A Mata Atlântica é um importante bioma da costa brasileira, apresenta grande diversidade de plantas e animais, porém, pouco se sabe sobre a diversidade microbiana. Da mesma forma, pouco se sabe sobre o papel funcional desses microrganismos. Vários microrganismos estão envolvidos na ciclagem do nitrogênio na Mata Atlântica, e dentre eles os diazotróficos são de particular interesse, pois contribuem para o aporte direto de nitrogênio nos ecossistemas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade de bactérias diazotróficas que nodulam leguminosas em duas parcelas permanentes do Parque Estadual da Serra do Mar em diferentes altitudes. Nódulos de raízes foram coletados nas quatro estações do ano. As bactérias foram isoladas do interior dos nódulos, resultando em 105 isolados. A análise de diversidade genética destas bactérias foi feita utilizando-se BOX-PCR e sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. A capacidade de nodulação dos isolados foi determinada através da formação de nódulos em caupi (Vignia unguiculata). Os resultados indicaram que há uma diferença na distribuição espacial e temporal dos nódulos nas áreas estudadas. A maior quantidade de nódulos foi encontrada na parcela de Picinguaba, em estações com menores índices pluviométricos. Os isolados apresentaram uma grande diversidade fenotípica, sendo separados em 6 grupos com características culturais semelhantes. Os perfis de BOX-PCR formaram 8 grupos genotípicos com mais de 80% de similaridade, agrupando tanto isolados de Picinguaba quanto de Santa Virgínia. Os perfis dos géis do BOX-PCR apresentaram variação no número e mobilidade das bandas. Os dados foram transformados em uma matriz binária de presença e ausência que possibilitou a análise de agrupamento hierárquicos com 8 grupos genotípicos com mais de 80% de similaridade, agrupando tanto isolados de Picinguaba quanto de Santa Virgínia. Através do sequenciamento parcial de fragmentos de gene rRNA 16S verificou-se que a estrutura das comunidades diazotróficas de Picinguaba e Santa Virgínia não apresentaram diferença estatisticamente significativa, indicando que não há seleção de populações bacterianas especificas nas áreas.Dos isolados testados, 88% apresentaram capacidade de nodular caupi, porém alguns não foram eficientes em promover o crescimento das plantas. Nas duas áreas predominou UTOs filogeneticamente associados ao gênero Paenibacillus nos nódulos, sugerindo que essas bactérias são importantes para nodulação de leguminosas na Mata Atlântica. / The Atlantic Rainforest is a major biome of the Brazilian coast, which harbors great diversity of flora and fauna, but little is known about its microbial diversity. Furthermore, little is known about the functional role of these abundant microorganisms. Several microorganisms are involved in cycling of the Atlantic Rainforests nitrogen, among them the diazotrophs which are of particular interest because they contribute to the direct input of nitrogen to ecosystems. The aim of this study was to evaluate the diversity of legumes nodulating diazotrophs in two permanent plots of the Serra do Mar State Park at different altitudes. Root nodules were collected throughout the four seasons. The bacteria were isolated from inside of the nodules, resulting in 105 isolates. The analysis of genetic diversity was performed using BOX-PCR and rRNA 16S sequencing. The nodulation capacity of the isolates was determined by the nodule formation in cowpea (Vigna unguiculata). The results indicated that there are spatial and temporal differences distribution in the areas studied. The largest number of nodules was found in the Picinguaba plot during seasons of low rainfall. The isolates showed a wide phenotypic diversity, hence divided into six groups with similar cultural characteristics. The BOX-PCR profiles formed eight genotypic groups with more than 80% similarity, when comparing the isolates from Picinguaba those from Santa Virginia. The BOX-PCR gel profiles showed variation in number and mobility of bands. The data was transformed into a binary matrix of presence and absence that allowed the hierarchical cluster analysis of eight genotypic groups with more than 80% similarity, again comparing both isolates Picinguaba and Santa Virginia. Through partial sequencing of 16S rRNA gene fragments no statistically significant difference was found between the diazotrophs community structures of Picinguaba the and that of Santa Virginia , indicating no selection for specific bacterial populations in these areas. In both isolates tested, 88% showed cowpea nodulating capacity, but some were not effective in promoting plant growth. In both areas OTUs phylogenetically associated with nodule of genus Paenibacillus predominated, suggesting that these bacteria are important for legume nodulation in the Atlantic Rainforest.

Beijerinckia sp., bactéria de vida livre fixadora de nitrogênio, comumente encontrada em solos tropicais lateríticos. A cianoficina produzida por cianobactérias é a única reserva nitrogenada intracelular descrita até hoje. O presente trabalho teve como principal objetivo verificar o acúmulo de material nitrogenado intracelular associado à Fixação Biológica de Nitrogênio em cinco isolados de Beijerinckia da rizosfera de cana-de-açúcar (Saccharum sp.). Os resultados mostraram um aumento na concentração de proteína celular total concomitantemente a atividade da nitrogenase durante a fase estacionária de todos os isolados. A fixação de nitrogênio durante esta fase sugere que o destino do nitrogênio fixado seriam os grânulos de armazenamento. A análise química desta reserva confirmou a presença de arginina em teor muito elevado em relação aos demais aminoácidos sugerindo uma reserva nitrogenada diferente da cianoficina. Em recombinantes de Escherichia coli confirmou-se um possível gene envolvido no armazenamento de material nitrogenado em Beijerinckia sp. / Beijerinckia sp. bacteria free-living nitrogen-fixing, commonly found in tropical lateritic soils. The cyanophycin produced by cyanobacteria is the only intracellular nitrogen reserve described to date. This study aimed to verify the intracellular buildup of nitrogen associated with Biological Nitrogen Fixation in five Beijerinckia isolated from the rhizosphere of sugarcane (Saccharum sp.). The results showed an increase in total cellular protein concentration concomitantly nitrogenase activity during the stationary phase of all isolates. The nitrogen fixation during this phase suggests that the fate of fixed nitrogen would be the storage granules. Chemical analysis of the reserve confirmed the presence of very high content of arginine in relation to other amino acids suggesting a different reserve of cyanophycin. In recombinant Escherichia coli confirmed a possible gene involved in nitrogen storage material in Beijerinckia sp.

