Les histones linker juguen un paper important en l’organització i manteniment de la cromatina en estructures d'ordre superior i en la regulació transcripcional. La histona H1 en vertebrats té una estructura característica en tres dominis: un domini N-terminal curt i flexible; un domini globular central; i un domini C-terminal llarg. Els dominis N- i C-terminals (CTD) són molt bàsics i es troben desestructurats en solució aquosa. La distribució de càrrega és bastant uniforme al llarg de tot el CTD. La interacció amb el DNA indueix un plegament total i estable del CTD en condicions fisiològiques, fet que permet classificar aquest domini en el grup de les proteïnes intrínsecament desordenades, on el plegament i la unió al lligand estan acoblades. La fosforilació post-traduccional del CTD de la H1 té efectes en l’estructura secundària de la proteïna i en la condensació del DNA. L’estructura secundària de la H10 sencera es va analitzar per espectroscòpia d’infrarroig. La H10, igual que el CTD aïllat, també es plegà degut a la interacció amb el DNA i l’estructura secundària també va ser modulada per fosforilació. El canvi estructural induït per la fosforilació va consistir en un increment de la quantitat d’estructura β, que va esdevenir més significant amb la unió a DNA, on també es va observar una dependència d’aquest increment amb la relació proteïna/DNA. En aquest cas, la proporció d’estructura β va arribar al 54%, suggerint que el CTD en la proteïna sencera presentava una conformació tot-β. Simultàniament, es va observar una reducció significant de l’estructura en hèlix-α, fet que va suggerir una disminució d’aquest element estructural en el domini globular, probablement per la propagació de l’estructura β des del CTD cap a la resta de la proteïna. En presència de SDS, la H10 es va plegar amb percentatges d’estructura secundària similars als observats en la unió al DNA. A una relació molar SDS/proteïna 14:1, la H10 trifosforilada presentava un 55% d’estructura β, indicant que el CTD en la histona H10 també es trobava en una conformació tot-β i formava fibres amiloides. Els nuclis d’eritròcit de pollastre contenen cromatina inerta i altament compacta consistent, principalment, en DNA i proteïnes histona. En aquest estudi, es va emprar aquesta cromatina per analitzar les modificacions post-traduccionals de les histones i l’efecte de la fosforilació per CDK2 en l’agregació de la cromatina. Els nuclis es van digerir amb nucleasa micrococcal i la cromatina es va fraccionar per centrifugació en tampó de baixa força iònica en fraccions soluble i insoluble. Les modificacions post-traduccionals (PTMs) de les histones linker purificades d’ambdues fraccions es van analitzar per Tandem MS. Els sis subtipus d’histona H1 i la histona H5 van ser identificats. En aquest estudi, es van trobar vuit PTMs novells: dues a la histona H5 i sis en els subtipus d’ H1. Algunes de les modificacions van ser identificades específicament en una de les fraccions, suggerint una distribució diferencial d’algunes PTMs en la cromatina. La comparació de les PTMs novells identificades amb altres prèviament descrites en altres espècies va demostrar que la majoria d’elles estan conservades en l’evolució. Atès que les histones linker desenvolupen la seva funció en la cromatina, es va fosforilar ex vivo amb CDK2 els motius S/T-P-X-Z de les histones linker presents en la cromatina d’eritròcit de pollastre; amb l’objectiu d’estudiar l’efecte de la fosforilació en l’agregació de la cromatina. L’anàlisi proteòmic per HPCE i MALDTOF-MS va mostrar que el nombre de grups fosfat va augmentar amb el temps de fosforilació, assolint un 54% d’espècies fosforilades (mono- i di-fosforilades) en el cas de la H5 després de la fosforilació overnight. Experiments de Tandem MS van revelar que, en cap de les histones purificades de la cromatina nativa, cap dels motius S/T-P-X-Z estava fosforilat, indicant que la fosforilació detectada en les mostres tractades amb CDK2 havien estat modificats ex vivo. En H5, nomes S148 va identificar-se en totes les mostres i es trobava fosforilat després d’1 hora. En l’anàlisi per TandemMS de les H1, tots els motius consens de CDK2, excepte S171 (posició en H1.01), es van identificar en els subtipus H1.03, H1.1L i H1.1R. H1.03T16 es va trobar fosforilat després de 15 minuts; H1.1LS192 I H1.1RS186 després d’1 hora; H1.03S155, H1.1LS155 i H1.1RS153 després de 3 hores. Un cop la fosforilació ex vivo de les histones en la cromatina es va comprovar, es va procedir a estudiar l’efecte de la fosforilació en l’agregació de la cromatina induïda per MgCl2 (1.6mM) per Dynamic Light Scattering (DLS). El resultat més significant associat a la fosforilació va ser la disminució del diàmetre hidrodinàmic de les molècules agregades. Aquestes diferències van esdevenir més important amb l’augment del temps de fosforilació i amb la mida dels fragments de cromatina. Els resultats obtinguts van demostrar que la fosforilació de les histones linker impedia l’agregació de la cromatina. / Linker histones play an important role in establishing and maintaining chromatin higher-order structure and in transcriptional regulation. Histone H1 in vertebrates has a characteristic three-domain structure consisting of a short flexible N-terminal domain, a central globular domain and a long C-terminal domain. The amino- and carboxyl-terminal (CTD) domains are highly basic and mainly unstructured in aqueous solution. The charge distribution is quite uniform along the CTD. Because of that, chromatin condensation is mediated through charge-neutralization of the negatively charged linker DNA, facilitating chromatin condensation into the 30nm fibre and also intermolecular aggregation. Interaction with DNA induces the complete folding of the CTD under physiological conditions in a very stable manner, which allows to classify this domain as an intrinsically disordered protein, with coupled binding and folding. Post-translational phosphorylation of the CTD of H1 has effects on secondary structure and DNA condensation. Secondary structure of the entire H10 was analysed by infrared spectroscopy. H10, as the isolated CTD, also folded upon DNA interaction and the secondary structure was modulated by phosphorylation. The structural change following phosphorylation was characterized by an increase in the amount of β‐structure that was more significant when bound to DNA and was dependant on the protein/DNA ratio. The proportion of β‐structure reached 54 % suggesting that the CTD was in an all‐β conformation in the entire protein. Concomitant with the increase in β‐structure, there was a remarkable decrease of α‐helix that suggested the loss of some of the α‐helix in the globular domain; probably associated to the propagation of the β‐structure from the CTD towards the rest of the protein. In the presence of SDS, H10 folded with percentages of secondary structure motifs similar to those found when bound to DNA. At a molar ratio 14:1 (SDS/protein) the triphosphorylated protein had 55% of β‐structure indicating that the CTD within histone H10 was also in an all‐β conformation