Stuttgart, Univ., Diss., 2006.

HSPB8 appartient à la famille des petites protéines de choc thermique (sHSP ou HSPB) qui contient 10 membres HSPB 1-10. In vitro, HspB8 favorise la dégradation de l'Huntingtine mutée (Htt43Q), une protéine encline à agréger. HspB8 est un chaperon moléculaire capable de reconnaître des substrats protéiques mal repliés pour permettre leur repliement ou leur dégradation. HspB8 forme un complexe stable et stoechiométrique avec Bag3 (2 : 1), un cochaperon de Hsp70. Surexprimées, Bag3 et/ou HspB8 induisent la conversion de LC3-I en LC3-II indiquant que la macroautophagie est stimulée et bloquent l'agrégation de Htt43Q. Nous avons cherché dans cette étude, à déterminer si la formation du complexe HspB8-Bag3 est essentielle dans l'accomplissement de ce phénomène. Bag3 possède un domaine WW peu caractérisé, un domaine riche en proline capable d'interagir avec PLCy l , et un domaine BAG interagissant avec Hsp70 et Bcl-2. Le co-chaperon Bag3 étant modulaire, nous avons recherché quels domaines d'interaction fonctionnels lui sont essentiels. Afin de localiser le site de liaison à HspB8, nous avons réalisé des délétions systématiques des différentes régions de Bag3. L'interaction des différents délétants de 6His-Bag3 avec HspB8 a été analysée par co-puri fi cation au Nickel. Leur capacité à bloquer l'accumulation de Htt43Q dans les fractions solubles et insolubles au SDS et à augmenter le ratio LC3-II/I, marqueur de l'autophagie, a été évaluée. Nous avons déterminé que le site de liaison à HspB8 était constitué de deux motifs répétés de 14 acides aminés très conservés (B8bdl et B8bd2) depuis le poisson jusqu'à l'Homme. Dans les HEK-293T, en l'absence d'interaction avec HspB8, Bag3 est toujours capable de stimuler la macroautophagie et la dégradation de Htt43Q, bien qu'aucune activité de chaperon moléculaire ne lui soit associée in vitro. L'analyse des autres délétants suggère que l'extrémité N-terminale ainsi que la région riche en proline seraient essentielles pour l'activité de Bag3 envers Htt43Q, bien qu'elles ne le seraient pas pour stimuler la macroautophagie. Le domaine C-terminal de Bag3 serait responsable de la stimulation de la macroautophagie et sa délétion bloquerait aussi la dégradation de Htt43Q. La protéine Bag3, en permettant la dégradation des protéines mal conformées (comme Htt43Q) par macroautophagie, jouerait un rôle prépondérant dans le contrôle de la qualité des protéines.

La fabrication du Cheddar repose sur plusieurs facteurs, le choix du ferment est l’un des plus déterminants pour la formation du caillé. Les ferments utilisés peuvent être des mélanges de souches, qui n’ont pas toutes les mêmes performances, ce qui entrainent une grande variation dans la qualité du fromage obtenu. L’objectif de cette étude est d’examiner chez 19 souches de Lactococcus lactis ssp. cremoris, certaines caractéristiques d’intérêt technologique tel que l’acidification, la protéolyse et l’autolyse afin d’évaluer leur potentiel pour un éventuel usage dans des ferments dans le but d’optimiser la qualité du fromage avec des caractéristiques constantes. Le test de Pearce est utilisé pour se rapprocher le plus des conditions fromagères. À la suite de ce test, les activités enzymatiques (protéolytique et autolytique) ont été mesurées. L’activité autolytique varie de 424 mU/ml pour la souche 73 à 47 mU/ml pour la souche 83. Pour l’activité protéolytique, on a utilisé deux substrats, MS-Arg et S-Glu. Deux souches (SK11 et E2) se sont distinguées par une activité S-Glu (2,81 et 4,40 mU/ml) plus élevée que Ms-Arg (0 et 0,55mU/ml) dans un tampon sans le NaCl, alors que pour les autres souches, l’activité d’hydrolyse de Ms-Arg était supérieure. La souche E2 a la meilleure activité PepN (14,43 mU/ml) alors que ce sont les souches 83 et E2 qui ont la plus forte activité PepX (40,01 et 20,29 mU/ml). En se basant sur ces résultats, 12 ferments constitués de 3 souches ont été formulés. Les paramètres recherchés pour avoir un ferment considéré comme idéal sont une production d'acide lactique rapide, une activité peptidasique sans génération d'amertume et une capacité d'autolyse dans le fromage. Dans cette étude, une méthode simple et rapide est utilisèe pour caractériser les activités enzymatiques des souches, qui pourrait être utilisée par l’industrie et les résultats obtenus pourraient servir à l’élaboration