L'autophagie est un processus permettant la dégradation de constituants cytosoliques dans un compartiment lytique, par leur séquestration au sein d'une vésicule à double membrane : l'autophagosome. L'autophagie est, avec la voie ubiquitine-protéasome, l'une des deux grandes voies de dégradation présente de manière fortement conservée chez les cellules eucaryotes. Présente à un niveau basal, elle peut être stimulée afin de permettre la remobilisation de ressources cellulaires, ou d'assurer des fonctions cytoprotectrices et de détoxification. La formation d'autophagosomes traduit alors la capacité du système endomembranaire à s'adapter aux besoins cellulaires. Cependant, la mécanique membranaire et moléculaire de ce phénomène reste mal comprise. L'objectif de ce travail de thèse était de mieux comprendre la formation de ce compartiment dans la cellule végétale. Pour cela, nous avons tout d'abord mis au point les conditions propices à l'étude de l'autophagie dans la racine d’Arabidopsis thaliana, puis nous avons entrepris l'identification de marqueurs des étapes de formation de l'autophagosome. L'étude par imagerie en temps réel et 3D de la protéine ATG5, impliquée dans l’expansion membranaire, nous a permis de mettre en évidence son recrutement transitoire sur un domaine particulier de l'autophagosome en formation, son ouverture. De plus, l'étude de différents acteurs du système endomembranaire, nous a permis de mettre en évidence et de caractériser l'implication du réticulum endoplasmique et de ATG9, pour aboutir à un modèle de la formation de l'autophagosome chez les plantes. / Autophagy is a catabolic process targeting cytosolic compounds to the lytic compartment after sequestration within a double membrane bound vesicle: the autophagosome. Along with the ubiquitin-proteasome pathway, autophagy is one of the main catabolic processes conserved among eukaryotic cells. Present at a basal level, it can be stimulated to allow: remobilization of cell resources, cytoprotective functions, and detoxification. Autophagosome formation demonstrates the capacity of the endomembrane system to adapt dynamically to the cell's environment. However, the membrane and molecular processes involved are still poorly understood. This work aimed to advance understanding of autophagosome formation in plant cells. First of all, we set up suitable conditions for the study of autophagy in the Arabidopsis root, then we identified markers of the autophagosome formation steps. Live and 3D imaging of the ATG5 protein, involved in membrane expansion, demonstrated its transient recruitment to a specific domain of the forming autophagosome, its aperture. Furthermore, studying different actors of the endomembrane system has allowed us to implicate the endoplasmic reticulum and ATG9, and to establish a model for autophagosome formation in plants.

Autophagy, referring to macroautophagy, is an evolutionarily conserved degradation pathway. Through autophagy cells can degrade damaged organelles, lipid vesicles and misfolded protein aggregates with implications in various pathological conditions, including neurodegenerative diseases, cancers, and infectious diseases. Autophagy is one of the major intracellular membrane-trafficking processes and its morphology includes the initiation, maturation, transportation and degradation of autophagosomes, where the double-membrane autophagosomes package the cargo for degradation. Therefore, understanding how autophagosomes form and are regulated is important in this field. Here we conducted a genome-wide siRNA screen using a high-throughput imaging system to identify undiscovered regulators in autophagosome formation. In this study, HEK293 cells stably expressing GFP-DFCP1 (GFP-tagged zinc finger FYVE-type containing 1) were used and amino acid starvation was used to induce autophagy. After the first round of primary screening, a small-scale screen was conducted with the same conditions including 384 candidates and additionally with these candidates HEK293 cells stably expressing GFPLC3 (GFP-tagged microtubule associated protein 1 light chain 3) were used to monitor the late steps of the autophagy process. From these rounds of screening, 39 candidates were selected and validated by investigating early autophagosome markers for their effects on autophagosome formation. Finally, five of the best candidates were confirmed based on their depletion effects on autophagy. Among these five candidates, DCAKD (dephospho-CoA kinase domain containing), WDR91 (WD repeat domain 91) and WDR65 were further investigated. Preliminary data using both RNAi and CRISPR Cas9 showed that DCAKD affected the accumulation of some early autophagy markers on initiation membranes in autophagosome formation. Interestingly, protein levels of canonical autophagy markers remained unchanged in DCAKD-deficient cells. Another candidate WDR91 showed the ability to mediate endosomal and lysosomal PtdIns3P and mildly affect autophagy initiation. WDR65 also inhibited early autophagy events. However, the detailed mechanism for these proteins are yet to be determined. In summary, our work provided more understanding on the egulation of autophagosome formation, as well as a list of potentially novel regulators.