and formed amyloid fibres. Mature chicken erythrocyte nuclei contain highly condensed and inert chromatin, mainly consisting of DNA and histone proteins. Chicken erythrocyte chromatin was used to analyse linker histones post-translational modifications and the effect of phosphorylation by CDK2 on chromatin aggregation. The nuclei were digested with micrococcal nuclease and fractionated by centrifugation in low-salt buffer into soluble and insoluble fractions. Post-translational modifications (PTMs) of the purified linker histones of both fractions were analyzed by Tandem MS. All six histone H1 subtypes (H1.01, H1.02, H1.03, H1.10, H1.1L and H1.1R) and histone H5 were identified. In our study, we identified eight novel post-translational modifications: two were identified in histone H5 and six in histone H1 subtypes. Some of the identified modifications were specific of one chromatin fraction suggesting the differential distribution of some PTMs within chromatin. Comparison of the PTMs found with other previously reported for other species showed that most of them are conserved through evolution. Since histone H1 develops its function within chromatin; chicken erythrocyte chromatin was phosphorylated ex vivo with CDK2 in the S/T-P-X-Z motifs present in linker histones in order to study the effects of ex vivo phosphorylation of linker histones on chromatin aggregation. Proteomic analyses by HPCE and MALDITOF-MS showed that the the number of phosphate groups increased with the time of phosphorylation, reaching, in the case of H5, 54% of phosphorylated species (mono and diphosphorylated) after overnight phosphorylation. Tandem MS after proteolytic digestion revealed that in all linker histones the S/T-PX-Z motifs were unphosphorylated in native chromatin indicating that the phosphorylated peptides found at other times of reaction were modified ex vivo. In H5, only S148 was identified in all samples and was phosphorylated after 1 hour. In the Tandem MS analysis of histone H1 subtypes, all the CDK2 consensus sequences, except S171(H1.1R numbering) were identified for H1.03, H1.1L and H1.1R. H1.03T16 was found phosphorylated after 15 minutes; H1.1LS192 and H1.1RS186 after 1 hour; H1.03S155, H1.1LS155 and H1.1RS153 after3 hours. Once ex vivo phosphorylation of linker histones within chromatin was confirmed, the effect of linker histones ex vivo phosphorylation on chromatin aggregation induced by MgCl2 (1.6 mM) was analysed by Dynamic Light Scattering (DLS). The most remarkable result associated to ex vivo phosphorylation of linker histones within chromatin was a decrease in the hydrodynamic diameter of the aggregated molecules. The differences became greater with the increase of phosphorylation time and with the size of the chromatin fragments. These results indicated that linker histones phosphorylation impaired chromatin aggregation.

Este proyecto de tesis se ha focalizado en determinar con precisión, en células de Saccharomyces cerevisiae, la diferencia de enlace del ADN estabilizada por nucleosomas canónicos in vivo, así como la contribución topológica del centrómero y de diferentes promotores génicos sensibles a topoisomerasa II. Para ello, tanto la secuencia TRP1ARS1 como derivados de esta, se han introducido en diferentes cepas de S. cerevisiae: JCW25 (TOP1 TOP2 TOP3), JCW26 (TOP1 top2ts TOP3) y JCW27 (Δtop1 TOP2 TOP3), se han extraído en forma de cromatina y se han analizado mediante técnicas electroforéticas para determinar su topología in vivo. Gracias al pequeño tamaño de estos anillos de ADN (nunca superior a 2kb), las distribuciones de topoisomeros generadas han permitido identificar cualquier modificación en la estructura de la cromatina. Topología región TRP1ARS1: La secuencia de 1453 pb de la región TRP1ARS1 (TA1) se ha ciclado y usado para la transformación de las diferentes cepas de S. cerevisiae. Un análisis topológico de los nucleosomas ensamblados en esta región ha determinado una diferencia de enlace (ΔLk), respecto al anillo relajado, de -9.6 unidades. Este valor indica una estabilización de -1.37 unidades por nucleosoma, contrastando con el valor generalmente aceptado de -1 unidad por nucleosoma conocido como “linking number paradox”. Centrómero: El centrómero puntual de S. cerevisiae se caracteriza por: una secuencia de entre 111 y 120bp con tres elementos diferenciados (CDEI, CDEII y CDEIII) y por un hemisoma (H2A+H2B+cenH3+H4) con la histona H3 modificada (CenH3). Sobre las secuencias CDEI y CDEIII se unen dos complejos proteicos, Cbf1 y CBF3 respectivamente, capaces de doblar el ADN in vitro. Durante esta tesis se ha estudiado la topología del centrómero del cromosoma 4 de S. cerevisiae (CEN4), clonado en el anillo TA1, observando que produce una ganancia de +0.6 unidades de ΔLk. Este valor se ha establecido al comparar la topología del anillo TA1+CEN4 con la observada en anillos donde CEN4 ha sido mutado en CDEIII, impidiendo la unión de CBF3 y como consecuencia anulando su función, o sustituido por la secuencia High2 que estabiliza de forma muy eficiente un nucleosoma. El análisis topológico de anillos CEN4 de diferente tamaño y de anillos con la secuencia centromérica invertida, en cepas deficientes en topoisomerasa I y II, han ratificado que la estabilización de ΔLk =+0.6 es una propiedad robusta e intrínseca del complejo centromérico. Además, del estudio comparativo de los centrómeros CEN2, CEN4, CEN7 y CEN12 se ha descartado que la estabilización de +0.6 unidades dependa de la fase rotacional de CDEI y CDEIII y por tanto, se deba a una interacción entre ambos complejos proteicos. A partir de todos estos datos, se puede concluir que la estabilización de ΔLk = +0.6 estaría determinada por un enrollamiento dextrógiro del ADN en el hemisoma formado en CDEII o bien, por la combinación de distintos planos de curvatura del ADN en los segmentos CEI, CDEII y CDEIII. Promotores: Aprovechando la metodología usada para el análisis topológico del centrómero y del anillo TA1, se ha comenzado el estudio de la estructura de promotores de genes sensibles a topoisomerasa II. Se ha observado que la estructura de la cromatina de estos promotores no estabiliza el mismo número de enlace que segmentos de cromatina del mismo tamaño formados por nucleosomas típicos (cromatina control). Además,.la ianctivación de la topoisoemrasa II produce en estos promotores cambios topológicos distintos a los de la croamtina control lo que sugiere la posible presencia de mecanismos de regulación de la transcripción mediados por la topoisomerasa. / This thesis has focused on the accurate measure, in Saccharomyces cerevisiae cells, of the DNA linking number stabilized by canonical nucleosomes in vivo, as well as the centromere and several promoter regions topological contributions. To that end, TRP1ARS1 sequences, as well as its derivatives, were introduced in different S. cerevisiae strains: JCW25 (TOP1 TOP2 TOP3), JCW26 (TOP1 top2ts TOP3) y JCW27 (Δtop1 TOP2 TOP3), extracted as chromatin and analyzed by electrophoretic techniques in order to determine its in vivo topology. Thanks to the little size of these