O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da inoculação com rizóbio no estabelecimento, crescimento inicial e em alguns aspectos da dinâmica de N em folhas de leguminosas (Fabaceae) arbóreas nativas plantadas por semeadura direta no campo, em área de mata ciliar no Estado de São Paulo. Foi avaliada a emergência de plântulas (% em relação ao número de sementes plantadas) até os 3 meses após a semeadura (MAS) e o crescimento em altura aos 13 MAS. O fracionamento isotópico do N foliar também foi avaliado, pelo método da abundância natural do 15N, além da concentração de N e a razão C/N foliar. Acacia polyphylla foi usada como planta-referência não-fixadora de N2. Em relação ao desenvolvimento inicial, houve grande variação entre as espécies estudadas. Acacia polyphylla e Enterolobium contortisiliquum apresentaram taxa de germinação mediana e rápido crescimento. Mimosa bimucronata e Parapiptadenia rigida tiveram crescimento relativamente rápido, porém baixo potencial germinativo. Erythrina speciosa e Poecilanthe parviflora, com crescimento lento, apresentaram germinação elevada no campo. As espécies fixadoras de N2 mostraram &#948;15 N médio de 2,7&#8240;, enquanto que a referência Acacia polyphylla se mostrou cerca de 4,0&#8240; mais enriquecida em 15N . Erythrina speciosa e Ormosia arborea apresentaram os menores valores de &#948;15N, enquanto que Parapiptadenia rigida, enriquecida em 15N, mostrou estar obtendo N exclusivamente do solo. Poecilanthe parviflora, Mimosa bimucronata e Enterolobium contortisiliquum apresentaram valores intermediários de &#948;15N, com grande variação entre os indivíduos amostrados. A concentração de N nos tecidos foliares variou entre 1,5% e 3,6%. De forma geral, esta variável não mostrou relação direta com o &#948;15N das plantas. A menor razão C/N foi observada em Enterolobium contortisiliquum e Erythrina speciosa, seguida por M. bimucronata. Nas condições experimentais locais, as plantas não responderam à inoculação com rizóbio em nenhum dos parâmetros avaliados (estabelecimento, crescimento inicial, &#948;15N, concentração de N e razão C/N). As espécies de crescimento mais lento e com alta incidência de herbivoria observados no campo (E. speciosa e O. arborea) foram também as que apresentaram &#948;15N na faixa considerada como de ocorrência da fixação biológica de nitrogênio. Os resultados indicam, para as outras espécies, maior aquisição de N proveniente do solo. / The aim of this work was to assess the effect of rhizobia inoculation on the establishment, early growth and some aspects of N dynamics in direct-seeded native legume (Fabaceae) trees in a riparian zone of São Paulo State, Southeastern Brazil. Seedling emergency (% of total planted seeds) was evaluated until three months after sowing (MAS), and the height of the trees were measured at 13 MAS. Isotopic N fractionation was also assessed by the 15N natural abundance method, as well as foliar N content and C/N ratio. Acacia polyphylla was used as a non-N2-fixing reference plant. Acacia polyphylla and Enterolobium contortisiliquum grew most rapidly, with moderate germination rate. Mimosa bimucronata and Parapiptadenia rigida were fast-growing but with low establishment rate. Erythrina speciosa and Poecilanthe parviflora showed low growing rate, but high germination potential. The N2-fixers showed an average foliar &#948;15N of 2,7&#8240;, while the reference-plant was 4,0&#8240; more <sup15>N enriched. Erythrina speciosa and Ormosia arborea showed the lowest &#948;15N values. The high &#948;15N of Parapiptadenia rigida probably indicated that it is obtaining N exclusively from the soil. Poecilanthe parviflora, Mimosa bimucronata and Enterolobium contortisiliquum showed intermediate &#948;15N values, with strong variations among the sampled individuals. Foliar N concentrations varied from 1,5% to 3,6%. In general, N concentrations were not correlated with foliar &#948;15N . The lowest C/N ratio was observed on E. contortisiliquum and E. speciosa , followed by M. bimucronata. In this field trial conditions, rhizobia inoculation did not show differences in all surveyed parameters (establishment, early growth, foliar &#948;15N, total N content and C/N ratio of trees). The slow-growing species, E. speciosa and O. arborea , that also had a high herbivore attack observed in the field, showed foliar &#948;15N in the biological N2 fixation range. The results suggested, for the other species, a larger soil N acquisition.

