O trabalho foi desenvolvido em três etapas experimentais. A primeira consistiu da avaliação, em campo de 90 genótipos de soja, sendo 68 pertencentes ao grupo de maturação precoce e 22 ao grupo tardio, quanto à variação na capacidade de nodulação da planta hospedeira. A inoculação dos genótipos foi feita com a mistura de três estirpes de B. japonicum: SEMIA-587, SEMIA-5019 e CB-1809. Os caracteres avaliados foram número e peso de nódulos, atividade da nitrogenase (ARA) e produtividade. O tratamento estatístico dos dados incluiu análise multidimensional. Os resultados revelaram diferenças genotípicas entre os materiais testados, indicando o potencial genético da leguminosa para a fixação do N2. Não foi detectada correlação entre dados de nodulação e produtividade. A segunda etapa experimental foi conduzida em casa de vegetação com o objetivo de avaliar a resposta da bactéria dentro e entre as três estirpes de B. japonicum, inoculadas separadamente no genótipo Bossier (precoce) e IAC-9 (tardio). Os dados foram agrupados em classes de frequência da ARA e do tamanho de 60 nódulos individuais. Os resultados mostraram comportamentos diferenciais dentro das estirpes para ambos os caracteres avaliados, atribuídos à variação genética intrínseca da estirpe. A CB-1809 apresentou curva de distribuição normal, ao passo que a SEMIA-587 e SEMIA-5019 inoculadas no genótipo Bossier expressaram alta frequência de nódulos com baixa atividade, mas de grande tamanho, no período de florescimento. Isto indicou que o grupo de maturação a que pertence o genótipo poderia estar influindo no ciclo de nodulação da estirpe. A última etapa, também conduzida em casa de vegetação, constou do estudo da interação entre dois isolados da estirpe SEMIA-587 e três genótipos selecionados em campo (Bossier, Planalto e SOC 81-76, do grupo precoce e IAC-9, Tropical e GO 79-1084, do grupo tardio). Foi avaliada a nodulação (número, peso e tamanho de nódulos e ARA) e rendimento da planta (peso da parte aérea e N-total). A ausência de interação significativa entre os tratamentos permitiu o estudo da ação independente da bactéria e da planta na simbiose, para todos os caracteres avaliados. Os resultados indicaram que somente a seleção praticada dentro da estirpe produziu acréscimos significativos, indicando a necessidade de pesquisas dirigidas à manipulação da planta hospedeira para aumento da eficiência simbiótica na fixação do N<sub.2 / The present research was undertaken in three experimental phases. The first one, consisted on a field evaluation of 90 soybean genotypes, 68 of them from the early maturity group and 22 from the late maturity group, to measure the range of variability for nodulation ability in the host. The inoculation was performed with a mixture of three strains of B. japonicum: SEMIA-587, SEMIA-5019 and CB-1809. The parameters studied were: nodule number, weight, nitrogenase activity (ARA) and seed yield. The statistical anaIysis of data include da multidimensional analysis. The results revealed differences among genotypes, indicating their genetical potential for biological nitrogen fixation. It was not detected correlation between nodulation and seed yield. The second experimental phase was conducted under greenhouse conditions with the aim of evaluating the bacterial response within and among the three strains of B. japonicum when applied alone to Bossier (early maturity) and IAC-9 (late maturity) genotypes. Data were grouped in classes of frequencies of ARA and size of 60 individual nodules. The results showed the differencial behaviour among strains for bot parameters, and was atributed to the intrinsec genetical variation of the strain. Strain CB-1809 presented a normal distribution of data, whereas S EMIA-587 and SEMIA-5019 when inoculated in the Bossier, expressed a high frequency of nodules with low activity but with 1 arge size at the mid-flowering period. This indicated the nodulation traits of the strain probably was influenced by the lenght period for the genotype to reach the maturity. The last phase was also undertaken at the greenhouse and consisted in the study of the interaction among isolates from strain SEMIA-587 nodules picked up from one plant at the second phase and introduced into genotypes selected from the field trial - Bossier, Planalto and SOC 81-76 (early maturity group) and IAC-9, Tropical and GO 79-1084 (late maturity group). Nodulation (number, weight and size of nodules and NA) and weight and N-accumulation in the plant were also evaluated. The absence of a significant interaction among treatments showed that both plant and bacteria acted independently. The results indicated an overall superioty of the strain to enhance the N and weight of the plant. This suggested the need of research toward the manipulation of the host plant for enhancing the symbiotic efficiency of biological N2 fixation

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-03T16:52:59Z No. of bitstreams: 1 2017_RaqueldeCastroPires.pdf: 2820771 bytes, checksum: 11cf27dee35647b3af642e064a9a1245 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-05T21:41:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_RaqueldeCastroPires.pdf: 2820771 bytes, checksum: 11cf27dee35647b3af642e064a9a1245 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-05T21:41:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_RaqueldeCastroPires.pdf: 2820771 bytes, checksum: 11cf27dee35647b3af642e064a9a1245 (MD5) Previous issue date: 2018-01-05 / Grande parte das espécies da família Leguminosae se associa simbioticamente com bactérias fixadoras de nitrogênio pertencentes às classes α- e β-proteobacteria, conhecidas como rizóbios. Nesse trabalho foi estudada a associação simbiótica em dois gêneros de leguminosas, Mimosa e Stryphnodendron: o primeiro é notório pelo amplo sobre sua capacidade conhecimento de nodulação, ao passo que, pouco se sabe sobre as interações simbióticas envolvendo Styphnodendron. Os objetivos deste estudo foram avaliar a influência dos diferentes tipos de solo na associação simbiótica entre espécies do gênero Mimosa e bactérias fixadoras de nitrogênio, e investigar a nodulação do gênero Stryphnodendron em simbiose com rizóbios. No