En este proyecto de tesis, hemos desarrollado 3 nuevos procedimientos por electroforesis capilar (CZE) para el estudio de pacientes con errores congénitos del metabolismo. Es un proyecto de investigación de base tecnológica, ya que se han aplicado los conocimientos de la doctoranda en Química para un desarrollo de procedimientos complejos, que os han permitido avanzar en la identificación de pacientes con enfermedades metabólicas. Estos avances se han plasmado en 3 publicaciones científicas en revistas internacionales. En el primer objetivo, hemos aplicado un procedimiento previamente validado en nuestro laboratorio para el diagnóstico de pacientes con defectos congénitos de la glicosilación (CDG). Gracias a este nuevo procedimiento, hemos podido identificar dos nuevos pacientes que habían pasado desapercibidos con los métodos de análisis convencionales (Casado et al, Cerebellum 2012). Además, el mayor grado de automatización de nuestro procedimiento frente al clásico por isoelectroenfoque permite analizar series más largas de pacientes y cuantificar las diferentes forma s de sialotransferrina en función de su grado de glicosilación, que es el biomarcador para los defectos CDG. En el segundo objetivo, nos propusimos estandarizar la cuantificación del neurotransmisor GABA en líquido cefalorraquídeo de pacientes neuropediátricos, ya que no existían referencias previas que detallaran dicho procedimiento (las disponibles, se basan principalmente en experimentación animal). Conseguimos separar GABA de glutamina, aminoácido que coeluía con el GABA y que está unas 5.000 veces más concentrado. Una vez superados los obstáculos técnicos, establecimos valores de referencia de GABA para una población pediátrica y estudiamos diferentes pacientes con trastornos neurológicos de la infancia. A destacar, que se demostró la utilidad de la determinación de GABA para la monitorización de tratamientos antiepilépticos, ya que muchos de ellos modulan el metabolismo del GABA para reducir las crisis epilépticas. Este trabajo ha sido publicado en la revista Electrophoresis (Casado et al, 2013). En el último objetivo, nos propusimos desarrollar un nuevo procedimiento para el análisis de oligosacáridos en orina, como herramienta para el estudio de pacientes con enfermedades lisosmales y del metabolismo de carbohidratos. En ese caso, la única alternativa tradicional es la cromatografía en capa fina, método no automatizable, largo y poco sensible. Hemos conseguido desarrollar un procedimiento por CZE y detección de fluorescencia inducida por láser que mejora considerablemente el método utilizado convencionalmente en la mayoría de laboratorios que estudian a este tipo de pacientes. Este nuevo procedimiento ha sido recientemente aceptado para publicación (Casado et al, Anal Bioanal Chem 2014). / In this thesis project, we have developed 3 new capillary electrophoresis (CZE) procedures for the study of patients with inborn errors of metabolism. This project has a technical approach, se we have taken advantage of the Chemistry knowledge of the student candidate, which allowed us to progress in the identification of new patients with inborn errors of metabolism and other neurological conditions in paediatric patients. These advances have been published in 3 different international scientific journals. In the first aim, we have applied a previously validated procedure in our laboratory for the diagnosis of patients with congenital disorders of glycosylation (CDG). We were able to identify 2 new cases with a very mild phenotype, who were misdiagnosed with the classical diagnostic procedures (Casado et al, Cerebellum 2012). Moreover, this method allows the analysis of large series of patients, since it is automatable. Furthermore, it allows the quantification of the different forms of sialotransferrin according to its glycosylation pattern, which is the more important biomarker for the study of patients with CDG syndromes. In the second aim, we standardized the quantification of the neurotransmitter GABA in cerebrospinal fluid of neuropediatric patients, since there was not scientific references about this topic (only procedures for the analysis of GABA in animal models were available). We got to separate GABA from glutamine, which co-eluted with GABA and it is about 5,000 times more concentrated than GABA is. Once these technical problems were solved, we established reference values for a paediatric population and we analyzed GABA in a cohort of neuropaediatric patients. As a milestone, we demonstrated that GABA analysis may be useful for the monitoring of antiepileptic therapy, since several antiepileptic drugs modulate GABA metabolism. This work has been published in Electrophoresis journal (Casado et al, 2013). For the last aim, we planned to develop a new procedure for the analysis of urinary oligosaccharides, as a diagnostic tool for the study of patients under the suspicion of having some lysosomal storage diseases and also those with some carbohydrate metabolism defects. The only diagnostic tool generally accepted for this purpose is a thin layer chromatography method (TLC), which is time-consuming, not automatable and probably no sensitive enough for identification of some patients with mild phenotypes. We have developed a new CZE procedure with laser-induced fluorescence detection which dramatically improves the conventional TLC method. The description and validation of this new procedure has been recently accepted for publication (Casado et al, Anal Bioanal Chem 2014).