Os manguezais estão localizados na interface entre o continente e o oceano em regiões intertropicais, possuindo condições ambientais únicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade e o potencial biotecnológico da comunidade de Pseudomonas spp. em sedimentos de manguezais com diferentes estágios de preservação, no Estado de São Paulo. A diversidade de Pseudomonas spp. foi avaliada por meio da detecção do gene 16S rRNA e do gene gacA de isolados de Pseudomonas, como também por métodos independentes de cultivo. Dos 83 isolados obtidos, 55 foram positivos para o gene gacA. De acordo com as análises de DGGE e da biblioteca de clones, os diferentes manguezais apresentam comunidades de Pseudomonas bem distintas. Entre as espécies caracterizadas, P. nitroreducens e P. fluorescens foram predominantes. Pseudomonas de manguezais halotolerantes produzem AIA, ACC deaminase, NH3, solubilizam fosfato e fixam nitrogênio. Estudos demonstraram o potencial de Pseudomonas para promoção de crescimento de milho e redução dos efeitos do estresse salino sobre a planta. / Mangroves are located at the interface of continent and ocean in intertropical regions, possessing unique environmental conditions. The objective of this study was to evaluate the diversity and biotechnological potential of Pseudomonas spp. community in mangrove sediments under different stages of preservation in the São Paulo state. Pseudomonas spp. diversity was analyzed through the detection of 16S rRNA gene and gacA gene of Pseudomonas isolates, as well as through cultive independent methods. Of the 83 isolates, 55 were positive for gacA gene. According to DGGE and clone library analysis, the different mangroves showed very distinct Pseudomonas communities. Among the characterized species by 16S rRNA gene, P. nitroreducens and P. fluorescens were dominant. Pseudomonas mangrove halotolerant produce IAA, ACC deaminase, NH3, solubilize phosphate and fix nitrogen. Studies demonstrated the potential of Pseudomonas for maize growth promotion and reduce the effects of salt stress on the plant.

Diazotróficos de vida-livre podem ser encontradas associadas à filosfera, dermosfera e rizosfera das espécies vegetais. Alguns dados sugerem que a fixação biológica de N2 (FBN) por bactérias assimbióticas representa uma entrada importante de nitrogênio nos ecossistemas tropicais, variando com as espécies vegetais e nas diferentes partes da planta. O presente trabalho teve como objetivos estimar a quantidade de N2 fixado de forma assimbiótica na filosfera, dermosfera e rizosfera sobre a copa das espécies vegetais Guapira oposita e Euterpe edulis, e avaliar a diversidade das bactérias assimbióticas, através da análise do gene rRNA 16S, em uma Restinga ,em Ubatuba, SP. O estudo foi realizado no Parque Estadual da Serra do Mar, Núcleo Picinguaba, em épocas de baixa e alta pluviosidade. A atividade da nitrogenase foi determinada pela técnica de redução do acetileno e as concentrações de etileno foram determinadas por cromatografia gasosa. A diversidade de bactérias que habitam filosfera, dermosfera e solo foi acessada por pirosequenciamento da região V4 do gene rRNA 16S. A maior fixação de N foi observada na dermosfera de E. edulis nas duas épocas de coleta (175,1± 53,4 ng cm-2 h-1; 97,2 ± 21 ng cm-2 h-1), as taxas de fixação de N mais baixas foram observadas no solo. Na época de alta pluviosidade, a FBN na filosfera de G. oposita (52,0 ± 12 ng cm-2 h-1) foi significativamente maior do que a filosfera de E. edulis (3,6 ± 06 ng cm-2. h-1) e do que no mesmo compartimento mas em diferentes épocas de coleta (7,5 ± 1,3 ng cm-2 h-1). O valor do 15N foi maior no solo onde a fixação de N foi mais baixa. Na filosfera e na dermosfera, a relação C/N foi mais baixa quando a FBN foi mais alta. A FBN no solo e serrapilheira de restinga apresentou grande variação espacial, com locais de alta atividade. As 188629 sequências obtidas foram agrupadas em 16727 Unidades Taxonômicas Operacionais (UTOs), distribuídos em 35 filos. Os principais filos detectados foram Proteobacteria (38%) e Acidobacteria (12%). As classes Alphaproteobacteria e Gammaproteobacteria foram as mais abundantes nos três compartimentos. Potenciais fixadores de N foram detectados nas classes Alpha Beta e Gammaproteobacteria. A abundância de cianobacterias fixadoras de N na filosfera e na dermosfera foi baixa, indicando que outros diazotróficos também colonizam esses ambientes e contribuem com a FBN. / Free-living N2 fixing bacteria can be found associated with the phyllosphere, bark and rizosphere of the diferent plant species. Some data suggest that biological N2 fixation (BNF) by free-living bacteria represents an important input of nitrogen in tropical ecosystem, varying with the plant species and in different parts of the plant. This study aimed to estimate the amount of N2 fixed in the phyllosphere, bark and soil under the canopy of Guapira opposite and Euterpe edullis, and evaluate the diversity of bacteria through the sequencing of the 16S rRNA gene analysis, the phyllosphere, bark and soil in a Restinga area, Ubatuba, SP. The study was conducted in the Parque Estadual da Serra do Mar, Núcleo Picinguaba in seasons of low and high rainfall. Nitrogenase activity was determined by the acetylene reduction assay (ARA) and ethylene concentrations were determined by gas chromatography. The diversity of bacteria in the phyllosphere, bark and soil was accesed using pyrosequencing of the 16S rRNA V4 region. The bark of Euterpe edullis was higher at both sampling times (175,1±53,4 ng. cm-2. h-1, 97,2±21 ng. cm-2. h-1). The BNF rates were lower in soil. In high rainfall conditions, the BNF in the phyllosphere of Guapira opposite increased significantly (52,0±12 ng. cm-2. h-1) when compared with Euterpe edullis (3,6 ± 06 ng. cm-2. h-1) and Guapira opposite (7,5 ± 1,3 ng. cm-2. h-1) phyllosphere. The value of 15N was higher in the soil where the rates of FBN was lower. In the phyllosphere and bark, C/N was lower when BNF was higher. BNF in soil great spatial variation with areas of high activity. The 18.629 sequences obtained were grouped into 16.727 Operational Taxonomic Units (OTUs) distributed in 35 phyla. The main phyla Proteobacteria represented 38% of the OTUs and Acidobacteria 12% of the UTOs. The classes Alphaproteobacteria and Gammaproteobacteria were the most abundant in the three compartmens. Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria and Gammaproteobacteria were the main potential N-fixers. The abundance of nitrogen-fixing Cyanobacteria in the phyllosphere and bark was low, indicating that others diazotrophics also colonize these environments and contribute with BNF.