capítulo I, foi realizado um experimento com seis espécies de Mimosa em solos oriundos de três diferentes locais com características contrastantes. Nos dois solos mais ácidos e menos férteis as plantas de Mimosa se associaram com bactérias do gênero Paraburkholderia, enquanto que no solo mais fértil e com pH tendendo para neutro se associaram com Rhizobium. Fatores edáficos como pH e fertilidade, parecem favorecer a predominância de determinados tipos de rizóbio, enquanto que as espécies de plantas estudadas parecem ter baixa especificidade no estabelecimento da associação simbiótica. No capítulo II, foram selecionadas dez espécies representativas das três principais linhagens do gênero Stryphnodendron, a fim de revelar quais espécies são capazes de nodular e quais seriam os rizóbios associados. Sementes dessas espécies foram plantadas em seu solo de origem para avaliação da nodulação e os isolados obtidos foram identificados por meio da sequência do gene 16S rRNA. Das dez espécies avaliadas, oito mostraram-se capazes de nodular e distintas bactérias pertencentes aos gêneros Bradyrhizobium, Rhizobium e Paraburkholderia foram encontradas em associação simbiótica com as espécies de Stryphnodendron, revelando novas relações planta-bactéria e ampliando o conhecimento sobre a nodulação em espécies de leguminosas tropicais. / Most species of the family Leguminosae are able to form a symbiotic association with nitrogen fixing bacteria belonging to the α- and β-proteobacteria classes, which are known as rhizobia. In this work the symbiotic associations in two legume genera, Mimosa and Stryphnodendron were investigated: the first one is notorious for the knowledge accumulated about its nodulation capacity, whereas little is known about the symbiotic interactions related toStyphnodendron. The goals of this study were to investigate the influence of different types of soil on the symbiotic association of Mimosa and rhizobia, and the nodulation of the genus Stryphnodendron with nitrogen-fixing bacteria. In chapter I, a greenhouse experiment was carried out with trap plants using seeds of six species of Mimosa and soils from three different locations with contrasting characteristics. In the two most acidic and less fertile soils, Mimosa plants were associated with bacteria of the genus Paraburkholderia, whereas in the more fertile soil with pH tending towards neutral plants were associated with Rhizobium. Edaphic factors such as pH and fertility influenced the presence of certain rhizobia types, while the species of plants studied appear to have low specificity in the establishment of its symbiotic relationships. In chapter II, ten species, representative of the three main lineages of the genus Stryphnodendron,were selected, in order to reveal which species are capable to nodulate and identify the associated rhizobia. Seeds of these species were planted in their origin soil for nodulation evaluation and the isolates obtained were identified by sequencing the 16S rRNA gene. Of ten species evaluated, eight were able to nodulate and distinct bacterias belonging to the genera Bradyrhizobium, Rhizobium e Paraburkholderia were found in symbiotic association with species of Stryphnodendron, revealing new plant-bacteria interactions and expanding the knowledge about nodulation in tropical legume species.

O trabalho foi desenvolvido em três etapas experimentais. A primeira consistiu da avaliação, em campo de 90 genótipos de soja, sendo 68 pertencentes ao grupo de maturação precoce e 22 ao grupo tardio, quanto à variação na capacidade de nodulação da planta hospedeira. A inoculação dos genótipos foi feita com a mistura de três estirpes de B. japonicum: SEMIA-587, SEMIA-5019 e CB-1809. Os caracteres avaliados foram número e peso de nódulos, atividade da nitrogenase (ARA) e produtividade. O tratamento estatístico dos dados incluiu análise multidimensional. Os resultados revelaram diferenças genotípicas entre os materiais testados, indicando o potencial genético da leguminosa para a fixação do N2. Não foi detectada correlação entre dados de nodulação e produtividade. A segunda etapa experimental foi conduzida em casa de vegetação com o objetivo de avaliar a resposta da bactéria dentro e entre as três estirpes de B. japonicum, inoculadas separadamente no genótipo Bossier (precoce) e IAC-9 (tardio). Os dados foram agrupados em classes de frequência da ARA e do tamanho de 60 nódulos individuais. Os resultados mostraram comportamentos diferenciais dentro das estirpes para ambos os caracteres avaliados, atribuídos à variação genética intrínseca da estirpe. A CB-1809 apresentou curva de distribuição normal, ao passo que a SEMIA-587 e SEMIA-5019 inoculadas no genótipo Bossier expressaram alta frequência de nódulos com baixa atividade, mas de grande tamanho, no período de florescimento. Isto indicou que o grupo de maturação a que pertence o genótipo poderia estar influindo no ciclo de nodulação da estirpe. A última etapa, também conduzida em casa de vegetação, constou do estudo da interação entre dois isolados da estirpe SEMIA-587 e três genótipos selecionados em campo (Bossier, Planalto e SOC 81-76, do grupo precoce e IAC-9, Tropical e GO 79-1084, do grupo tardio). Foi avaliada a nodulação (número, peso e tamanho de nódulos e ARA) e rendimento da planta (peso da parte aérea e N-total). A ausência de interação significativa entre os tratamentos permitiu o estudo da ação independente da bactéria e da planta na simbiose, para todos os caracteres avaliados. Os resultados indicaram que somente a seleção praticada dentro da estirpe produziu acréscimos significativos, indicando a necessidade de pesquisas dirigidas à manipulação da planta hospedeira para aumento da eficiência simbiótica na fixação do N<sub.2 / The present research was undertaken in three experimental phases. The first one, consisted on a field evaluation of 90 soybean genotypes, 68 of them from the early maturity group and 22 from the late maturity group, to measure the range of variability for nodulation ability in the host. The inoculation was performed with a mixture of three strains of B. japonicum: SEMIA-587, SEMIA-5019 and CB-1809. The parameters studied were: nodule