de nouveaux ferments. / The manufacture of Cheddar is based on several factors; the choice of the ferment is one of the most determining factors for the formation of the curd. The ferments used may be mixtures of strains, which do not all have the same performance, which results in a large variation in the quality of the cheese obtained. The objective of this study was to examine 19 strains of Lactococcus lactis ssp. cremoris, certain characteristics of technological interest such as acidification, proteolysis and autolysis in order to evaluate their potential for eventual use in ferments in order to optimize the quality of the cheese with constant characteristics. The Pearce test is used to get closer to cheese conditions by following a temperature diagram specific to the manufacture of Cheddar. Following this test, enzymatic activities (proteolytic and autolytic) were measured. Autolytic activity varies from 424 mU / ml for strain 73 to 47 mU / ml for strain 83. For proteolytic activity, two substrates, MS-Arg and S-Glu, were used. Two strains (SK11 and E2) were distinguished by higher S-Glu activity (2.81 and 4.40 mU / ml) than Ms-Arg (0 and 0.55 mU / ml) in buffer without NaCl, whereas for the other strains the Ms-Arg hydrolysis activity was greater. The E2 strain has the best PepN activity (14.43 mU / ml) whereas strains 83 and E2 have the highest PepX activity (40.01 and 20.29 mU / ml). Based on these results, 12 ferments consisting of 3 strains were formulated. The desired parameters for a ferment considered as ideal are a rapid lactic acid production, a peptidase activity without generation of bitterness and an autolysis capacity in the cheese. In this study, a simple and rapid method was used to characterize the enzymatic activities of the strains, which could be used by the industry and the results obtained, could be used to develop new ferments.

La saveur sucrée est à l’origine de l’équilibre gustatif des vins secs. On observe uneaugmentation de son intensité au cours de la macération post-fermentaire et de l’élevage enbarrique. Nous montrons que ces phénomènes sont respectivement liés à la libération depeptides de la levure et de composés non-volatils du bois de chêne dans les vins.Le rôle de la protéine Hsp12 de S. cerevisae sur le gain de sucrosité est établi enutilisant des techniques de biologie moléculaire et d’analyse sensorielle.Le développement d’un couplage chromatographie de partage centrifuge –gustatométrie permet de fractionner un extrait de bois de chêne et de purifier plusieurscomposés sapides. L’utilisation de la LC-FT/MS et de la RMN nous a permis d’identifierquatre nouvelles molécules, appelées quercotriterpénosides (QTT), deux d’entre elles (QTTI et III) possédant une saveur douce. Les seuils de perception du QTT I et d’un lignane amer,le lyonirésinol, sont respectivement 590 μg/L et 1.52 mg/L.La mise au point d’une méthode de quantification de ces composés en LC-FT/MS nous apermis de démontrer l’impact organoleptique du lyonirésinol dans les vins.Il est probable que les QTT I et III contribuent, directement ou indirectement, au gain desucrosité conféré par le bois de chêne. / Sweetness contributes to the balance in taste of dry wines. An increase in sweet taste isobservable during post-fermentation maceration and oak-barrel aging. We have revealed thatthese phenomena are respectively due to the release in wines of yeast peptides and nonvolatileoak wood compounds.The role of Hsp12 protein from S.cerevisae on the increase in sweetness is establishedwith both molecular biology and sensorial analysis techniques.The development of a method coupling centrifugal partition chromatography andgustatometry has enabled us to fractionate an oak-wood extract and to purify several sapidcompounds. Thanks to both the LC-FTMS and the NMR spectroscopy methods, we havehighlighted four new molecules, called quercotriterpenosides (QTT), out of which QTT Iand III are responsible for a sweet taste. The perception thresholds of QTT I and a bitterlignan, lyoniresinol, are respectively 590 μg/L and 1.52 mg/L.LC-FT/MS method has been used to develop a quantification method for these compoundsand we have demonstrated the organoleptic impact of lyoniresinol in wines.QTT I and III are likely to contribute, directly or indirectly, to the increase in sweetnessconsecutive to barrel aging in dry wines.