Diazotróficos de vida-livre podem ser encontradas associadas à filosfera, dermosfera e rizosfera das espécies vegetais. Alguns dados sugerem que a fixação biológica de N2 (FBN) por bactérias assimbióticas representa uma entrada importante de nitrogênio nos ecossistemas tropicais, variando com as espécies vegetais e nas diferentes partes da planta. O presente trabalho teve como objetivos estimar a quantidade de N2 fixado de forma assimbiótica na filosfera, dermosfera e rizosfera sobre a copa das espécies vegetais Guapira oposita e Euterpe edulis, e avaliar a diversidade das bactérias assimbióticas, através da análise do gene rRNA 16S, em uma Restinga ,em Ubatuba, SP. O estudo foi realizado no Parque Estadual da Serra do Mar, Núcleo Picinguaba, em épocas de baixa e alta pluviosidade. A atividade da nitrogenase foi determinada pela técnica de redução do acetileno e as concentrações de etileno foram determinadas por cromatografia gasosa. A diversidade de bactérias que habitam filosfera, dermosfera e solo foi acessada por pirosequenciamento da região V4 do gene rRNA 16S. A maior fixação de N foi observada na dermosfera de E. edulis nas duas épocas de coleta (175,1± 53,4 ng cm-2 h-1; 97,2 ± 21 ng cm-2 h-1), as taxas de fixação de N mais baixas foram observadas no solo. Na época de alta pluviosidade, a FBN na filosfera de G. oposita (52,0 ± 12 ng cm-2 h-1) foi significativamente maior do que a filosfera de E. edulis (3,6 ± 06 ng cm-2. h-1) e do que no mesmo compartimento mas em diferentes épocas de coleta (7,5 ± 1,3 ng cm-2 h-1). O valor do 15N foi maior no solo onde a fixação de N foi mais baixa. Na filosfera e na dermosfera, a relação C/N foi mais baixa quando a FBN foi mais alta. A FBN no solo e serrapilheira de restinga apresentou grande variação espacial, com locais de alta atividade. As 188629 sequências obtidas foram agrupadas em 16727 Unidades Taxonômicas Operacionais (UTOs), distribuídos em 35 filos. Os principais filos detectados foram Proteobacteria (38%) e Acidobacteria (12%). As classes Alphaproteobacteria e Gammaproteobacteria foram as mais abundantes nos três compartimentos. Potenciais fixadores de N foram detectados nas classes Alpha Beta e Gammaproteobacteria. A abundância de cianobacterias fixadoras de N na filosfera e na dermosfera foi baixa, indicando que outros diazotróficos também colonizam esses ambientes e contribuem com a FBN. / Free-living N2 fixing bacteria can be found associated with the phyllosphere, bark and rizosphere of the diferent plant species. Some data suggest that biological N2 fixation (BNF) by free-living bacteria represents an important input of nitrogen in tropical ecosystem, varying with the plant species and in different parts of the plant. This study aimed to estimate the amount of N2 fixed in the phyllosphere, bark and soil under the canopy of Guapira opposite and Euterpe edullis, and evaluate the diversity of bacteria through the sequencing of the 16S rRNA gene analysis, the phyllosphere, bark and soil in a Restinga area, Ubatuba, SP. The study was conducted in the Parque Estadual da Serra do Mar, Núcleo Picinguaba in seasons of low and high rainfall. Nitrogenase activity was determined by the acetylene reduction assay (ARA) and ethylene concentrations were determined by gas chromatography. The diversity of bacteria in the phyllosphere, bark and soil was accesed using pyrosequencing of the 16S rRNA V4 region. The bark of Euterpe edullis was higher at both sampling times (175,1±53,4 ng. cm-2. h-1, 97,2±21 ng. cm-2. h-1). The BNF rates were lower in soil. In high rainfall conditions, the BNF in the phyllosphere of Guapira opposite increased significantly (52,0±12 ng. cm-2. h-1) when compared with Euterpe edullis (3,6 ± 06 ng. cm-2. h-1) and Guapira opposite (7,5 ± 1,3 ng. cm-2. h-1) phyllosphere. The value of 15N was higher in the soil where the rates of FBN was lower. In the phyllosphere and bark, C/N was lower when BNF was higher. BNF in soil great spatial variation with areas of high activity. The 18.629 sequences obtained were grouped into 16.727 Operational Taxonomic Units (OTUs) distributed in 35 phyla. The main phyla Proteobacteria represented 38% of the OTUs and Acidobacteria 12% of the UTOs. The classes Alphaproteobacteria and Gammaproteobacteria were the most abundant in the three compartmens. Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria and Gammaproteobacteria were the main potential N-fixers. The abundance of nitrogen-fixing Cyanobacteria in the phyllosphere and bark was low, indicating that others diazotrophics also colonize these environments and contribute with BNF.