number, weight, nitrogenase activity (ARA) and seed yield. The statistical anaIysis of data include da multidimensional analysis. The results revealed differences among genotypes, indicating their genetical potential for biological nitrogen fixation. It was not detected correlation between nodulation and seed yield. The second experimental phase was conducted under greenhouse conditions with the aim of evaluating the bacterial response within and among the three strains of B. japonicum when applied alone to Bossier (early maturity) and IAC-9 (late maturity) genotypes. Data were grouped in classes of frequencies of ARA and size of 60 individual nodules. The results showed the differencial behaviour among strains for bot parameters, and was atributed to the intrinsec genetical variation of the strain. Strain CB-1809 presented a normal distribution of data, whereas S EMIA-587 and SEMIA-5019 when inoculated in the Bossier, expressed a high frequency of nodules with low activity but with 1 arge size at the mid-flowering period. This indicated the nodulation traits of the strain probably was influenced by the lenght period for the genotype to reach the maturity. The last phase was also undertaken at the greenhouse and consisted in the study of the interaction among isolates from strain SEMIA-587 nodules picked up from one plant at the second phase and introduced into genotypes selected from the field trial - Bossier, Planalto and SOC 81-76 (early maturity group) and IAC-9, Tropical and GO 79-1084 (late maturity group). Nodulation (number, weight and size of nodules and NA) and weight and N-accumulation in the plant were also evaluated. The absence of a significant interaction among treatments showed that both plant and bacteria acted independently. The results indicated an overall superioty of the strain to enhance the N and weight of the plant. This suggested the need of research toward the manipulation of the host plant for enhancing the symbiotic efficiency of biological N2 fixation

Estudou-se, em casa-de-vegetação, o efeito da desinfestação do solo com brometo de metila e da presença de camadas subsuperficiais compactadas no desenvolvimento das raízes e no estabelecimento da simbiose da soja com as estirpes nativas do solo, SEMIA 5079 e SEMIA 5080 inoculadas individualmente. Utilizou-se para tal, amostra de Latossolo Vermelho-Escuro álico, textura média, do município de Uberlândia, MG, previamente calcareado e adubado. Os vasos utilizados, foram formados pela sobreposição de três anéis de PVC, com 1,5 dm de diâmetro e altura de 0,5 dm para o anel central e inferior e 1,25 dm para o anel superior, unidos por fita adesiva. O solo do anel central foi submetido a diferentes níveis de compactação para obter as densidades de 1,15; 1,30; 1,45; 1,60 kg dm-3. Metade do solo utilizado foi previamente desinfestado, com 0,25 dm3 m-3 de brometo de metila. Formada a coluna, pela união dos três anéis com fita adesiva foi plantada soja IAC-8, com sementes previamente desinfestadas e inoculadas com as estirpes de rizóbios SEMIA 5079 e SEMIA 5080. As estirpes nativas encontravam-se no solo utilizado. Quarenta e sete dias após a emergência, as plantas de soja foram cortadas rente ao solo, secadas em estufa de ventilação forçada, pesada e submetidas à digestão para determinação do nitrogênio. As colunas de PVC foram desmontadas para coleta e quantificação de raízes e nódulos de rizóbios. Análise e interpretação dos dados possibilitaram constatar que a produção de matéria seca da parte aérea da soja foi crescente com a desinfestação do solo e inoculação com a estirpe de rizóbio SEMIA 5080, dentro das densidades de até 1,30 kg dm-3. Para valores maiores do que este, as estirpes estudadas não diferiram entre si. A compactação, por outro lado, promoveu reduções lineares na produção da matéria seca da parte aérea no solo desinfestado, e, parabólica, com maior produção na densidade de 1,35 kg dm-3 no solo não desinfestado. A concentração de nitrogênio na parte aérea da soja foi significativamente menor com a inoculação menor com a inoculação da estirpe SEMIA 5079 no solo desinfestado, enquanto que, no não desinfestado as estirpes estudadas não diferiram entre si. A compactação aplicada reduziu linearmente a concentração de nitrogênio. Com a desinfestação do solo a maior produção ocorreu com a presença da estirpe nativa. Por outro lado, a compactação produziu efeito parabólico na produção de raízes tanto no solo desinfestado como no solo não desinfestado, com pontos de máxima produção nas densidades 1,47 kg dm-3 e 1,61 kg dm-3, respectivamente. A desinfestação do solo aumentou significativamente a massa dos nódulos em todos os níveis de compactação, enquanto que não houve efeito da estirpe inoculada. Por outro lado, a compactação promoveu aumentos da massa dos nódulos até a densidade do solo de 1,33 kg dm-3 em todas as estirpes inoculadas. Enquanto a desinfestação do solo possibilitou aumentos no número de nódulos, a inoculação não foi significativa. A compactação promoveu redução linear no número de nódulos no solo desinfestado e aumento linear no solo não desinfestado em todas as estirpes estudadas / not available

As bromélias habitam os mais diferentes ambientes sendo que muitas são encontradas como epífitas. Essas últimas estão sujeitas a condições de disponibilidade de água e nutrientes com intermitência. Elas conseguem sobreviver a essas circunstâncias por serem dotadas de diversas adaptações morfológicas e fisiológicas. A bromélia tanque Guzmania monostachia tem sido bastante estudada por possuir uma grande plasticidade fotossintética, porém, pouco é conhecido a respeito de outras possíveis adaptações como a interação com micro-organismos. Sendo assim, o presente trabalho isolou bactérias fixadoras de nitrogênio (diazotróficas) tanto da parte externa (epifíticas) quanto da parte interna (endofíticas) de diferentes porções (ápice, mediana e base) de folhas coletadas tanto no ambiente natural quanto na casa de vegetação. As bactérias foram selecionadas por meio do ensaio de redução de acetileno (ARA) e também pelo uso de quatro diferentes meios de cultura que não contém fonte de nitrogênio reduzido. As linhagens isoladas foram identificadas por