DNA ring (never bigger than 2kb), the distributions of the topoisomers have allowed to identified any modification of the chromatin structure Topology of TRP1ARS1: The TRP1ARS1 (TA1)1453 bp sequence has been cycled and used to electroporate different S. cerevisiae strains. The topological analysis of the nucleosomes located in this region has resulted in a Linking number difference (ΔLk) of -9.6 units. This value points to the stabilization of -1.37 per nucleosome, contrasting with the assumed value of -1 unit per nucleosome, known as the “linking number paradox” Centromere: S. cerevisiae centromere is characterized by 11-120 bp sequence, with three differentiated elements (CDEI, CDEII y CDEIII), as well as a hemisome (H2A+H2B+cenH3+H4) harboring the variant H3 histone CenH3. Over CDEI and CDEII sequences two protein complexes are bound, Cbf1 and CBF3 respectively, which are able to bend the DNA in vitro. Along this thesis, the topology of centromere of chromosome IV (CEN4) of S. cerevisiae, cloned in TA1 ring, has been studied resulting in a gain of +0.6 units of ΔLk. This value has been established when comparing the topology of TA1+CEN4 with the observed in DNA rings where CDEIII of CEN4 has been mutated, preventing CBF3 bound and as a consequence, abolishing centromere function, or where CEN4 has been substituted by High2 sequence which establishes a well-positioned nucleosome. The topological analysis of CEN4 rings of different size, in different strains of S. cerevisiae with altered topoisomerase activity, have confirmed that the stabilization of ΔLk =+0.6 is a strong and intrinsic characteristic of the centromeric complex. Besides this, the comparative study of CEN2, CEN4, CEN7 and CEN12 centromeres has discarded the stabilization of +0.6 units depending on the rotational phase of CDEI and CDEIII so, it is not due to an interaction between both protein complexes. From these data, it can be concluded that the stabilization of ΔLk = +0.6 would be determined by a right-handed loop around the hemisome formed over CDEII or, by the mixed of different DNA curvature planes in the regions of CDEI, CDEII y CDEIII. Promoters: Taking the advantage of the methodology used in the topological analysisi of the centromere, a study of promoters structure which are located in genes affected by topoisomerase II activity has just been started. It has been observed a difference between the linking number established by these promoters and a non-promoter fragment of chromatin used as a control. Furthermore, the inactivation of Topo II causes in these promoters topological changes that differ from the chromatin used as a control which suggests a trasncription regulation mechanism by Topo II.

A la present tesi es proporciona una descripció del mecanisme i la cinètica d'algunes reaccions d'interès troposfèric. En aquests temps on les emissions antropogèniques a l'atmosfera estan creixent a un ritme imparable, es fa necessària una revisió de l'impacte que les activitats humanes tenen sobre el nostre medi. Per a entendre i prevenir els fenòmens atmosfèrics, es creen models on s'inclouen el màxim de variables. Els estudis teòrics com els que es presenten a aquesta tesi, proporcionen informació sobre els mecanismes de reacció, i sobre dades cinètiques, com per exemple les constants de velocitat, que posteriorment poden ajudar al plantejament dels models predictius.Un aspecte comú a totes les reaccions estudiades és el fet de que corresponen a processos d'oxidació de compostos orgànics volàtils (VOCs) pel radical OH. En concret, s'ha treballat amb alquens (etè, propè, isobutè i cloretè) i compostos parcialment oxigenats (glicolaldehid, metil vinil cetona i metacroleïna). Els principals objectius perseguits al treball de tesi són els següents:1. Explicar, mitjançant la teoria de l'estat de transició convencional, l'aparició d'energies d'activació negatives en el cas de les reaccions entre diversos alquens i el radical OH, així com determinar la regioselectivitat per als alquens substituïts.2. Proporcionar, en el cas del sistema glicolaldehid + OH, la constant de velocitat a diferents temperatures per a una reacció multiwell i multichannel mitjançant la teoria de l'estat de transició canònica variacional, amb túnel multidimensional quan ha estat necessari.3. Facilitar una descripció teòrica del comportament amb la pressió i la temperatura de les constants de velocitat dels sistemes metil vinil cetona + OH i metacroleïna + OH, mitjançant la teoria de l'estat de transició microcanònica convencional i la resolució de l'equació master.4. Obtenir les entalpies de formació teòriques i les energies de dissociació d'enllaç per a la metil vinil cetona i la metacroleïna, així com per als seus productes d'oxidació, per tal de proporcionar informació sobre la força dels diferents enllaços que es formen o es trenquen en l'oxidació pel radical OH. / In the current thesis it is provided a description of the mechanism and the kinetics of some reactions of tropospheric interest. In these times where the anthropogenic emissions to the atmosphere are growing to an unstoppable pace, makes necessary a review of the impact that the human activities have on our environment. To deal and to anticipate the atmospheric phenomena, models are created where the maximum of variables is included. The theoretical studies like that appearing in this thesis, provide information about the mechanisms of reaction, and about kinetics information, as for example the rate constants, which later can help to the description of the predictive models.A common aspect to all the studied reactions is the fact that they correspond to processes of oxidation of volatile organic compounds (VOCs) by the OH radical. Specifically, it has been worked with alkenes (ethene, propene, isobutene and chloroethene) and partially oxygenated compounds (glycolaldehyde, methyl vinyl ketone and methacrolein). The principal aims chased in this work of thesis are the following ones:1. To explain, by using the conventional transition state theory, the appearance of negative energies of activation in the case of the reactions between diverse alkenes and the radical OH, as well as to determine the regioselectivity for the replaced alkenes.2. To provide, in the case of the system glycolaldehyde + OH, the rate constant at different temperatures for a multiwell and multichannel reaction by means of the canonical variacional transition state theory, with multidimensional tunneling when it has been necessary.3. To offer a theoretical description of the behavior with the pressure and the temperature of the rate constants of the systems methyl vinyl ketone + OH and metacrolein + OH, by using the microcanonical conventional transition state theory and the resolution of the master equation.4. To obtain the theoretical enthalpies of formation and the bond dissociation energies for the methyl vinyl ketone and the metacrolein, as well as for their products of oxidation, in order to provide information about the force of the different bonds that are formed or broken in the oxidation by the OH radical.