O presente trabalho estudou as relações entre as taxas de fixação biológica de nitrogênio (FBN), a composição e a diversidade da comunidade de bactérias diazotróficas de vida livre em três compartimentos: solo sob a copa, filosfera e dermosfera de diferentes espécies arbóreas, sendo que dermosfera foi avaliada em apenas duas espécies. As plantas escolhidas foram Euterpe edulis (Palmito juçara) Guapira opposita (Louro-branco) e Merostachys neesii (Bambu) presentes na Floresta Ombrófila Densa (FOD) de terras baixas e montanas do Parque Estadual da Serra do Mar, no Estado de São Paulo Brasil. As taxas de FBN foram estimadas pela técnica de redução de acetileno (ARA) através da relação teórica 3:1, baseada na redução de três moles de acetileno para cada mol de N fixado, e a composição da comunidade bacteriana foi acessada pelo sequenciamento parcial do gene rRNA 16S usando pirossequenciador. Foram encontradas diferenças nas estimativas das taxas de FBN que variaram entre as espécies arbóreas e principalmente entre os substratos. Os testes de comparação de médias indicaram que, nas árvores amostradas, as taxas de FBN aumentaram na ordem: solo sob a projeção da copa, filosfera e dermosfera. A maior FBN foi observada na dermosfera de E. edulis, no PESM-Santa Virginia, durante o verão (630,12±27,28 ng N cm-2 h-1) e a menor FBN no solo de G. opposita PESM-Santa Virginia, também no verão (0,49±0,17 ng N cm-2 h-1). A FBN da serapilheira e do solo não associado com as espécies arbóreas apresentou grande variabilidade espacial nas duas áreas amostradas, mas não apresentou variações sazonais. O pirosequenciamento do gene rRNA 16S mostrou que solo sob a copa, filosfera e dermosfera das espécies arbóreas avaliadas possuem comunidades bacterianas distintas, além destas serem também influenciadas pelo local de amostragem. A comunidade epifítica da dermosfera também foi influenciada pela espécie arbórea. Foram obtidas 423210 sequências que foram agrupadas em 35216 unidades taxonômicas operacionais (UTOs), distribuídas em 32 filos, dentre os quais o mais abundante foi o filo Proteobacteria (36,6%). Dos possíveis diazotróficos observados, o filo Proteobacteria foi dominante nos três compartimentos avaliados, com predomínio da classe Alphaproteobacteria, principalmente na filosfera de M. neesii. A presença de cianobactérias foi maior na dermosfera, e Firmicutes no solo sob a projeção da copa, sugerindo que a comunidade bacteriana é altamente diversificada e tende variar espacialmente. / In this study we estimate the relationship between biological nitrogen fixation (BNF) rates and composition and diversity of free-living diazotrophic bacteria in phyllosphere and soil under the canopy of tree species, Euterpe edulis (Juçara palmito), Guapira opposita (\"Louro-branco\"),and Merostachys neesii (Bamboo) in lowland and montane dense ombrophilous forests (DOFs) at the Serra do Mar State Park, Brazil; bark was also evaluated in the first two tree species. BNF rates were estimated by acetylene reduction activity (ARA) using the 3:1 theoretical ratio, based on the reduction of three acetylene moles per each N mole fixed. Bacterial community composition was evaluated by partial 16S rRNA gene sequencing with a pyrosequencer. Analysis of variance showed highly significant estimated for BNF rates, which widely varied between tree species and especially between substrates. Mean comparison tests indicated that higher BNF rates followed the following order: soil under projected canopy, phyllosphere, and bark, respectively. The highest BNF rate was observed in E. edulis bark(630.12±27.28 ng N cm-2 h-1) and the lowest BNF rate in soil under G. opposita canopy (0.49±0.17 ng N cm-2 h-1), both at the PESMSanta Virginia site in the summer. The BNF in leaf litter and soil unassociated with tree species exhibited high spatial variability in two sampling sites, but this does not indicate a temporal trend in higher BNF rates between winter and summer. Pyrosequencing of the rRNA 16S gene showed that each component of the tree species evaluated harbors a distinct bacterial community. In bark, phyllosphere, and soil the under projected canopy of trees sampled, the results demonstrated influence by sampling site. We also observed that there was influence of tree species on the epiphytic community in bark. The 423, 210sequences obtained were grouped into35,216 operational taxonomic units (OTUs), distributed among 32 phyla, with highest abundance of Proteobacteria (36.6%). Between the possible diazotrophs observed, Proteobacteria was dominant among the three components evaluated, with predominance of the class Alphaproteobacteria, especially in M. neesii phyllosphere. The presence of cyanobacteria was higher in bark and Firmicutes in soil under projected canopy of the trees sampled, suggesting that the bacterial community is highly diverse and tends to spatially vary.