meio do gene 16sRNA. Dois isolados Pseudomonas sp. e Burkholderia sp. foram escolhidos para serem marcados com um gene de fluorescência verde (GFP) e foram então inoculados (separadamente) em plantas de G. monostachia cultivadas em casa de vegetação. A colonização dos tecidos foliares foi monitorada com auxílio de um microscópio confocal. Além disso, foram estimadas as densidades populacionais epifíticas e endofíticas em diferentes grupos foliares (jovens e intermediários) e as folhas do grupo intermediário por serem maiores e totalmente expandidas foram divididas em porções (apical, mediana e basal). Também foram pesquisadas as seguintes moléculas descritas como importantes na interação entre planta e micro-organismo: óxido nítrico (NO), ácido salicílico (SA), etileno (ET) e ácido-indol-3-acético (IAA). Como resultados, a maioria das linhagens bacterianas foram classificadas como pertencentes ao grupo Proteobacteria, mas também foram encontrados isolados gram positivos pertencentes aos grupos Actinobacteria e Firmicutes. As bactérias endofíticas foram isoladas somente da porção basal foliar (tanto das folhas originadas do meio ambiente quanto das folhas originadas da casa de vegetação). Cabe ressaltar que após a inoculação de ambas bactérias marcadas com GFP, foi observado elas no interior dos tricomas foliares (estruturas presentes principalmente na base foliar). Após 20 horas da inoculação, ambas bactérias já foram visualizadas no interior da epiderme das folhas. Após 5 dias as bactérias foram se espalhando para regiões mais distantes do tricoma e também foram observadas no parênquima. Após 10 dias a bactéria Pseudomonas sp. foi encontrada nas paredes dos vasos condutores. Foram re-isoladas bactérias epifíticas e endofíticas da mediana e da base foliar, mas não da porção apical. Após 10 dias as bactérias foram isoladas como endofíticas somente da base. Essa porção não apresentou diferenças nas populações epifíticas e endofíticas. O NO aumentou nas folhas jovens e na base das intermediárias em um curto período de tempo após a inoculação. Aparentemente, ambas as bactérias não dispararam a via do SA. De acordo com os resultados aqui presentes, ambas as bactérias não pareceram ser prejudiciais à G. monostachia. Além disso, o presente trabalho mostra fortes evidencias de que as bactérias entram nos tecidos foliares por meio dos tricomas na base foliar e permanecem nessa porção, que é precisamente a mais importante para absorção de nutrientes / Bromeliads inhabit different environments and many are found as epiphytes. These plants are often subjected to periods of water and nutrient shortage. For their survival, epiphytic bromeliads are endowed with different morphological and physiological adaptations. Guzmania monostachia is a tank-bromeliad that has been extensively studied because of its great photosynthetic plasticity. However, little is known about other possible survival adaptations, such as beneficial interactions with microorganisms. Here, we isolated nitrogen fixing (diazotrophc) bacteria from both the outside (epiphytic) and the inside (endophytic) of different leaf portions (apex, middle and base), collected in natural environment and in greenhouse-cultivated plants. The bacteria were selected using the acetylene reduction assay (ARA) and four different media that do not contain reduced nitrogen source. The strains were identified by 16S rRNA. Two isolates, Pseudomonas sp. and Burkholderia sp. has been chosen to be tagged with green fluorescent protein (GFP) and then inoculated in G. monostachia plants cultivated in greenhouse. The colonization of the leaf tissues was monitored with the aid of confocal microscopy and also we estimate the external and internal bacterial population densities in different leaf groups (younger and expanded) and portions (apex, middle and base). In addition, we studied some important molecules in plant-microbe interactions: nitric oxide (NO), salicylic acid (SA), ethylene (ET) and indol-3-acetic acid (IAA). As a result, most of the isolated strains belong to the Proteobacteria group, but gram positive strains were also found belonging to the Firmicutes and Actinobacteria group. The endophytic bacteria were isolated only from the basal portion (both from leaves of natural environment and from leaves of greenhouse cultivated plants). Interestingly, after the inoculation of both bacteria tagged with GFP they were visualized entering by trichomes present mainly in the basal portion. Twenty hours after the inoculation, the bacteria were visualized inside the epidermis of the leaves. After five days, the bacteria were detected in the parenchyma and, ten days after the inoculation Pseudomonas sp. was found on the vessels walls. It was possible to re-isolate epiphytic and endophytic bacteria from the base and middle portions, but not from the apex. After 10 days the endophytic bacteria were found only in the base. The base did not show differences between epiphytic and endophytic populations. NO increased in a short time after the inoculation in the younger leaves and in the basal portion of intermediate leaves. Apparently, the SA pathway was not triggered by any of the bacteria used. According to these results, the bacteria tested do not seem to be harmful to the plant. Furthermore, we strongly suggest that they enter through the trichomes on the leaf base and remain in this portion, which is precisely the most important for the absorption of nutrients

O processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN) é a principal forma de entrada de nitrogênio (N) em ecossistemas naturais e é intermediado por microorganismos diazotróficos simbióticos ou de vida livre. A produção de biofertilizantes com bactérias diazotróficas é a principal alternativa ao uso de fertilizantes nitrogenados solúveis. Apesar da simbiose Rhizobium-leguminosas ser eficiente em promover o crescimento das plantas, a inoculação de bactérias diazotróficas em gramíneas vem apresentando resultados questionáveis, principalmente devido à baixa eficiência e incompatibilidade entre os atuais inoculantes bacterianos e as plantas. Os biofertilizantes para gramíneas utilizam bactérias endofíticas as quais desenvolvem interações pouco conhecidas com as plantas. Uma possibilidade para melhorar a eficiência da FBN em gramíneas é a aplicação de bactérias epifíticas de menor seletividade em relação às bactérias endofíticas. Os objetivos deste trabalho foram isolar novos genótipos de bactérias diazotróficas da filosfera de bambu da Mata Atlântica, verificar seu potencial biotecnológico in vitro e avaliar sua eficiência agronômica como biofertilizante em cana-de-açúcar em casa-de-vegetação. Foram obtidos 120 isolados bacterianos os quais foram caracterizados morfológica e filogenéticamente. Com relação ao potencial biotecnológico, 48 isolados bacterianos apresentaram resposta positiva nos testes in vitro de redução de acetileno (ARA) e para produção in vitro de ácido indol-3-acético (AIA) na presença de L-triptofano. Desses 48 isolados, 50% apresentaram capacidade de solubilizar fosfato de cálcio, 8% de produzir quitinases, 16% de produzir ACC desaminase e 17% de produzir sideróforos. O sequenciamento do gene rRNA 16S indicou que 75% dos isolados da filosfera de bambu foram similares à classe Gammaproteobacteria (Proteobacteria) , e a família Enterobacteriaceae. Dentre eles, 32% dos isolados apresentaram sequências similares a Klebsiella sp. e 2% foram similares a Serratia e Enterobacter. Das 48 sequências analisadas, 37% delas não foram classificadas quanto ao gênero, podendo então representar novos gêneros ou espécies. Dez isolados contendo o gene nifH foram selecionados para experimentos de eficiência agronômica em casa-de-vegetação usando bactérias inoculadas via pulverização foliar ou encapsuladas em micro-esferas de alginato e associados a diferentes níveis de adubação nitrogenada. A inoculação por meio de pulverização nas folhas de cana-de-açúcar resultou em aumento significativo de massa seca de parte aérea e concentração de N na parte aérea das plantas na sua fase inicial de desenvolvimento. A maior taxa de fixação nas folhas inoculadas foi observada sete dias após a inoculação no tratamento sem adição de N mineral. A inoculação no solo com os mesmos 10 isolados encapsulados em matriz polimérica em conjunto com diferentes níveis de adubação nitrogenada mostrou aumentos significativos de massa seca da parte aérea, raízes e concentração de N na parte aérea da cana-de-açúcar em comparação aos controles, principalmente nas fases tardias do desenvolvimento das plantas. O solo que recebeu as bactérias encapsuladas apresentaram elevadas taxas de FBN, oscilando entre 0 e 4 g de N g-1 h-1, 7 dias após a inoculação. Os resultados sugerem que as bactérias selecionadas possuem alto potencial biotecnológico para promover o crescimento das plantas em momentos diferentes do seu ciclo de desenvolvimento, dependendo do tipo de abordagem para inoculação. / The process of biological nitrogen fixation (BNF) is the most important form of nitrogen (N) input in natural ecosystems and is mediated by symbiotic or free-living diazotrophic microorganisms. The production of biofertilizers containing diazotrophic bacteria is the main alternative to the use of soluble nitrogen fertilizers, improving plant growth by nitrogen fixation or other plant growth promoting mechanisms. Despite the efficiency of the symbioses Rhizobium-legumes in promoting plant growth, the inoculation of diazotrophic bacteria in grasses, such as sugarcane, has shown variable results, mainly due to the low efficiency and incompatibility between the current bacterial strains used in inoculants and plant genotypes. Most of the biofertilizers for grasses uses endophytic bacteria that develop complexes interactions with the host plant, which are not totally understood. A possibility to improve the efficiency of BNF in grasses is the application of epiphytic diazotrophic bacteria that are less selective as compared to endophytes. The aims of this work were to isolate new genotypes of diazotrophic bacteria from the phyllosphere of bamboo from Atlantic Forest, determine their biotechnological potential based on in vitro assays, and evaluate their agronomic efficiency as biofertilizer for sugarcane under greenhouse conditions. A total of 120 bacterial isolates were obtained and characterized morphologically and phylogenetically. Regarding the biotechnological potential, 48 isolates showed positive responses under in vitro the acetylene reduction assay (ARA) and indole-acetic-acid (IAA) production in vitro assay in the presence of L-tryptophan. Among the 48 isolates evaluated, 50% were able to solubilize calcium phosphate, 8% produced chitinases, 16% were able to produce ACC deaminase, and 17% produced siderophores. The sequencing of the rRNA 16S gene revealed that 75% of the isolates were phylogenetically related to the family Enterobacteriaceae (Gammaproteobacteria) . The genus Klebsiella accounted for 32% of the isolates, whereas Serratia and Enterobacter accounted for 2%. Aproximatelly 37% of the isolates were assembled unclassified Bacteria. Ten isolates containing the nifH gene were selected for agronomic efficiency test under greenhouse conditions, using bacteria inoculated via foliar spraying, or encapsulation in alginate beads and inoculation in the soil, associated with different doses of nitrogen fertilizer. The inoculation on the sugarcane leaf surfaces resulted in significant increases in root biomass and N concentration in the shoots at the early stage of plant development. The highest N fixation rates in inoculated leaves were observed 7 days after inoculation in the absence of mineral N. The soil inoculation with the same 10 isolates immobilized in polymeric matrix in addiction to different rates of nitrogen fertilization showed significant increases in shoot and root biomass and N concentration in the shoots of sugarcane, when compared to the controls, mostly at later stages of plant development. The soil inoculated with encapsulated bacteria showed high rates of BNF even when nitrogen fertilizer was applied, ranging between 0 and 4 g of N g-1 h-1 seven days after the inoculation. The results suggest that the selected bacteria have high biotechnological potential to promote sugarcane growth at different stages of development, depending on the inoculation approach.