In 2008, we published the first set of guidelines for standardizing research in autophagy. Since then, this topic has received increasing attention, and many scientists have entered the field. Our knowledge base and relevant new technologies have also been expanding. Thus, it is important to formulate on a regular basis updated guidelines for monitoring autophagy in different organisms. Despite numerous reviews, there continues to be confusion regarding acceptable methods to evaluate autophagy, especially in multicellular eukaryotes. Here, we present a set of guidelines for investigators to select and interpret methods to examine autophagy and related processes, and for reviewers to provide realistic and reasonable critiques of reports that are focused on these processes. These guidelines are not meant to be a dogmatic set of rules, because the appropriateness of any assay largely depends on the question being asked and the system being used. Moreover, no individual assay is perfect for every situation, calling for the use of multiple techniques to properly monitor autophagy in each experimental setting. Finally, several core components of the autophagy machinery have been implicated in distinct autophagic processes (canonical and noncanonical autophagy), implying that genetic approaches to block autophagy should rely on targeting two or more autophagy-related genes that ideally participate in distinct steps of the pathway. Along similar lines, because multiple proteins involved in autophagy also regulate other cellular pathways including apoptosis, not all of them can be used as a specific marker for bona fide autophagic responses. Here, we critically discuss current methods of assessing autophagy and the information they can, or cannot, provide. Our ultimate goal is to encourage intellectual and technical innovation in the field.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20566号 / 医博第4251号 / 新制||医||1022(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 竹内 理, 教授 小柳 義夫, 教授 秋山 芳展 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

L'autophagie est un processus permettant la dégradation de constituants cytosoliques dans un compartiment lytique, par leur séquestration au sein d'une vésicule à double membrane : l'autophagosome. L'autophagie est, avec la voie ubiquitine-protéasome, l'une des deux grandes voies de dégradation présente de manière fortement conservée chez les cellules eucaryotes. Présente à un niveau basal, elle peut être stimulée afin de permettre la remobilisation de ressources cellulaires, ou d'assurer des fonctions cytoprotectrices et de détoxification. La formation d'autophagosomes traduit alors la capacité du système endomembranaire à s'adapter aux besoins cellulaires. Cependant, la mécanique membranaire et moléculaire de ce phénomène reste mal comprise. L'objectif de ce travail de thèse était de mieux comprendre la formation de ce compartiment dans la cellule végétale. Pour cela, nous avons tout d'abord mis au point les conditions propices à l'étude de l'autophagie dans la racine d'Arabidopsis thaliana, puis nous avons entrepris l'identification de marqueurs des étapes de formation de l'autophagosome. L'étude par imagerie en temps réel et 3D de la protéine ATG5, impliquée dans l'expansion membranaire, nous a permis de mettre en évidence son recrutement transitoire sur un domaine particulier de l'autophagosome en formation, son ouverture. De plus, l'étude de différents acteurs du système endomembranaire, nous a permis de mettre en évidence et de caractériser l'implication du réticulum endoplasmique et de ATG9, pour aboutir à un modèle de la formation de l'autophagosome chez les plantes.

The exocyst, an octameric protein complex conserved among all eukaryotes, mediates tethering of the vesicle prior to its fusion with the target membrane. Apart from the function of exocyst in exocytosis, new studies from both mammalian and plant fields report its involvement in the cellular self-eating process called autophagy. In land plants the number of paralogs of some exocyst subunits is extraordinarily large. There are 23 paralogs of Exo70 subunit in Arabidopsis thaliana. It is supposed that these paralogs have acquired functional specialization during the evolution - including involvement in autophagy. Using yeast two- hybrid assay it is shown here that Exo70B1 and Exo70B2, but not other Arabidopsis Exo70 paralogs interact with Atg8, an autophagosomal marker. The proximity of these two paralogs and Atg8 in vivo was confirmed by independent Förster resonance energy transfer (FRET) method. Interestingly, interaction of Atg8f with Exo70B2 paralog appears to be stronger than with Exo70B1. Exo70B1-mRUBY expressed under the natural promoter shows punctate membrane structures that are mostly static. That changes after the tunicamycin treatment - movement of some of these dots was induced. Homology modeling of Exo70B1 and Exo70B2 proteins tertiary structure in combination with bioinformatic prediction based...