Die Entwicklung einer mukosal verabreichbaren, effektiven DNA-Vakzine gegen Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen auf der Basis invasiver attenuierter Bakterien ist eine vielversprechende Alternative zu bisherigen parenteralen Strategien der genetischen Vakzinierung. Innerhalb dieser Arbeit wurden Salmonellen-Impfstämme für die orale Übertragung eines eukaryontischen Expressionsplasmids mit dem kleinen Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus (HBsAg) als Modellantigen optimiert. Die kontinuierliche Sezernierung von Plasmiden als filamentöse Phagenpartikel wurde als ein erster Ansatz getestet, um mit lebenden Bakterien eine DNA-Vakzine innerhalb infizierter Zellen freizusetzen. Die Salmonellen-vermittelte Phagensekretion in der Wirtszelle ist jedoch nicht effizient genug, die Expression des Transgens zu vermitteln. Alternativ wurde ein Ansatz gewählt, durch eine spontan induzierte Lyse der Impfbakterien, Plasmid-DNA in die Wirtszelle zu übertragen. Dazu wurde ein neuartiges bakterielles Autolysesystem etabliert, basierend auf einem Zwei-Phasen-Expressionssystem und von Bakteriophagen abgeleiteten Lysedeterminanten. Dieses System ermöglicht erstmals die kontinuierliche Freisetzung von Plasmid-DNA und Proteinen aus einzelnen, lysierenden Salmonellen innerhalb einer sonst gesunden bakteriellen Gesamtpopulation. Innerhalb infizierter COS7-Zellen führt die Freisetzung des porenformierenden Proteins Listeriolysin O durch autolytische Salmonellen zur Zerstörung der Vakuole, in der die Impfbakterien replizieren, und erleichtert somit den Transfer der Plasmid-DNA aus den Bakterien in das Zytoplasma der Wirtszelle. Die Lysedeterminante und die eukaryontische Expressionskassette für HBsAg wurden auf einem Plasmid kombiniert, sowie eine Kassette zur konstitutiven Expression des Histon-ähnlichen Proteins aus Thermotoga maritima (TmHU) in ein solches Konstrukt integriert. TmHU stabilisiert die Plasmiderhaltung unter nicht selektiven Bedingungen und besitzt das Potential, die Effizienz der DNA-Translokation innerhalb der Wirtszelle zu erhöhen. Durch die orale Gabe optimierter autolytischer Impfbakterien konnte eine potente HBsAg-spezifische Antikörperantwort sowie eine zytotoxische zelluläre Antwort induziert werden. Bereits die einmalige Gabe der autolytischen Bakterien induzierte eine höhere antigenspezifische Antikörperantwort, als die herkömmliche intramuskuläre DNA-Vakzine. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Konzept autolytischer Salmonellen stellt also eine neuartige, effiziente Strategie für den mukosalen DNA-Transfer dar. Die Übertragung des Konzeptes der Autolyse auf andere bakterielle Trägersysteme ist möglich und kann zur Erweiterung des Anwendungspektrums bakterieller Vektoren beitragen. / The development of an effective mucosal DNA vaccine against infectious diseases or tumors based on invasive attenuated bacteria is a very promising alternative to common parenteral routes of genetic vaccination. This work aimed at the optimization of Salmonella vaccine strains for the oral delivery of an eukaryotic expression plasmid encoding the small Hepatitis B Virus surface antigen (HBsAg), here used as model antigen. The continuous secretion of plasmids as filamentous phage particles was first tested as a mean for the delivery of the DNA vaccine by living bacteria inside infected host cells. However, Salmonella-mediated phage secretion inside cells did not suffice for the induction of transgene expression. As alternative approach, inducible spontanous lysis of bacteria was used to mediate the release of plasmid DNA into host cells. For this purpose a novel bacterial autolytic system was established on the basis of a two-phase expression system and lysis determinants derived from bacteriophages. This system allows for the first time the continuous release of plasmid DNA and proteins from only few lysing Salmonella within an otherwise healthy bacterial population. Inside COS7 cells the release of the pore-forming protein listeriolysin O by autolytic Salmonella mediates the destruction of the Salmonella-harbouring vacuole, thereby facilitating the transfer of plasmid DNA from bacteria into the host cell cytoplasm. The lysis determinant was combined with the eukaryotic expression cassette for HBsAg on one plasmid. In addition, a cassette for the constitutive expression of TmHU, a histon-like protein derived from Thermotoga maritima, was integrated in such vector. TmHU stabilizes the plasmid propagation in the absence of selective pressure and has the potential to increase the efficiency of plasmid translocation inside the host cell. The oral administration of the optimized autolytic bacteria stimulated a potent HBsAg-specific antibody response as well as a cytotoxic cellular response. Already a single inoculation of the oral vaccine induced a higher specific antibody response than the conventional intramuscular DNA vaccine. Therefore the concept of autolytic Salmonella carrier strains developed in this work constitutes a novel efficient strategy for mucosal DNA delivery. The transfer of this concept to other bacterial carriers is possible and may widen the application field for bacterial vectors.