A utilização de água residuária doméstica na fertirrigação de culturas vegetais não produtoras de alimentos, mas de interesse zootécnico, é uma alternativa viável para o uso sustentável dos recursos hídricos. A busca de práticas agrícolas que proporcionem altas produtividades com sustentabilidade dos agroecossistemas tem sido um grande desafio. Assim, o objetivo deste estudo foi utilizar águas residuárias para plantio de sementes de Brachiaria brizantha cv Marandu como alternativa para produção de alimento animal em solos do Cerrado, bem como estudar os efeitos da fertirrigação sobre microbiota, bactérias fixadoras de nitrogênio (BFNs) e fungos micorrízicos (FMAs). Esses dois grupos microbianos são os principais microrganismos indicadores da fertilidade do solo. A água residuária utilizada foi obtida do efluente sanitário do Centro Universitário Luterano de Palmas (CEULP/ULBRA). Antes da aplicação do efluente no solo foram determinados os teores de nitrogênio (N), fósforo (P) e potássio (K), a condutividade elétrica, o pH, a demanda bioquímica de oxigênio (DBO), a demanda química de oxigênio (DQO), sólidos totais e contagens de coliformes totais e fecais. Os teores de NPK foram utilizados para determinação dos manejos de irrigação. Foram realizados cinco manejos ou tratamentos (T1 a T5). T1 e T2 foram os tratamentos que não receberam água residuária e T3 a T5 receberam, respectivamente, 20, 40 e 60% de NPK oriundos da água residuária. Esses manejos foram distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado com 20 parcelas e 4 repetições. Para investigar os efeitos dos manejos sobre as características químicas, físicas e microbiológicas do solo foram realizadas duas amostragens, sendo a primeira coleta feita antes da fertirrigação e outra no final do experimento. Para as análises da produtividade da massa verde vegetal e seca, e a composição bromatológica do xiii capim foram realizados três cortes da parte área da planta. Após aplicação da água residuária foram observadas alterações nas propriedades físicas e químicas do solo e na contagem de células microbianas viáveis. Entretanto, a adição de NPK oriundos da água residuária aumentou a abundância de BFNs e FMAs. A produtividade de massa seca foliar por hectare foi diretamente proporcional à concentração de NPK aplicada no solo. Além disso, comparando o manejo de adubação com NPK comercial (T2) com aqueles que receberam águas residuárias (T3, T4 e T5) observa-se que a utilização desse efluente não alterou a composição nutricional do capim Marandu. Portanto, o uso de água residuária mostrou ser uma alternativa viável e promissora para reuso dessa água em solo do Cerrado que é considerado pobre em nutriente, visando principalmente à produção de alimento animal. / The use of domestic sewage for irrigation of non-food crops, but of zootechnical interest, is a viable alternative for the sustainable use of water resources. The search for agricultural practices that provide high productivity with sustainability of agroecosystems has been a great challenge. So, this study were analyzed the changes in the community of nitrogen fixing bacteria (NFB) and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) after the use of domestic wastewater to irrigation of Brachiaria brizantha cv Marandu in Cerrado soil. These two microbial groups are the main microorganims indicative of soil fertility. The changes physical and chemical of the soil before and after the use of the fertigation, dry green mass and dry mass productivity and bromatological composition of the grass were analyzed. After the use domestic wastewater of the CEULP/ULBRA in soil to cultivation of B. brizantha cv Marandu, changes in the physical and chemical properties of the soil were observed. The use domestic wastewater did not change the viable microbial cell count. However, the addition of NPK from use domestic wastewater increased the abundance of NFBs and FMAs. The foliar dry mass productivity is highest in the treatments with domestic wastewater and bromatological composition of the grass not was affected by fertigation. Therefore, the NPK concentration added in the soil and the number of cuts contribute to a better nutritional composition of the grass that was cultivated with domestic effluent. Thus, adequate management makes possible the use of fertigation in Cerrado soil for the Marandu grass or other agricultural crop production.

As bromélias habitam os mais diferentes ambientes sendo que muitas são encontradas como epífitas. Essas últimas estão sujeitas a condições de disponibilidade de água e nutrientes com intermitência. Elas conseguem sobreviver a essas circunstâncias por serem dotadas de diversas adaptações morfológicas e fisiológicas. A bromélia tanque Guzmania monostachia tem sido bastante estudada por possuir uma grande plasticidade fotossintética, porém, pouco é conhecido a respeito de outras possíveis adaptações como a interação com micro-organismos. Sendo assim, o presente trabalho isolou bactérias fixadoras de nitrogênio (diazotróficas) tanto da parte externa (epifíticas) quanto da parte interna (endofíticas) de diferentes porções (ápice, mediana e base) de folhas coletadas tanto no ambiente natural quanto na casa de vegetação. As bactérias foram selecionadas por meio do ensaio de redução de acetileno (ARA) e também pelo uso de quatro diferentes meios de cultura que não contém fonte de nitrogênio reduzido. As linhagens isoladas foram identificadas por meio do gene 16sRNA. Dois isolados Pseudomonas sp. e Burkholderia sp. foram escolhidos para serem marcados com um gene de fluorescência verde (GFP) e foram então inoculados (separadamente) em plantas de G. monostachia cultivadas em casa de vegetação. A colonização dos tecidos foliares foi monitorada com auxílio de um microscópio confocal. Além disso, foram estimadas as densidades populacionais epifíticas e endofíticas em diferentes grupos foliares (jovens e intermediários) e as folhas do grupo intermediário por serem maiores e totalmente expandidas foram divididas em porções (apical, mediana e basal). Também foram pesquisadas as seguintes moléculas descritas como importantes na interação entre planta e micro-organismo: óxido nítrico (NO), ácido salicílico (SA), etileno (ET) e ácido-indol-3-acético (IAA). Como resultados, a maioria das linhagens bacterianas foram classificadas como pertencentes ao grupo Proteobacteria, mas também foram encontrados isolados gram positivos pertencentes aos grupos Actinobacteria e Firmicutes. As bactérias endofíticas foram isoladas somente da porção basal foliar (tanto das folhas originadas do meio ambiente quanto das folhas originadas da casa de vegetação). Cabe ressaltar que após a inoculação de ambas bactérias marcadas com GFP, foi observado elas no interior dos tricomas foliares (estruturas presentes principalmente na base foliar). Após 20 horas da inoculação, ambas bactérias já foram visualizadas no interior da epiderme das folhas. Após 5 dias as bactérias foram se espalhando para regiões mais