Los peces planos comprenden un grupo de especies de gran interés biológico y comercial. En respuesta al descenso de la pesca y al ritmo de capturas, en los últimos años han surgido diversas iniciativas dirigidas a la acuicultura de estas especies. Este proyecto de tesis doctoral se ha centrado en el lenguado del Senegal (S. senegalensis), una especie de alto valor añadido y un candidato con mucho potencial para la acuicultura. Quedan aún muchas incógnitas acerca de su reproducción, que deberán ser respondidas para optimizar su cultivoUno de los problemas detectados en el cultivo de S. senegalensis es la poca efectividad para inducir la reproducción de los machos, y en especial para conseguir un esperma de buena calidadEste proyecto de tesis se propone investigar los mecanismos fisiológicos implicados en la espermatogénesis y la producción de esperma de S. senegalensis mediante el análisis del proteoma del testículo de individuos salvajes y en cultivo bajo diferentes condiciones y la caracterización de proteínas potenciales implicadas en este proceso.Inicialmente se han estudiado el proteoma de S. senegalensis mediante secuenciación peptídico por espectrometría de masas. Posteriormente se ha analizado el proteoma de testículos de individuos salvajes en diferentes estadios de espermatogénesis mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas. Resuelto este apartado, se abordaron los estudios comparativos del proteoma de individuos criados en cautividad con y sin tratamientos hormonales. Los estudios proteómicos se complementaron con análisis de nivel de expresión mRNA con microarrays. Finalmente, la información obtenida a durante el proyecto referente a la expresión de proteínas, la expresión de mRNA y la histología se ha integrado en una plataforma informática visual diseñada especialmente para S. senegalensis. / The flatfishes represent a group of species with a high biological and economical interest. Due to the decrease in fish hatchings, in the last years different several projects related to the aquaculture of these species were proposed. The project of this doctoral thesis has focused on the Senegal sole (Solea senegalensis), a flatfish specie with a great commercial interest and a candidate with high potential for aquaculture. However, lots of questions about its reproduction haven't been so far properly addressed, and they should be approached in order to optimize the culture of the Senegal sole. The main problems detected for this specie in captivity are the low spermiation volume and the impaired quality of spermatozoa motility males.This thesis aims to investigate the molecular mechanisms involved in the spermatogenesis and sperm production of S. senegalensis through the analysis of the testis proteome of wild and cultured animals under several conditions, in order to unveil the candidate proteins related to these processes.Initially, the proteome of S. senegalensis has been approached by de novo peptide sequencing based on mass spectrometry. Afterwards, the testis proteome from wild and cultured individuals in several spermatogenic stages was compared using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Once this point was performed, a comparative study of testis proteome from individuals cultured with and without hormonal treatment was approached. Both proteomic studies were complemented with mRNA expression analysis using microarrays.Finally, the information related to protein expression obtained during the different parts of the project, the mRNA expression and the histological analysis were integrated in a bioinformatic visual atlas specifically designed for S. senegalensis.

La conjugación bacteriana es uno de los mecanismos de transferencia horizontal genética más importante y la causa principal de la rápida adquisición de resistencia a los antibióticos en las bacterias. La capacidad de las bacterias para conjugarse fue descubierta en 1946 en cultivos de E. coli y, años más tarde, en bacterias Gram-positivas. El proceso de conjugación comienza con el corte de un enlace fosfo-diester específico por medio de una relaxasa que juega un papel clave en la iniciación de dicha transferencia.En el plásmido R388 de E. coli, TrwC es la transferasa que cataliza la etapa inicial y final de la transferencia conjugativa del ADN. La estructura cristalina del dominio N-terminal de la relaxasa TrwC en complejo con un oligonucleótico de 27 bases que contiene la horquilla de reconocimiento y el enlace fosfo-diester a cortar ha sido determinada por difracción de rayos X. Asimismo, se han resuelto las estructuras de una serie de complejos ternarios proteína-ADN-metal con diferentes cationes divalentes ocupando el sitio activo. Un análisis sistemático, mediante difracción anómala, permitió determinar sin ambigüedad la naturaleza del metal localizado en el sitio activo, encontrándose que Zn2+, Ni2+ y Cu2+ se unían a la tríada de histidinas. La comparación de las estructuras de los diferentes complejos sugiere la existencia de dos caminos que permiten la salida de la cadena de ADN del centro activo y que probablemente son utilizados en diferentes etapas de la reacción de proceso de conjugación. La información estructural permitió proponer (i) un mecanismo enzimático en el que el ión metálico polariza el enlace fosfo-diester a cortar facilitando el ataque por parte de la tirosina catalítica, y (ii) la serie de eventos que ocurren durante el procesamiento del ADN a transferir y que explican la función biológica de la relaxasa.Asimismo se ha estudiado y caracterizado por difracción de rayos X el dominio N-terminal de la relaxasa MobM del plásmido pMV158 de Streptococcus agalactiae en complejo con un oligonucleótido de 26 bases que mimetiza la secuencia del oriT justo hasta el sitio de corte (nic). El plegamiento global de la proteína muestra un núcleo central formado por cinco hebras betas anti-paralelas flanqueadas por dos pares de hélices alfa. Este plegamiento es estructuralmente homólogo al observado en la relaxasas de bacterias Gram-negativas, pese a la baja homología de secuencia existente entre dichas proteínas. La cadena de ADN se une a MobM mediante numerosas interacciones electrostáticas alojándose a lo largo de la amplia cavidad que la superficie de la proteína presenta. Los contactos intermoleculares se agrupan en cuatro regiones; los dos más importantes involucran dos giros betas consecutivos de la cadena proteica que penetra en el surco menor del ADN y un largo lazo flexible que rodea el extremo de simple cadena del ADN. / Bacterial conjugation is one of the most important horizontal gene transfer mechanisms and the main cause of the rapidly spread of the antibiotic resistance in bacteria. The ability of bacteria to conjugate was discovered in 1946 in E. coli cultures and years later in Gram-positive bacteria. The conjugative process begins with the cleavage of a specific phosphodiester bond through a relaxase protein, playing a key role in the initiation of the transfer.TrwC is the DNA strand transferase that catalyzes the initial and final stages of conjugative DNA transfer in the plasmid R388 from E. coli. We have solved the crystal structure of the N-terminal relaxase domain of TrwC in complex with a 27 base-long DNA oligonucleotide that contains both the recognition hairpin and the scissile phosphate. In addition, a series of ternary structures of protein-DNA complexes with different divalent cations at the active site have been solved. Systematic anomalous difference analysis allowed us to determine unambiguously the nature of the metal bound. Zn2+, Ni2+ and Cu2+ were found to bind the histidine-triad metal binding site. Comparison of the structures of the different complexes suggests two pathways for the DNA to exit the active pocket. They are probably used at different steps of the conjugative DNA-processing reaction. The structural information allows us to propose (i) an enzyme mechanism where the scissile phosphate is polarized by the metal ion facilitating the nucleophilic attack of the catalytic tyrosine, and (ii) a probable sequence of events during conjugative DNA processing that explains the biological function of the relaxase.We also investigated the N-terminal relaxase domain of the protein MobM from plasmid pMV158 from Streptococcus agalactiae, and herein we report the X-ray crystal structure of the complex between this domain and a 26-mer oligonucleotide that mimics the oriT sequence just upstream the nic site. The overall fold of the protein shows a core domain comprising five anti-parallel beta-strands flanked by pairs of alfa-helices. This fold resembles that of Gram-negative relaxases in spite of the very low sequence homology. The DNA molecule binds to MobM through a number of electrostatic interactions following a large crevice over the surface of the protein. Intermolecular contacts are clustered in four main regions; the two most important ones involve a bulge formed by two consecutive beta-turns, and a long unstructured loop that wraps around the single stranded DNA part.

Carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT1) enzymes catalyze the conversion of long-chain acyl-CoA to acyl-carnitines, thus facilitating the entry of long-chain fatty acids to the mitochondria, where they undergo β-oxidation. There are three isoforms: the liver isoform CPT1A (Esser, V. 1993), the muscle isoform CPT1B (Yamazaki, N. 1995) and the brain-specific isoform CPT1C (Price, N. 2002). CPT1A and CPT1B are localized in the outer mitochondrial membrane and are rate-limiting enzymes in fatty-acid β-oxidation. The CPT1C isoform, was first described in 2002, is expressed exclusively in the central nervous system, with a homogeneous distribution in all areas such as hippocampus, cortex, hypothalamus, cerebellum and others. CPT1C enzyme highly differs from the two other isozymes. Its C-terminal region is longer than that of the other CPTs (Price, N. 2002). It is located in the endoplasmic reticulum (ER) of cells, rather than in mitochondria, and so it does not facilitate fatty acid oxidation (Sierra, A.Y. 2008). Analysis of amino sequence of CPT1C reveals that all important residues for CPT1 activity are conserved in CPT1C enzyme, despite this, no catalytic activity was found (Price, N. 2002; Wolfgang, M.J. 2006), but it binds the CPT1 physiological inhibitor malonyl-CoA with the same affinity as CPT1A (Wolfgang, M.J. 2006). Finally, CPT1C is only present in mammals and appears to stem from a relatively recent CPT1A gene duplication (Price, N. 2002). The other isozymes are expressed in such organisms as fish, reptiles, amphibians or insects. This suggests a specific role for CPT1C in more evolved brains. At the physiological level, CPT1C contributes to the control of food intake and energy homeostasis (Wolfgang, M.J. 2006; Gao, X.F. 2009). Two independent groups developed a CPT1C-KO mouse, and both lines showed decreased food intake respect to wild-type animals (WT). However, when fed a high-fat diet, they were more susceptible to obesity and diabetes, presenting lower rates of peripheral fatty acid oxidation. All these effects were attributed to the hypothalamic function of CPT1C, since ectopic over-expression of CPT1C in hypothalamus protected mice from adverse weight gain caused by high-fat diet (Dai, Y. 2007). Moreover, the involvement of CPT1C in energy homeostasis has also been confirmed in transgenic animals over-expressing CPT1C specifically in brain (Reamy, A.A. 2011). At the molecular level, in collaboration with the group of Dr. Gary Lopaschuk, we showed that CPT1C is involved in the anorectic action of leptin, by modulating ceramide synthesis in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus (Gao, S. 2011). Interestingly, recent findings in tumor cells showed a new, unexpected role of CPT1C in the metabolic transformations reported in tumor cell growth (Zaugg, K. 2011). The authors demonstrated that CPT1C is frequently expressed in human lung tumors and protects cancerous cells from death induced by glucose deprivation or hypoxia. The results suggest that CPT1C might provide unidentified fatty-acid derived products that would be beneficial for cell survival under metabolic stress. However, despite these recent findings about CPT1C, little is known about its catalytic activity or its physiological function in other brain areas. We demonstrate that CPT1C has low CPT1 activity although it has similar affinity for its substrates: carnitine and palmitoyl-CoA than CPT1A isoform. The present study also shows that CPT1-KO mice have reduced long-chain acyl-carnitine levels in the hippocampus, hypothalamus or cerebellum. We examined whether CPT1C is expressed in the peripheral nervous system: in the ventral horn of the spinal cord (motor neurons) and in the sensitive ganglions, in addition to the brain. We found that CPT1C is expressed in both regions, albeit at lower levels than in the brain. We also examined CPT1C expression along mouse development, and we found that CPT1C protein expression is present in early stage of embryos at day 15, is increased postnatally and reaches its expression peak in adulthood. Moreover, CPT1C is expressed in pyramidal neurons of hippocampus and is located in ER throughout the neuron, even inside dendritic spines. We used molecular, cellular and behavioral approaches to determine CPT1C function. First, we analyzed the implication of CPT1C in ceramide metabolism. CPT1C over-expression in primary hippocampal cultured neurons increased ceramide levels, an effect that was blocked by treatment with myriocin, an inhibitor of the de novo synthesis of ceramide. Correspondingly, CPT1C knock-out (KO) mice showed reduced ceramide levels in hippocampus, cerebellum, striatum and motor cortex, mainly during fasting. At the cellular level, CPT1C deficiency altered dendritic spine morphology by increasing immature filopodia and reducing mature mushroom and stubby spines. Total protrusion density and spine head area in mature spines were unaffected. Treatment of cultured neurons with exogenous ceramide reverted the KO phenotype, as did ectopic over-expression of CPT1C, indicating that CPT1C regulation of spine maturation is mediated by ceramide. To study the repercussions of the KO phenotype on cognition and motor function, we performed the hippocampus-dependent Morris Water Maze (MWM) test and some motor tests on mice. Results show that CPT1C-KO mice are hypoactive and exhibit clear deficits in motor function, especially in coordination skills and strength. Moreover, CPT1C deficiency strongly impairs spatial learning without affecting memory or cognitive flexibility. So, all these results demonstrate that CPT1C regulates the de novo synthesis of ceramide in ER of hippocampal neurons and this is a relevant mechanism for the correct maturation of dendritic spines and for proper spatial learning. / ESTUDIO DE LA FUNCIÓN FISIOLÓGICA DE LA ENZIMA CPT1C La isoforma carnitina palmitoil transferasa 1C (CPT1C) se expresa únicamente en cerebro y ha sido implicada en la regulación hipotalámica de la ingesta de alimentos y la homeostasis energética. No obstante, su función molecular y su papel en otras áreas del cerebro son desconocidas. Hemos demostrado que CPT1C se expresa en las neuronas piramidales del hipocampo y se localiza en el retículo endoplásmico a lo largo de la neurona, incluso dentro de las espinas dendríticas. Hemos utilizado métodos moleculares, celulares y conductuales para determinar la función de CPT1C. En primer lugar, analizamos la implicación de CPT1C en el metabolismo de la ceramida. La sobre-expresión de CPT1C en neuronas de hipocampo aumentó los niveles de ceramidas, un efecto que fue bloqueado por el tratamiento con miriocina, un inhibidor de la síntesis de novo de la ceramida. En consecuencia, los ratones CPT1C knock-out (CPT1C-KO) demostraron una reducción de los niveles de ceramidas en el hipocampo, cerebelo, estriado y corteza motora principalmente durante el ayuno. A nivel celular, la deficiencia en CPT1C afecta a la morfología de las espinas dendríticas mediante el aumento de filopodios inmaduros y reduciendo el número de espinas maduras. La densidad de protrusiones totales o el área de la cabeza de la espinas dendrítica no se vieron afectadas. El tratamiento de las neuronas en cultivo con ceramida exógena, como la sobre-expresión ectópica de CPT1C, revirtieron el fenotipo de las espinas CPT1C-KO, lo que indica que CPT1C regula la maduración de las espinas dendríticas a través de las ceramidas. Para estudiar las repercusiones del fenotipo CPT1C-KO en la cognición y en la habilidad motora se realizaron diferentes test conductuales. Los resultados del test cognitivo demostraron que la deficiencia de CPT1C perjudica al aprendizaje espacial. Por otra parte, la realización de test motores demostraron que los ratones CPT1C son hipoactivos y tienen disminuida tanto la coordinación motora como la fuerza muscular. Todos estos resultados demuestran que CPT1C regula la síntesis de novo de ceramidas en el retículo endoplásmico de las neuronas y éste es un mecanismo necesario para la correcta maduración de las espinas dendríticas y para el adecuado procedimiento del aprendizaje espacial y la función motora.

Carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) catalyzes the conversion of long chain fatty acyl-CoAs into acylcarnitines, the first step in the transport of long chain fatty acids from the cytoplasm to the mitochondrial matrix, where they undergo β-oxidation. This reaction is not only central to the control of fatty acid oxidation, but it also determines the availability of long chain acyl-CoA for other processes. There are three different CPT1 isozymes: CPT1A (expressed in liver, pancreas, kidney, brain, blood, and embryonic tissues), CPT1B (expressed only in brown adipose tissue, muscle, and heart) and the recently described CPT1C. CPT1C protein sequence is highly similar to that of the other two isozymes. Expression studies indicate that CPT1C is localized exclusively in the central nervous system, with homogeneous distribution in all areas (hippocampus, cortex, hypothalamus, and others). It has also been reported that CPT1c is localized in neurons but not in astrocytes of adult brain.1. CPT1C strucutral modelA 3-D structural model of the isozyme has been constructed by homology modeling. Residues contacting both substrates have been determined and compared to the same amino acid positions in CPT1A. The results obtained from the analysis show that the residues involved in the catalysis of the reaction in CPT1A and residues contacting both substrates are conserved mainly conserved in CPT1C or show semi-conservative substitutions. 2. CPT1 enzymatic activityExpression of rat CPT1C in Saccharomyces cerevisiae yields no catalytic activity when testing different conditions (longer periods of time, increased temperature, increased substrate concentration, testing of microsomal fraction or chimeric protein CPT1·ACA). Thus, the yeast expression system is not suitable for studying CPT1C enzymatic activity.3. Subcellular localizationEndogenous and overexpressed CPT1C is basically localized in the endoplasmic reticulum of mammalian cells (HEK293T, PC12, SH-SY5Y, primary cultures of fibroblasts and neurons). Some evidences indicated that CPT1C could also be found, in lower amounts, in mitochondrial associated membranes (MAMs).The specific sequence of CPT1C N-terminal domain (first 150 amino acids) drives the protein to the endoplasmic reticulum.4. CPT1C N-terminus processingThe N-terminal end of endogenous CPT1C in wild type mouse brain is processed (at least until Val27) and is not detected in mouse brain cortex lysates.5. CPT1C membrane topologyThe N- and C-terminal domains of CPT1C are facing the cytosolic side of the endoplasmic reticulum membrane, whereas the loop domain is facing the endoplasmic reticulum lumen.6. CPT1C interacting partnersThe data provided by the yeast two-hybrid assay do not indicate a unique binding partner of CPT1C. Instead the assay retrieved proteins involved in different functions: protein degradation, membrane trafficking, cell structure, signal transduction and metabolism.KEYWORDS: Carnitine palmitoyltransferase, Endoplasmatic reticulum, Subcelular localization, CPT1 activity, Structural model, Membrane topology / La carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1) es una enzima que cataliza la conversión de aciles-CoA de cadena larga en acil-carnitinas, reacción crucial para el control de la oxidación de ácidos grasos. Existen tres isoformas diferentes de CPT1: CPT1A (isoforma más ubicua), CPT1B (expresada en tejido adiposo, músculo y corazón) y CPT1C que es la isoforma más recientemente descrita.La secuencia de la proteína CPT1C es muy parecida a la de las otras dos isoformas. Estudios de expresión indican que CPT1C se localiza exclusivamente en el sistema nervioso central. También se ha descrito que CPT1C se localiza en neuronas de cerebro adulto pero no en astrocitos.Las conclusiones obtenidas de los resultados presentados en esta tesis son (por apartados):1. Modelo structuralA través de técnicas de modelaje por homología se ha construido un modelo tridimensional teórico de la proteína. De su estudio se concluye que los residuos implicados en la catálisis de la reacción y los residuos en contacto con los sustratos están bien conservados en la secuencia de CPT1C.2. Actividad enzimáticaLa expresión de CPT1C en la levadura Saccharomyces cerevisiae no muestra actividad CPT1 aunque se testen diferentes condiciones (tiempos de reacción más largos, incrementos en la concentración de sustratos, pruebas en fracciones microsomales o pruebas con proteínas quiméricas como la CPT1·ACA)3. Localización subcelularLa proteína CPT1C se localiza básicamente en el retículo endoplasmático de células de mamífero (HEK293T, PC12, SH-SY5Y y en cultivos primarios de fibroblastos y de neuronas). La secuencia concreta de los 150 primeros aminoácidos dirige la porteína al retículo endoplasmático.4. Procesamiento del extremo N-terminal de CPT1CEl extremo N-terminal de la proteína CPT1C endógena sufre un procesamiento.5. Topología en la membrana de CPT1CLos dominios N- y C-terminal (centro catalítico) están orientados hacia la cara citosólica de la membrana del retículo endoplasmático.6. Proteínas de unión Los resultados obtenidos del ensayo de dobles híbridos no indican que CPT1C interaccione con una sola proteína de unión. Del ensayo se obtuvieron proteínas implicadas en diferentes funciones: degradación de proteínas, tráfico de membranas, estructura celular, vías de transducción de la señal y metabolismo.