O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da inoculação com rizóbio no estabelecimento, crescimento inicial e em alguns aspectos da dinâmica de N em folhas de leguminosas (Fabaceae) arbóreas nativas plantadas por semeadura direta no campo, em área de mata ciliar no Estado de São Paulo. Foi avaliada a emergência de plântulas (% em relação ao número de sementes plantadas) até os 3 meses após a semeadura (MAS) e o crescimento em altura aos 13 MAS. O fracionamento isotópico do N foliar também foi avaliado, pelo método da abundância natural do 15N, além da concentração de N e a razão C/N foliar. Acacia polyphylla foi usada como planta-referência não-fixadora de N2. Em relação ao desenvolvimento inicial, houve grande variação entre as espécies estudadas. Acacia polyphylla e Enterolobium contortisiliquum apresentaram taxa de germinação mediana e rápido crescimento. Mimosa bimucronata e Parapiptadenia rigida tiveram crescimento relativamente rápido, porém baixo potencial germinativo. Erythrina speciosa e Poecilanthe parviflora, com crescimento lento, apresentaram germinação elevada no campo. As espécies fixadoras de N2 mostraram &#948;15 N médio de 2,7&#8240;, enquanto que a referência Acacia polyphylla se mostrou cerca de 4,0&#8240; mais enriquecida em 15N . Erythrina speciosa e Ormosia arborea apresentaram os menores valores de &#948;15N, enquanto que Parapiptadenia rigida, enriquecida em 15N, mostrou estar obtendo N exclusivamente do solo. Poecilanthe parviflora, Mimosa bimucronata e Enterolobium contortisiliquum apresentaram valores intermediários de &#948;15N, com grande variação entre os indivíduos amostrados. A concentração de N nos tecidos foliares variou entre 1,5% e 3,6%. De forma geral, esta variável não mostrou relação direta com o &#948;15N das plantas. A menor razão C/N foi observada em Enterolobium contortisiliquum e Erythrina speciosa, seguida por M. bimucronata. Nas condições experimentais locais, as plantas não responderam à inoculação com rizóbio em nenhum dos parâmetros avaliados (estabelecimento, crescimento inicial, &#948;15N, concentração de N e razão C/N). As espécies de crescimento mais lento e com alta incidência de herbivoria observados no campo (E. speciosa e O. arborea) foram também as que apresentaram &#948;15N na faixa considerada como de ocorrência da fixação biológica de nitrogênio. Os resultados indicam, para as outras espécies, maior aquisição de N proveniente do solo. / The aim of this work was to assess the effect of rhizobia inoculation on the establishment, early growth and some aspects of N dynamics in direct-seeded native legume (Fabaceae) trees in a riparian zone of São Paulo State, Southeastern Brazil. Seedling emergency (% of total planted seeds) was evaluated until three months after sowing (MAS), and the height of the trees were measured at 13 MAS. Isotopic N fractionation was also assessed by the 15N natural abundance method, as well as foliar N content and C/N ratio. Acacia polyphylla was used as a non-N2-fixing reference plant. Acacia polyphylla and Enterolobium contortisiliquum grew most rapidly, with moderate germination rate. Mimosa bimucronata and Parapiptadenia rigida were fast-growing but with low establishment rate. Erythrina speciosa and Poecilanthe parviflora showed low growing rate, but high germination potential. The N2-fixers showed an average foliar &#948;15N of 2,7&#8240;, while the reference-plant was 4,0&#8240; more <sup15>N enriched. Erythrina speciosa and Ormosia arborea showed the lowest &#948;15N values. The high &#948;15N of Parapiptadenia rigida probably indicated that it is obtaining N exclusively from the soil. Poecilanthe parviflora, Mimosa bimucronata and Enterolobium contortisiliquum showed intermediate &#948;15N values, with strong variations among the sampled individuals. Foliar N concentrations varied from 1,5% to 3,6%. In general, N concentrations were not correlated with foliar &#948;15N . The lowest C/N ratio was observed on E. contortisiliquum and E. speciosa , followed by M. bimucronata. In this field trial conditions, rhizobia inoculation did not show differences in all surveyed parameters (establishment, early growth, foliar &#948;15N, total N content and C/N ratio of trees). The slow-growing species, E. speciosa and O. arborea , that also had a high herbivore attack observed in the field, showed foliar &#948;15N in the biological N2 fixation range. The results suggested, for the other species, a larger soil N acquisition.