distantes do tricoma e também foram observadas no parênquima. Após 10 dias a bactéria Pseudomonas sp. foi encontrada nas paredes dos vasos condutores. Foram re-isoladas bactérias epifíticas e endofíticas da mediana e da base foliar, mas não da porção apical. Após 10 dias as bactérias foram isoladas como endofíticas somente da base. Essa porção não apresentou diferenças nas populações epifíticas e endofíticas. O NO aumentou nas folhas jovens e na base das intermediárias em um curto período de tempo após a inoculação. Aparentemente, ambas as bactérias não dispararam a via do SA. De acordo com os resultados aqui presentes, ambas as bactérias não pareceram ser prejudiciais à G. monostachia. Além disso, o presente trabalho mostra fortes evidencias de que as bactérias entram nos tecidos foliares por meio dos tricomas na base foliar e permanecem nessa porção, que é precisamente a mais importante para absorção de nutrientes / Bromeliads inhabit different environments and many are found as epiphytes. These plants are often subjected to periods of water and nutrient shortage. For their survival, epiphytic bromeliads are endowed with different morphological and physiological adaptations. Guzmania monostachia is a tank-bromeliad that has been extensively studied because of its great photosynthetic plasticity. However, little is known about other possible survival adaptations, such as beneficial interactions with microorganisms. Here, we isolated nitrogen fixing (diazotrophc) bacteria from both the outside (epiphytic) and the inside (endophytic) of different leaf portions (apex, middle and base), collected in natural environment and in greenhouse-cultivated plants. The bacteria were selected using the acetylene reduction assay (ARA) and four different media that do not contain reduced nitrogen source. The strains were identified by 16S rRNA. Two isolates, Pseudomonas sp. and Burkholderia sp. has been chosen to be tagged with green fluorescent protein (GFP) and then inoculated in G. monostachia plants cultivated in greenhouse. The colonization of the leaf tissues was monitored with the aid of confocal microscopy and also we estimate the external and internal bacterial population densities in different leaf groups (younger and expanded) and portions (apex, middle and base). In addition, we studied some important molecules in plant-microbe interactions: nitric oxide (NO), salicylic acid (SA), ethylene (ET) and indol-3-acetic acid (IAA). As a result, most of the isolated strains belong to the Proteobacteria group, but gram positive strains were also found belonging to the Firmicutes and Actinobacteria group. The endophytic bacteria were isolated only from the basal portion (both from leaves of natural environment and from leaves of greenhouse cultivated plants). Interestingly, after the inoculation of both bacteria tagged with GFP they were visualized entering by trichomes present mainly in the basal portion. Twenty hours after the inoculation, the bacteria were visualized inside the epidermis of the leaves. After five days, the bacteria were detected in the parenchyma and, ten days after the inoculation Pseudomonas sp. was found on the vessels walls. It was possible to re-isolate epiphytic and endophytic bacteria from the base and middle portions, but not from the apex. After 10 days the endophytic bacteria were found only in the base. The base did not show differences between epiphytic and endophytic populations. NO increased in a short time after the inoculation in the younger leaves and in the basal portion of intermediate leaves. Apparently, the SA pathway was not triggered by any of the bacteria used. According to these results, the bacteria tested do not seem to be harmful to the plant. Furthermore, we strongly suggest that they enter through the trichomes on the leaf base and remain in this portion, which is precisely the most important for the absorption of nutrients

O processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN) é a principal forma de entrada de nitrogênio (N) em ecossistemas naturais e é intermediado por microorganismos diazotróficos simbióticos ou de vida livre. A produção de biofertilizantes com bactérias diazotróficas é a principal alternativa ao uso de fertilizantes nitrogenados solúveis. Apesar da simbiose Rhizobium-leguminosas ser eficiente em promover o crescimento das plantas, a inoculação de bactérias diazotróficas em gramíneas vem apresentando resultados questionáveis, principalmente devido à baixa eficiência e incompatibilidade entre os atuais inoculantes bacterianos e as plantas. Os biofertilizantes para gramíneas utilizam bactérias endofíticas as quais desenvolvem interações pouco conhecidas com as plantas. Uma possibilidade para melhorar a eficiência da FBN em gramíneas é a aplicação de bactérias epifíticas de menor seletividade em relação às bactérias endofíticas. Os objetivos deste trabalho foram isolar novos genótipos de bactérias diazotróficas da filosfera de bambu da Mata Atlântica, verificar seu potencial biotecnológico in vitro e avaliar sua eficiência agronômica como biofertilizante em cana-de-açúcar em casa-de-vegetação. Foram obtidos 120 isolados bacterianos os quais foram caracterizados morfológica e filogenéticamente. Com relação ao potencial biotecnológico, 48 isolados bacterianos apresentaram resposta positiva nos testes in vitro de redução de acetileno (ARA) e para produção in vitro de ácido indol-3-acético (AIA) na presença de L-triptofano. Desses 48 isolados, 50% apresentaram capacidade de solubilizar fosfato de cálcio, 8% de produzir quitinases, 16% de produzir ACC desaminase e 17% de produzir sideróforos. O sequenciamento do gene rRNA 16S indicou que 75% dos isolados da filosfera de bambu foram similares à classe Gammaproteobacteria (Proteobacteria) , e a família Enterobacteriaceae. Dentre eles, 32% dos isolados apresentaram sequências similares a Klebsiella sp. e 2% foram similares a Serratia e Enterobacter. Das 48 sequências analisadas, 37% delas não foram classificadas quanto ao gênero, podendo então representar novos gêneros ou espécies. Dez isolados contendo o gene nifH foram selecionados para experimentos de eficiência agronômica em casa-de-vegetação usando bactérias inoculadas via pulverização foliar ou encapsuladas em micro-esferas de alginato e associados a diferentes níveis de adubação nitrogenada. A inoculação por meio de pulverização nas folhas de cana-de-açúcar resultou em aumento significativo de massa seca de parte aérea e concentração de N na parte aérea das plantas na sua fase inicial de desenvolvimento. A maior taxa de fixação nas folhas inoculadas foi observada sete dias após a inoculação no tratamento sem adição de N mineral. A inoculação no solo com os mesmos 10 isolados encapsulados em matriz polimérica em conjunto com diferentes níveis de adubação nitrogenada mostrou aumentos significativos de massa seca da parte aérea, raízes e concentração de N na parte aérea da cana-de-açúcar em comparação aos controles, principalmente nas fases