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique. / Autophagy is a catabolic cellular process that has been conserved during evolution from yeast to humans. More specifically, it consists of the degradation of cytoplasmic components within a lytic structure, the lysosome. There are at least three distinct types of autophagy; microautophagy, chaperone-mediated-autophagy, and macroautophagy wich often referred to simply as “autophagy” in the literature. It has been shown that during this type of autophagy, cytoplasmic material (cytosolic proteins and organites) are sequestrated in autophagosomes which fuse with lysosomes, forming autophagolysosomes where the sequestered material and the internal membrane of the autophagosomes are degraded by lysosomal hydrolases. Many studies have focused on understanding the molecular machinery and mechanism of autophagy. It has been shown that 31 autophagy proteins (Atg) are implicated and essential in the autophagic process. More importantly, the identification of these proteins has permitted the discovery of the role of autophagy not only in the maintenance of cellular homeostasis but also in host defense against pathogenic agents. Autophagy plays an important role in innate immunity by clearing and destroying intracellular pathogens like bacteria and viruses. Autophagy is also implicated in adaptive immunity, by promoting the presentation of viral antigens on CMH class II molecules to CD4+ T cells. A recent study has shown that autophagy also contributes to antigen presentation on CMH class I molecules to CD8+ T cells during infection with Herpes simplex virus type 1 (HSV-1). Certain viruses including herpes viruses have developed mechanisms to inhibit autophagy. Interestingly, a recent study in our lab revealed the presence of a new autophagic structure that occured during the late phase of viral infection of BMA macrophages with HSV-1. These structures are different from the classic double membrane autophagosomes, and are morphologically characterized by four membranes emerging from the inner and outer nuclear envelope. Very little was known about this novel nuclear-membrane autophagy pathway, which might function as a cellular defense mechanism when classic autophagy in the cytosol is inhibited by the virus. It is therefore of great interest to characterize the proteins involved in the formation of these autophagosomes from the nucleus by mass spectrometry. In order to do so, it was imperative to establish a protocol for the isolation of nuclei from HSV-1 infected macrophages which carry nuclear autophagosomes on their envelope. The validation of this isolation method was carried out by determining the purity of isolated nuclei in uninfected (mock) and infected macrophages. The purity of isolated nuclei was characterized by the absence of cellular contaminants derived from other cellular organites and enrichment in nuclei. Moreover, the kinetic of autophagosome formation on the nuclei during infection had to be determined for the two macrophage cell lines used during this project. As a future perspective, a proteomic analysis of pure samples of isolated nuclei (uninfected and infected) should identify proteins implicated in the formation of autophagosomes derived from the nuclei, and thus allow further studies of the molecular mechanism and functions of this novel autophagy pathway.

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique. / Autophagy is a catabolic cellular process that has been conserved during evolution from yeast to humans. More specifically, it consists of the degradation of cytoplasmic components within a lytic structure, the lysosome. There are at least three distinct types of autophagy; microautophagy, chaperone-mediated-autophagy, and macroautophagy wich often referred to simply as “autophagy” in the literature. It has been shown that during this type of autophagy, cytoplasmic material (cytosolic proteins and organites) are sequestrated in autophagosomes which fuse with lysosomes, forming autophagolysosomes where the sequestered material and the internal membrane of the autophagosomes are degraded by lysosomal hydrolases. Many studies have focused on understanding the molecular machinery and mechanism of autophagy. It has been shown that 31 autophagy proteins (Atg) are implicated and essential in the autophagic process. More importantly, the identification of these proteins has permitted the discovery of the role of autophagy not only in the maintenance of cellular homeostasis but also in host defense against pathogenic agents. Autophagy plays an important role in innate immunity by clearing and destroying intracellular pathogens like bacteria and viruses. Autophagy is also implicated in adaptive immunity, by promoting the presentation of viral antigens on CMH class II molecules to CD4+ T cells. A recent study has shown that autophagy also contributes to antigen presentation on CMH class I molecules to CD8+ T cells during infection with Herpes simplex virus type 1 (HSV-1). Certain viruses including herpes viruses have developed mechanisms to inhibit autophagy. Interestingly, a recent study in our lab revealed the presence of a new autophagic structure that occured during the late phase of viral infection of BMA macrophages with HSV-1. These structures are different from the classic double membrane autophagosomes, and are morphologically characterized by four membranes emerging from the inner and outer nuclear envelope. Very little was known about this novel nuclear-membrane autophagy pathway, which might function as a cellular defense mechanism when classic autophagy in the cytosol is inhibited by the virus. It is therefore of great interest to characterize the proteins involved in the formation of these autophagosomes from the nucleus by mass spectrometry. In order to do so, it was imperative to establish a protocol for the isolation of nuclei from HSV-1 infected macrophages which carry nuclear autophagosomes on their envelope. The validation of this isolation method was carried out by determining the purity of isolated nuclei in uninfected (mock) and infected macrophages. The purity of isolated nuclei was characterized by the absence of cellular contaminants derived from other cellular organites and enrichment in nuclei. Moreover, the kinetic of autophagosome formation on the nuclei during infection had to be determined for the two macrophage cell lines used during this project. As a future perspective, a proteomic analysis of pure samples of isolated nuclei (uninfected and infected) should identify proteins implicated in the formation of autophagosomes derived from the nuclei, and thus allow further studies of the molecular mechanism and functions of this novel autophagy pathway.

