.4.5 Clusteranalyse 19 3 Ergebnisse 20 3.1 Testung des faserbasierten Messsystems und Etablierung von Messprotokollen 20 3.1.1 Qualitative Beurteilung des Spektrums 20 3.1.2 Artefaktelimination 24 3.1.3 Festlegung optimaler Messparameter 27 3.1.4 Messtiefe 30 3.2 Ex-vivo-Autofluoreszenz und Raman-Spektroskopie 31 3.2.1 Autofluoreszenzintensität 32 3.2.2 Ramanspektren 35 3.3 Intraoperative in-situ-Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 47 3.3.1 Sondenaufbereitung 47 3.3.2 Evaluation der Signalstärke nach 9, 16, 21 und 31 vollständigen Wiederaufbereitungszyklen 47 3.3.3 Spektrale Qualität im Operationssaal 48 3.3.4 Analyse der Spektren 53 3.3.5 Histopathologie 63 3.3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse 64 3.3.7 Darstellung ausgewählter Patient:innen 66 4 Diskussion 74 4.1 Testung des faserbasierten Messsystems und Etablierung von Messprotokollen 74 4.2 Ex-vivo-Autofluoreszenz und Raman-Spektroskopie 79 4.3 Intraoperative in-situ-Autofluoreszenz- und Raman-Spektroskopie 81 4.4 Schlussfolgerung 89 5 Zusammenfassung 91 6 Summary 95 Literaturverzeichnis X Danksagungen XVIII Anhang XIX

Ce travail porte sur le développement d’une nouvelle technique de diagnostic associant la résonance magnétique à haute résolution spatiale à la spectroscopie optique d’autofluorescence et de réflectance. La mise au point d’une telle sonde endoluminale bimodale s’inscrit dans les recherches de méthodes complémentaires ou alternatives à l’endoscopie conventionnelle pour le diagnostic précoce des pathologies du tube digestif. En effet le cancer colorectal représente aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique avec plus de 1,2 millions de cas diagnostiqués dans le monde sachant que le taux de survie à 5 ans d’un patient est actuellement de 94% dans le cas de lésions détectées à un stade précoce (stade I) et seulement de 8% à un stade tardif (stade IV). Dans la première partie du manuscrit, nous abordons les différentes modalités d’imagerie et d’analyse spectrale en cours de développement ou d’évaluation, en mettant l’accent sur les principes physiques utilisés en RMN et spectroscopie optique. Dans une deuxième partie, nous détaillons la conception et la réalisation de prototypes de sondes endoluminales ainsi que les bancs optiques associés. Nous traitons également de la mise en oeuvre de dispositifs d’acquisition ainsi que des méthodes d’analyse de données au moyen de programmes informatiques dédiés. Dans une dernière partie, le système bimodal est caractérisé et validé lors d’études sur fantômes et une étude in vivo sur lapin. Les images obtenues par RM, fournissant l’information morphologique des échantillons ou du tissu, et les spectres optiques liés à leur composition sont corrélés / The main aim of this work is the development of a new diagnostic technique combining high spatial resolution MRI to autofluorescence and reflectance spectroscopy through the conception of a bimodal endoluminal probe. Such a technique falls within the framework of alternative innovative techniques to conventional colonoscopy that would allow better sensitivity to early stage digestive pathologies. Colorectal cancer is today a major health issue worldwide with more than 1.2 million cases diagnosed each year bearing the fact that the 5 year survival rate is 94% when precancerous lesions are diagnosed at an early stage (stage I) and only 8% when diagnosed at an advanced stage (stage IV). The promising imaging and spectral analysis techniques under investigation or undergoing clinical evaluation in different parts of the world are presented in the first chapter of this manuscript along with the basic physics involved in magnetic resonance imaging and optical spectroscopy. Chapter 2 gives a detailed description of the work carried out in devising and conceiving different endoluminal bimodal probe prototypes along with the dedicated optical test benches. Dedicated data processing and visualisation programmes developed are also presented within this chapter. The final chapter of this work deals with the different studies carried out in-vitro on different phantoms and in-vivo on a rabbit. Morphological information obtained through the MR images are also correlated to the biochemical information through the autofluorescence and reflectance spectra