tardias do desenvolvimento das plantas. O solo que recebeu as bactérias encapsuladas apresentaram elevadas taxas de FBN, oscilando entre 0 e 4 g de N g-1 h-1, 7 dias após a inoculação. Os resultados sugerem que as bactérias selecionadas possuem alto potencial biotecnológico para promover o crescimento das plantas em momentos diferentes do seu ciclo de desenvolvimento, dependendo do tipo de abordagem para inoculação. / The process of biological nitrogen fixation (BNF) is the most important form of nitrogen (N) input in natural ecosystems and is mediated by symbiotic or free-living diazotrophic microorganisms. The production of biofertilizers containing diazotrophic bacteria is the main alternative to the use of soluble nitrogen fertilizers, improving plant growth by nitrogen fixation or other plant growth promoting mechanisms. Despite the efficiency of the symbioses Rhizobium-legumes in promoting plant growth, the inoculation of diazotrophic bacteria in grasses, such as sugarcane, has shown variable results, mainly due to the low efficiency and incompatibility between the current bacterial strains used in inoculants and plant genotypes. Most of the biofertilizers for grasses uses endophytic bacteria that develop complexes interactions with the host plant, which are not totally understood. A possibility to improve the efficiency of BNF in grasses is the application of epiphytic diazotrophic bacteria that are less selective as compared to endophytes. The aims of this work were to isolate new genotypes of diazotrophic bacteria from the phyllosphere of bamboo from Atlantic Forest, determine their biotechnological potential based on in vitro assays, and evaluate their agronomic efficiency as biofertilizer for sugarcane under greenhouse conditions. A total of 120 bacterial isolates were obtained and characterized morphologically and phylogenetically. Regarding the biotechnological potential, 48 isolates showed positive responses under in vitro the acetylene reduction assay (ARA) and indole-acetic-acid (IAA) production in vitro assay in the presence of L-tryptophan. Among the 48 isolates evaluated, 50% were able to solubilize calcium phosphate, 8% produced chitinases, 16% were able to produce ACC deaminase, and 17% produced siderophores. The sequencing of the rRNA 16S gene revealed that 75% of the isolates were phylogenetically related to the family Enterobacteriaceae (Gammaproteobacteria) . The genus Klebsiella accounted for 32% of the isolates, whereas Serratia and Enterobacter accounted for 2%. Aproximatelly 37% of the isolates were assembled unclassified Bacteria. Ten isolates containing the nifH gene were selected for agronomic efficiency test under greenhouse conditions, using bacteria inoculated via foliar spraying, or encapsulation in alginate beads and inoculation in the soil, associated with different doses of nitrogen fertilizer. The inoculation on the sugarcane leaf surfaces resulted in significant increases in root biomass and N concentration in the shoots at the early stage of plant development. The highest N fixation rates in inoculated leaves were observed 7 days after inoculation in the absence of mineral N. The soil inoculation with the same 10 isolates immobilized in polymeric matrix in addiction to different rates of nitrogen fertilization showed significant increases in shoot and root biomass and N concentration in the shoots of sugarcane, when compared to the controls, mostly at later stages of plant development. The soil inoculated with encapsulated bacteria showed high rates of BNF even when nitrogen fertilizer was applied, ranging between 0 and 4 g of N g-1 h-1 seven days after the inoculation. The results suggest that the selected bacteria have high biotechnological potential to promote sugarcane growth at different stages of development, depending on the inoculation approach.

Estudou-se, em casa-de-vegetação, o efeito da desinfestação do solo com brometo de metila e da presença de camadas subsuperficiais compactadas no desenvolvimento das raízes e no estabelecimento da simbiose da soja com as estirpes nativas do solo, SEMIA 5079 e SEMIA 5080 inoculadas individualmente. Utilizou-se para tal, amostra de Latossolo Vermelho-Escuro álico, textura média, do município de Uberlândia, MG, previamente calcareado e adubado. Os vasos utilizados, foram formados pela sobreposição de três anéis de PVC, com 1,5 dm de diâmetro e altura de 0,5 dm para o anel central e inferior e 1,25 dm para o anel superior, unidos por fita adesiva. O solo do anel central foi submetido a diferentes níveis de compactação para obter as densidades de 1,15; 1,30; 1,45; 1,60 kg dm-3. Metade do solo utilizado foi previamente desinfestado, com 0,25 dm3 m-3 de brometo de metila. Formada a coluna, pela união dos três anéis com fita adesiva foi plantada soja IAC-8, com sementes previamente desinfestadas e inoculadas com as estirpes de rizóbios SEMIA 5079 e SEMIA 5080. As estirpes nativas encontravam-se no solo utilizado. Quarenta e sete dias após a emergência, as plantas de soja foram cortadas rente ao solo, secadas em estufa de ventilação forçada, pesada e submetidas à digestão para determinação do nitrogênio. As colunas de PVC foram desmontadas para coleta e quantificação de raízes e nódulos de rizóbios. Análise e interpretação dos dados possibilitaram constatar que a produção de matéria seca da parte aérea da soja foi crescente com a desinfestação do solo e inoculação com a estirpe de rizóbio SEMIA 5080, dentro das densidades de até 1,30 kg dm-3. Para valores maiores do que este, as estirpes estudadas não diferiram entre si. A compactação, por outro lado, promoveu reduções lineares na produção da matéria seca da parte aérea no solo desinfestado, e, parabólica, com maior produção na densidade de 1,35 kg dm-3 no solo não desinfestado. A concentração de nitrogênio na parte aérea da soja foi significativamente menor com a inoculação menor com a inoculação da estirpe SEMIA 5079 no solo desinfestado, enquanto que, no não desinfestado as estirpes estudadas não diferiram entre si. A compactação aplicada reduziu linearmente a concentração de nitrogênio. Com a desinfestação do solo a maior produção ocorreu com a presença da estirpe nativa. Por outro lado, a compactação produziu efeito parabólico na produção de raízes tanto no solo desinfestado como no solo não desinfestado, com pontos de máxima produção nas densidades 1,47 kg dm-3 e 1,61 kg dm-3, respectivamente. A desinfestação do solo aumentou significativamente a massa dos nódulos em todos os níveis de compactação, enquanto que não houve efeito da estirpe inoculada. Por outro lado, a compactação promoveu aumentos da massa dos nódulos até a densidade do solo de 1,33 kg dm-3 em todas as estirpes inoculadas. Enquanto a desinfestação do solo possibilitou aumentos no número de nódulos, a inoculação não foi significativa. A compactação promoveu redução linear no número de nódulos no solo desinfestado e aumento linear no solo não desinfestado em todas as estirpes estudadas / not available