Una de les accepcions de la farmacogenòmica es l'estudi dels efectes d'un tractament farmacològic sobre els nivells d'expressió gènica. Aquesta estratègia inclou la identificació de les variacions de gens individuals, l'avaluació de les interaccions entre els seus productes i la caracterització dels fenotips derivats de la resposta al fàrmac El metotrexat (MTX) és un fàrmac inhibidor de l'enzim dihidrofolat reductasa (DHFR) utilitzat en el tractament del càncer. El treball presentat en aquesta memòria es troba emmarcat dins de l'estudi de l'expressió gènica diferencial derivada de la resistència al MTX i pretén identificar aquells canvis adaptatius que tenen lloc en les cèl•lules sota tractaments perllongats amb el MTX. Alguns d’aquests gens diferencialment expressats poden contribuir a la resistència al fàrmac. Així doncs, s'identifica el gen S100A4 com a diana diferencialment expressada en 5 de les 7 línies cel•lulars resistents a MTX estudiades, i en cèl•lules de càncer de còlon HT-29, la via de Wnt sembla ser la responsable d’aquesta sobrexpressió. També en cèl•lules HT-29, la disminució dels nivells de proteïna S100A4 contribueix a augmentar la sensibilitat cap al MTX, fet que evidencia el paper important de la sobrexpressió de S100A4 en la resistència al MTX. En els últims anys s'ha descobert que les seqüències codificants representen només el 2% de tot el genoma i que la major part és transcrita com a molècules de RNA que no codifiquen per cap proteïna. Això implica que el que abans es considerava com a "junk DNA", en realitat és transcrit donant molècules de RNA reguladores de múltiples processos cel•lulars. Un dels tipus de RNAs no codificants més estudiats són els microRNAs (miRNAs). Actualment hi ha una extensa quantitat d'informació que descriu un clar paper dels miRNAs en tots els passos del desenvolupament del càncer, així com altres malalties. També s'estudia el paper dels microRNAs (miRNAs) en la resistència al MTX en cèl•lules de càncer de còlon. Els resultats presentats identifiquen el miR-224 i els seus gens diana, SLC4A4, CDS2 i HSPC159 com a dianes importants en la resistència al MTX en càncer de còlon. La reducció dels nivells del miR-224, acompanyada de l’augment dels seus gens diana CDS2, HSPC159 i SLC4A4, comporta una insensibilització cap al MTX, de manera que s’afavoreix la resistència al fàrmac. A més, es presenten altres miRNAs identificats com a sobrexpressats en la mateixa línia cel•lular de càncer de còlon (miR-149, miR-193b, miR-210, miR-27b, miR-320, miR-361-5p, miR-365, miR-455-3p i miR-615-3p) i s'identifiquen els gens diana putatius per a cadascun d'aquests miRNAs. La identificació dels gens diana per un determinat miRNA es realitza mitjançant algoritmes bioinformàtics que requereixen validació experimental. La interacció d’un miRNA amb el seu gen diana s’acostuma a estudiar mitjançant la co-transfecció del miRNA amb un vector reporter que contingui la regió 3’-UTR del gen. Tot i que aquest mètode suggereix una interacció física i funcional, no prova la interacció del miRNA amb el seu gen diana de forma directa. Finalment, es presenten resultats que demostren que els assajos de canvi de la mobilitat electroforètica (EMSA) constitueixen un mètode alternatiu per confirmar de manera directa i específica si un miRNA s’uneix o no al seu mRNA diana. / Pharmacogenomics study the effects of a drug on the expression levels of the genes. This strategy includes the identification of changes in individual genes, evaluating the interactions between their products and the characterization of phenotypes resulting from the response to the drug Methotrexate (MTX) is an inhibitor of the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) used in the treatment of cancer. The work presented in this report studies gene expression patterns derived from MTX resistance and seeks to identify the adaptive changes that occur in cells under prolonged treatment with MTX. Some of these differentially expressed genes may contribute to drug resistance. S100A4 was identified as a target gene overexpressed in 5 out of the 7 studied cell lines resistant to MTX. In HT-29 colon cancer cells, the Wnt signaling pathway appears to be responsible this overexpression. Also in HT-29 cells, S100A4 reduced protein levels contribute to increased sensitivity to MTX, which shows the important role of S100A4 overexpression on MTX resistance. MiRNAs are small non-coding RNAs that negatively regulate gene expression. There is an extensive amount of information that clearly describes the role of miRNAs in all stages of development of cancer as well as other diseases. It is also studied the role of microRNAs (miRNAs) in MTX resistance in colon cancer cells. The results presented identify the under expression of miR-224 and, therefore, the overexpression of its target genes, SLC4A4, and HSPC159 CDS2 as important targets for MTX resistance in colon cancer cells. The reduced levels of miR-224, accompanied by the increase of its target genes CDS2, HSPC159 and SLC4A4 lead to a desensitization toward MTX, which favors the drug resistance. Furthermore, the results identify a group of overexpressed miRNAs in the same colon cancer cell line (miR-149, miR-193b, miR-210, miR-27b, miR-320, miR-361-5p, miR -365, miR-455-3p and miR-615-3p) and the putative target genes for each of these miRNAs are predicted. Finally, we present results of tests showing that electrophoretic mobility shift (EMSA) are an alternative method to confirm directly and specifically whether or not miRNA binds to its mRNA target.

Plasmonics nanostructures are becoming remarkably important as tools towards manipulating photons at the nanoscale. They are poised to revolutionize a wide range of applications ranging from integrated optical circuits, photovoltaics, and biosensing. They enable miniaturization of optical components beyond the "diffraction limit'' as they convert optical radiation into highly confined electromagnetic near-fields in the vicinity of subwavelength metallic structures due to excitation of surface plasmons (SPs). These strong electromagnetic fields generated at the plasmonic "hot spots'' raise exciting prospects in terms of driving nonlinear effects in active media. The area of active plasmonics aims at the modulation of SPs supported at the interface of a metal and a nonlinear material by an external control signal. The nonlinear material changes its refractive index under an applied control signal, thereby resulting in an overall altered plasmonic response. Such hybrid nanostructures also allow for the creation of new kinds of hybrid states. This not only provides tools for designing active plasmonic devices, but is also a means of re-examining existing conventional rules of light-matter interactions. Therefore, the need for studying such hybrid plasmonic nanostructures both theoretically and experimentally cannot be understated. The present work seeks to advance and study the control of SPs excited in hybrid systems combining active materials and nanometallics, by an external optical signal or an applied voltage. Different types of plasmonic geometries have been explored via modeling tools such as frequency domain methods, and further investigated experimentally using both near-field and far field techniques such as scanning near field optical microscopy and leakage radiation microscopy respectively. First, passive SP elements were studied, such as the dielectric plasmonic mirrors that demonstrate the ability of gratings made of dielectric ridges placed on top of flat metal layers to open gaps in the dispersion relation of surface plasmon polaritons (SPPs). The results show very good reflecting properties of these mirrors for a propagating SPP whose wavelength is inside the gap. Another passive configuration employed was a plasmonic resonator consisting of dielectric-loaded surface plasmon polariton waveguide ring resonator (WRR). Also, a more robust variant has been proposed by replacing the ring in the WRR with a disk (WDR). The performance in terms of wavelength selectivity and efficiency of the WDRs was evaluated and was shown to be in good agreement with numerical results. Control of SPP signal was demonstrated in the WRR configuration both electro-optically and all-optically. In the case of electro-optical control, the dielectric host matrix was doped with an electro-optical material and combined with an appropriate set of planar electrodes. A 16% relative change of transmission upon application of a controlled electric field was measured. For all-optical