A Brachiaria brizantha é considerada uma das forrageiras preferidas entre os agropecuaristas por possuir elevada produção de forragem, tolerância ao calor e ao déficit hídrico, alta resposta à aplicação de fertilizantes, produção em grande massa de raízes e sementes, resistência à cigarrinha das pastagens (exceto as pertencentes ao gênero Mahanarva) e boa competição com plantas invasoras. É considerada a principal fonte de alimento para bovinos, sendo utilizada tanto na cria, recria, como na engorda dos animais. As bactérias fixadoras de nitrogênio ou diazotróficas são procariotos capazes de reduzir o N2 a NH3, forma assimilável pelos organismos, e também podem produzir hormônios vegetais, como ácido-indol-acético, que estimulam o crescimento radicular da planta. Estes micro-organismos apresentam grande importância para a manutenção dos ecossistemas. Sua associação com as raízes de plantas e seu efeito promotor quando associados à Brachiaria brizantha possibilitaria a recuperação de áreas de pastagens que apresentam deficiência de nitrogênio, o que é um mecanismo ainda pouco explorado. Com o objetivo de estudar esta possibilidade, foram escolhidas três áreas (Nova Odessa-SP, São Carlos- SP e Campo Verde-MT), preferencialmente onde o nitrogênio era limitante, constituídas por pastagem de Brachiaria brizantha para a amostragem de solo e raiz. Os três locais demonstraram a ocorrência de diazotróficos, após o isolamento e cultivo das bactérias em meio de cultivo semisólido sem adição de nitrogênio na forma combinada (JNFb). Foram obtidas 110 estirpes bacterianas e, após sorteio aleatório, 72 isolados foram mantidos para realização de testes a fim de se avaliar o potencial biotecnológico das bactérias. Destes, 10 demonstraram atividade da nitrogenase quando submetidos ao método de aumento na concentração de nitrogênio total (Ntotal) em meio de cultura. 57 isolados foram capazes de reduzir o gás acetileno a etileno quando submetidos à técnica de redução de acetileno. As estirpes bacterianas C4 (Pseudomonas sp.) e C7 (Azospirillum sp.), isoladas da rizosfera de Brachiaria brizantha da área de Campo Verde-MT, se destacaram das demais por apresentar atividade da nitrogenase muito superior até a de bactérias diazotróficas que foram incluídas na avaliação como testemunhas positivas. Outros 68 isolados produziram o hormônio vegetal ácido-indol-acético quando cultivados em meio de cultivo LB, na presença de triptofano. A produção variou de 0,39µg/mL a 195 µg/mL de AIA. Todos os 72 isolados foram utilizados em experimento em casa de vegetação para avaliar o efeito de inoculação em B. brizantha quando com eles inoculada. Avaliaram-se a matéria seca da parte aérea e raiz e o teor de nitrogênio total da parte aérea através do método micro-Kjeldhal. Nenhum isolado diferiu significativamente do controle sem inoculação bacteriana que continha a mesma dose de nitrogênio fornecido às plantas. O seqüenciamento parcial do gene 16S rRNA dos 72 isolados permitiu a caracterização de sete grupos genotípicos: Stenotrophomonas sp, Pseudomonas sp., Xanthomonas sp., Bacillus sp., Rhizobium sp, Sphingomonas sp. e Azospirillum sp. O gênero Stenotrophomonas sp. predominou (69%) nas três áreas de estudo. / Brachiaria brizantha is considered one of preferred fodders among farmers for having high forage yield, tolerance to heat and drought, high response to fertilizer application, large production of root mass and seeds, resistance to grassland leafhopper (except those belonging to the genus Mahanarva) and good competition with weeds. It is considered the main source of food for cattle, being used in the raising, breeding, and fattening of animals. The nitrogen fixing bacteria or diazotrophs are prokaryotes able to reduce N2 to NH3, which is assimilated by organisms, and may also produce plant hormones such as indole-acetic acid, which stimulates root growth. These micro-organisms have great importance for the maintenance of ecosystems. Their association with plant roots and their promoting effect when combined with Brachiaria brizantha enable recovery of nitrogen-deficient grazing areas, which is a mechanism still little explored. Therefore, three areas were chosen (Nova Odessa-SP, Sao Carlos-SP and Campo Verde-MT), preferably where nitrogen was limiting, consisting of Brachiaria brizantha from which samples of soil and roots were collected. The three sites showed the occurrence of diazotrophs after the isolation and cultivation of bacteria in semi-solid culture medium with no nitrogen added in the combined form (JNFb). It was obtained 110 bacterial strains and, after the raffle random, 72 were kept isolated for testing in order to assess the biotechnological potential of bacteria. From which, 10 showed nitrogenase activity when subjected to the method of total nitrogen concentration increase (N-total) in the culture medium. 57 isolates were able to reduce acetylene to ethylene when subjected to the acetylene reduction technique. The strains C4 (Pseudomonas sp.) and C7 (Azospirillum sp.), isolated from the rhizosphere of Brachiaria brizantha in the area of Campo Verde-MT, stood out from the others by presenting nitrogenase activity far superior to that of diazotrophs recommended as positive controls. Other 68 isolates produced the plant hormone indole-acetic acid when grown in LB culture medium in the presence of tryptophan. Production ranged from 0.39 g/mL to 195 g/mL of IAA. All 72 isolates were used in an experiment in a greenhouse to evaluate the effect of inoculation on B. brizantha. Evaluations were carried out on dry matter of shoot and root and total nitrogen content of the shoot through the micro-Kjeldahl method. None of the isolates differed significantly from the control without bacterial inoculation which contained the same amount of nitrogen supplied to plants. Partial sequencing of the 16S rRNA of the 72 isolates allowed the characterization of seven genotype groups: Stenotrophomonas sp., Pseudomonas sp., Xanthomonas sp., Bacillus sp., Rhizobium, Sphingomonas sp. and Azospirillum sp. The genus Stenotrophomonas sp. predominated (69%) in the three study areas.