La xénophagie est une forme d'autophagie sélective permettant de capture des pathogènes dans les autophagosomes et de les dégrader dans les autolysosomes. Cette sélectivité est assurée par une famille de protéines ; les récepteurs autophagiques qui reconnaissent des substrats cytosoliques d'un côté et les membres de la famille LC3 ancrés dans la membrane de l'autophagosome de l'autre. Parmi ces récepteurs, NDP52 cible la bactérie Salmonella Typhimurium vers l'autophagie.Nous décrivons un rôle nouveau et inattendu pour NDP52 ; assurer la maturation d'autophagosomes durant l'infection par Salmonella mais aussi durant l'autophagie basale. De manière intéressante, ce rôle de NDP52 dans la maturation est indépendant de son rôle dans le ciblage de la bactérie puisque ces fonctions nécessitent des domaines et des partenaires moléculaires de NDP52 distincts. Nous montrons aussi que d'autres récepteurs peuvent participer à la maturation comme Optineurine. Ce travail montre donc que NDP52 assure deux rôles durant la xénophagie en ciblant les bactéries vers les autophagosomes en formation puis en promouvant la maturation de l'autophagosome. De plus, nous proposons aussi un possible mécanisme de régulation de ces deux fonctions par des modifications post-traductionnelles des récepteurs autophagiques.Ce travail démontre que les récepteurs autophagiques jouent des rôles au-delà du ciblage des pathogènes qui sont aussi cruciaux pour une xénophagie efficace. De plus, les récepteurs autophagiques sont aussi nécessaires pour le déroulement de l'autophagie basale. Ces travaux offrent une nouvelle compréhension de la régulation moléculaire de l'autophagie et de la xénophagie / Xenophagy relies on the ability of the autophagy process to selectively entrap intracellular pathogens within autophagosomes to degrade them into autolysosomes. The selectivity of the process relies on proteins named autophagy receptors that share the ability to recognise cytosolic cargos on one hand and autophagosome-bound members of the ATG8 family on the other. Among autophagy receptors NDP52 has been described to target Salmonella Typhimurium to the growing autophagosome. We describe a new unexpected role for NDP52, as this receptor also regulates the maturation of Salmonella-containing autophagosomes and during ongoing autophagy. Interestingly, the role of NDP52 in maturation is independent from its role in targeting as they rely on different binding domains and protein partners. We also show that other autophagy receptors also mediate autophagosome maturation such as Optineurin. Therefore, our work shows that NDP52 plays a dual function during xenophagy first by targeting bacteria to growing autophagosomes and then by assuring autophagosome maturation. Moreover, we also provide insights as to how these dual roles are regulated by post-translational modifications of autophagy receptors.This work demonstrates that autophagy receptors have other roles beyond pathogen targeting that are also crucial for an efficient xenophagy. Moreover, autophagy receptors are also necessary for autophagy completion in uninfected cells. These results strengthen our understanding of both ongoing autophagy and xenophagy molecular mechanisms

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