control, nonlinearity based on trans-cis isomerization in a polymer material is utilized. More than a 3-fold change between high and low transmission states of the device at milliwatt control powers ( ~100 W/cm^2 intensity) was observed. Beyond the active control of propagating surface plasmons, further advancement can be achieved by means of nanoscale plasmonic structures supporting localized surface plasmons (LSP). Interactions of molecular excitations in a pi-conjugated polymer with plasmonic polarizations are investigated in hybrid plasmonic cavities. Insights into the fundamentals of enhanced light-matter interactions in hybrid subwavelength structures with extreme light concentration are drawn, using ultrafast pump-probe spectroscopy. This thesis also gives an overview of the challenges and opportunities that hybrid plasmonic functionalities provide in the field of plasmon nano optics. / Las nanoestructuras plasmónicas han adquirido una importante relevancia como herramientas capaces de manipular los fotones en la nanoescala, y pueden llegar a revolucionar un amplio abanico de aplicaciones tales como los circuitos ópticos integrados, la fotovoltaica o los dispositivos biosensores. Dichas estructuras hacen posible la miniaturización de los componentes ópticos más allá del “límite de difracción” de la luz, ya que convierten la radiación óptica en campos electromagnéticos fuertemente confinados en la proximidad de estructuras metálicas de tamaño inferior a la longitud de onda mediante la excitación de plasmones de superficie (SPs). Estos campos electromagnéticos tan intensos generados en los llamados “puntos calientes” plasmónicos brindan perspectivas muy interesantes para la generación de efectos no lineales en medios activos. El área de investigación denominado plasmónica activa busca la modulación de los SPs sostenidos por la intercara entre un metal y un material no lineal mediante una señal de control externa. El índice de refracción del material no lineal cambia bajo la aplicación de la señal de control, lo cual da lugar a la modificación de la respuesta plasmónica. Estas nanoestructuras híbridas también hacen posible la aparición de nuevos tipos de estados híbridos, lo cual proporciona tanto herramientas para diseñar dispositivos plasmónicos activos como mecanismos que permiten re-examinar las reglas convencionales de la interacción luz materia. Por lo tanto, es necesario el estudio de dichas nanoestructuras plasmónicas híbridas de manera teórica y experimental. En este trabajo de tesis se analiza el control de los SPs excitados en sistemas híbridos que combinan materiales activos y nanoestructuras metálicas mediante una señal óptica externa o un voltaje aplicado. Se han investigado distintos tipos de geometrías plasmónicas utilizando herramientas de simulación basadas en métodos en el dominio de la frecuencia, y posteriormente se han caracterizado experimentalmente dichas geometrías mediante técnicas de campo cercano y de campo lejano tales como la microscopía óptica de campo cercano y la microscopía basada en pérdidas radiativas, respectivamente. En primer lugar se estudiaron elementos plasmónicos pasivos, en particular espejos plasmónicos dieléctricos que demuestran la capacidad que tienen las redes periódicas de caballones de material dieléctrico colocados sobre una superficie metálica plana para abrir intervalos prohibidos en la relación de dispersión de los plasmones de superficie propagantes o plasmones-polaritones de superficie (SPPs). Los resultados muestran que dichos espejos poseen muy buenas propiedades reflectantes para SPPs cuya energía está en el intervalo prohibido. Otra configuración pasiva analizada fueron los resonadores plasmónicos basados en anillos de guía de onda plasmónica fabricada a partir de estructuras dieléctricas sobre metal (WRR, del inglés waveguide ring resonator ). Asimismo, se propone una versión más robusta de resonador plasmónico, basada en la sustitución del anillo del WRR por un disco (WDR, del inglés waveguide disk resonator). Se ha evaluado el funcionamiento de los WDRs en términos de selectividad en longitud de onda y de eficiencia, y los resultados obtenidos presentan un buen acuerdo con las predicciones numéricas. Pasando a las configuraciones activas, se demuestra el control de la señal plasmónica en configuración WRR por medios tanto electro-ópticos como completamente ópticos. En el caso del control electro-óptico, el material dieléctrico que compone el WRR estaba dopado con un componente electro-óptico y a la estructura pasiva se le añadió un conjunto de electrodos planos. Bajo la aplicación de un campo eléctrico externo, se midió un cambio relativo en la transmisión a través de la guía plasmónica del 16%. En cuanto al control puramente óptico, se utilizó la no linealidad de un material polimérico con origen en una isomerización trans-cis. En este caso se detectó un factor 3 entre los estados de alta y baja transmisión del dispositivo con potencias de control del orden de milivatios (intensidad del haz óptico de control de unos 100W/cm2 aproximadamente). Además del control activo de los plasmones de superficie propagantes, la utilización de nanoestructuras plasmónicas que poseen resonancias plasmónicas localizadas puede dar lugar a nuevos fenómenos. En esta tesis también se han estudiado las interacciones entre las excitaciones moleculares en un polímero pi-congujado con las polarizaciones plasmónicas en nanocavidades plasmónicas híbridas. Utilizando espectroscopia de tipo bombeo-sonda con pulsos ultrarrápidos, se han analizado diversos aspectos del aumento en la interacción luz-materia para estructuras híbridas de dimensiones inferiores a la longitud de onda sometidas a concentraciones de luz muy altas. Por último, esta tesis también proporciona una visión general de los desafíos y posibilidades que las funcionalidades plasmónicas híbridas ofrecen en el campo de la nano-óptica basada en plasmones de superfície.

Els receptors acoblats a proteïna G són una família de proteïnes de membrana que està implicada en moltes malalties d'una gran importancia en la nostra societat actual. Degut a la manca d'estructures tridimensionals d'aquests receptors s'ha desenvolupat un protocol per tal d'estudiar-los in silico. Aquest protocol utilitza les simulacions de dinàmica molecular per a estudiar l'estructura i la funció dels GPCRs tot tenint en compte l'entorn hidrofòbic de la bicapa lipídica en el que es troben i l'efecte dels residus de serina i treonina en la conformació de les hèlixs alfa d'aquests receptors. A partir del protocol s'ha construit i validat a través del disseny racional de fàrmacs un model tridimensional per receptor 5-HT1A que a més a més és vàlid per a la majoria dels receptors de les amines biogèniques. Aquest model s'ha utilitzat per a identificar el mode d'unió dels receptors serotoninèrgics amb els seus lligands. La modelitzaió del mode d'unió dels receptors amb els seus lligans ha permès el disseny de nous lligands amb més afinitat i selectivitat. Tot el treball computacional s'ha validat a través de la síntesi i avaluació farmacològica dels lligands així com amb experiments de mutagènesi dirigida. / G-protein coupled receptors (GPCRs) are membrane proteins that transduce and amplify extracellular chemical signals to the interior of the cell. Due to its prominent role in cell signalling, GPCR malfunction is involved in a wide variety of diseases. Because of the lack of X-ray resolved GPCR structures, this thesis presents a protocol to study the structure and function of these proteins in silico. This protocol is based on molecular dynamics simulations, and takes into account explicitly the hydrophobic environment of the receptors due to the surrounding cellular membrane. In addition, it considers the influence of serine and threonine residues in the global conformation of the hydrophobic transmembrane alpha-helices that constitute the structural feature common to all GPCRs. Based on this protocol, a three dimensional model for 5-HT1A receptor has been constructed, which is valid for most of the biogenic amine receptor family. The computational models of the binding site of serotoninergic receptors have been validated through the synthesis and pharmacological evaluation of new ligands, and through site-directed mutagenesis experiments. This way, these three-dimensional models have allowed to identify and characterize the binding site of the serotoninergic receptors 5-HT1A, 5-HT4 and 5-HT7, and to design new ligands with improved affinity and selectivity for these receptors.