A soja, [Glycine max (L.) Merrill] é uma das espécies com maior teor protéico, contendo cerca de 40% de proteína nos grãos. Em conseqüência disso demanda alta quantidade de nitrogênio (N), o qual pode ser suprido pelo processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN), através da simbiose com as bactérias do gênero Bradyrhizobium. No Brasil, a FBN é capaz de suprir toda a demanda de N da cultura da soja, dispensando a aplicação de fertilizantes nitrogenados. No entanto, os caracteres relacionados à FBN não têm sido diretamente considerados em programas de melhoramento genético, em função das dificuldades inerentes às avaliações dos mesmos, que requerem a destruição das plantas. O objetivo deste trabalho foi mapear os locos de caracteres quantitativos (Quantitative Trait Loci: QTLs) dos caracteres relacionados à FBN, visando identificar associações úteis para a seleção assistida por marcadores, bem como obter outras informações sobre a base genética destes caracteres em soja. Uma população composta de 157 F2:7 linhagens endogâmicas recombinantes (Recombinant Inbred Lines RILs), derivada de um cruzamento biparental, foi genotipada com 105 marcadores microssatélites, bem como avaliada para os seguintes caracteres relacionados com a FBN: número de nódulos (NN); peso seco dos nódulos (MNS); peso médio dos nódulos secos (MNS/NN) e peso seco da parte aérea (MPAS). Utilizando o método de mapeamento por intervalo composto para múltiplas características (mCIM) foram mapeados os QTLs para os quatro caracteres. Um mapa genético foi construído com um tamanho estimado em 1.263,2 cM, correspondendo a uma cobertura de 50% do genoma. Oito regiões genômicas foram associadas com os caracteres de FBN. Quatro dessas regiões, localizadas nos grupos de ligação (GL) C1, C2, E e I, foram associadas a mais de um caráter: no GL C1 (Satt190-Satt136) foram mapeados QTLs para MNS, MNS/NN e MPAS; no GL C2 (Satt460-Satt307) foram mapeados QTLs para NN e MNS; no GL E (Satt573-SAtt185) foram mapeados QTLs para MPAS e NN; e no GL I (Satt239-Satt354) foram mapeados QTLs para MNS/NN e NN. A associação dos QTLs nos GL C1, C2 e E foi atribuída à pleiotropia, enquanto que no GL I foi atribuída à ligação gênica. Os QTLs influenciando apenas um caráter foram mapeados nos GL A2, B1, G e L: no GL A2 (Sct067-Satt589) foi mapeado um QTL para MNS/NN; no GL B1 (Satt509-Satt251) foi mapeado um QTL para NN; no GL L (Satt232-Satt418) foi mapeado um QTL para MPAS; e no GL G (Satt394-Satt288) foi mapeado um QTL para MPAS. Os QTLs explicaram, individualmente, muito pouco da variação fenotípica (R2 = 1,2% a 10,0%), sendo o QTL mais significativo mapeado no GL L para MPAS, e explicou 10,0% da variação do caráter, com um efeito aditivo de 0,57 g planta-1. Portanto, foram detectados QTLs em quatro regiões para MPAS (C1, E, G e L), em cinco regiões para NN (B1, C1, C2, E, G); em duas regiões para MNS (C1, C2) e em três regiões para MNS/NN (A2, C1, I) que explicaram 23,0%, 20,0%, 11,8% e 16,0% da variação fenotípica total, respectivamente. Estes resultados estão de acordo com as herdabilidade relativamente baixas dos caracteres (28% a 49%) e refletem a natureza complexa da FBN, que está sob influência ambiental. / Soybeans [Glycine max (L.) Merrill] is a crop with high protein content (about 40%) in the seeds. As a result, the crop demands high nitrogen (N) inputs, which can be supplied by the process of biological nitrogen fixation (BNF), through the symbiosis with bacteria of the genus Bradyrhizobium. In Brazil the BNF allows to fulfill all the demand for N; therefore N fertilizers are not required. However, the traits associated with BNF have not been directly considered in breeding programs due to the difficulties to its evaluation, which require, generally, the plant destruction. The objective of this study was to map Quantitative Trait Loci (QTLs) of traits related to BNF and to identify useful associations for marker-assisted selection, as well as to obtain other information about the genetic basis of these traits in soybeans. A population of 157 F2:7 recombinant inbred lines (RILs), derived from a two-way cross, were genotyped with 105 microsatellite markers as well as evaluated for the following traits related with BNF: number of nodes (NN); nodule dry weight (NDW); mean nodule dry weight (NDW/NN); and shoot dry weight (SDW). Using the composite interval mapping for multiple traits (mCIM) method, the QTLs were mapped for all the traits. A genetic map was constructed with an estimated size of 1,263.2 cM, covering about 50% of the genome. Eight genomic regions were associated with the four traits and four of these regions, located on linkage groups (LG) C1, C2, E and I, were associated with more than one trait: in LG C1 (Satt190-Satt136), QTLs for NDW, NDW/NN and SDW were mapped; in LG C2 (Satt460-Satt307), QTLs for NN and NDW were mapped; in GL E (Satt573-SAtt185), QTLs for SDW and NN were mapped; and in GL I (Satt239-Satt354) QTLs for NDW/NN and NN were mapped. The pleiotropy was attributed to QTL association in the LG C1, C2, and E, whereas genetic linkage was attributed to QTL association in LG I. QTLs affecting only one trait were mapped in LG A2, B1, G and L: in LG A2 (Sct067-Satt589) a QTL was mapped, for NDW/NN; in LG B1 (Satt509-Satt251) a QTL was mapped for NN; in LG L (Satt232-Satt418) a QTL was mapped for SDW; and in LG G (Satt394- Satt288) a QTL was mapped for SDW. The QTLs individually explained very little of the phenotypic variation (R2 = 1.2% to 10.0%), and the most significant QTL was mapped in the LG L, explaining 10.0% of the variation for SDW, with an additive effect of 0.57 g plant-1. Therefore, QTLs in four regions were detected for SDW (C1, E, G, and L), in five regions for NN (B1, C1, C2, E, and G), in two regions for NDW (C1, and C2) and in three regions for SDW/NN (A2, C1, and I), which explained 23.0%, 20.0%, 11.8% and 16.0% of phenotypic variation, respectively. These results are in agreement with the relatively low heritability of the traits (28% to 49%) and reflect the complex nature of BNF traits, which are influenced by the environmental effects.