La apolipoproteina J (apoJ) o clusterina (CLU) es una chaperona extracelular que forma parte del sistema de control que actúa para estabilizar las proteínas agregadas. Hay evidencias que muestran la existencia de una relación entre la apoJ y el desarrollo de arteriosclerosis ya que se ha visto que la expresión y la deposición de apoJ están aumentadas en zonas de lesión arteriosclerótica mientras que está ausente en la pared arterial sana. Una porción importante de la apoJ se asocia a las lipoproteínas en plasma, siendo más abundante en la HDL pero también hay una pequeña parte unida a la LDL y VLDL. La primera parte de la presente tesis se centra en el papel de la apoJ sobre las propiedades aterogénicas de la LDL. Hemos visto que la apoJ se une en la circulación plasmática preferentemente a las partículas de LDL agregadas. Experimentos llevados a cabo con LDL deplecionada de apoJ muestran que es más susceptible a agregarse que la LDL total. Por otro lado, la adición de apoJ purificada previene la agregación de la LDL. Estos datos demuestran un papel protector de la apoJ en la inhibición de la agregación de la LDL, que es un proceso clave en el desarollo de la arterioesclerosis. La segunda parte analiza la distribución relativa de la apoJ entre las diferentes lipoproteínas y en forma libre. Nuestros datos muestran que un 20% de la apoJ circulante en plasma está asociado a las lipoproteínas y el 80% en forma libre. Clasificando a los pacientes por el perfil lipídico se observó que en los individuos hiperlipémicos presentan una concentración mayor de apoJ que los normolipémicos. Esto indica que la concentración de apoJ en suero es dependiente del perfil lipoproteico, y está asociada positivamente con la concentración de colesterol y triglicéridos. En pacientes normolipémicos un 30% de la apoJ está asociada a lipoproteínas, mientras que en pacientes hiperlipémicos el porcentaje disminuye a un 17% en hipercolesterolémicos y un 15% en hipertrigliceridémicos. / Apolipoprotein J (apoJ) or clusterin (CLU) is an extracellular chaperone involved in the quality control system which acts stabilizing the aggregated proteins. Growing evidence shows the existence of a relationship between apoJ and the development of arteriosclerosis. ApoJ expression is increased in areas of atherosclerotic lesion while it is absent in healthy arterial wall. A major portion of the apoJ is associated with plasma lipoproteins, and although it is more abundant in HDL, there is also a small fraction bound to LDL and VLDL. The first part of this thesis focuses on the role of apoJ on the atherogenic properties of LDL. Our experiments show that apoJ binds preferentially to aggregated LDL particles in circulation. Experiments with LDL depleted of apoJ (LDL/J-) shows that it is more susceptible to aggregation than total LDL. Furthermore, the addition of purified apoJ prevents LDL aggregation. These data demonstrate a protective role of apoJ in LDL aggregation, which is a key event in the development of the atherosclerotic process. The second part analyzes the relative distribution of apoJ between the different lipoproteins and in free form. Our data show that 20% of circulating apoJ in plasma is bound to lipoproteins and 80% is in free form. Classifying patients by the lipid profile we observed that hyperlipidemic individuals have higher apoJ concentration than normolipemics. This indicates that the apoJ concentration in blood is dependent on the lipoprotein profile, and is positively associated with the concentration of cholesterol and triglycerides. In normolipidemic patients 30% of apoJ is associated with lipoproteins, while in hyperlipidemic patients the percentage decreases to 17% in hypercholesterolemic subjects and to 15% in hypertriglyceridemic subjects.

Las tiorredoxinas (Trx) son proteínas pequeñas y ubicuas implicadas en la reducción de los enlaces disulfuro de sus proteínas diana. El grupo de las Trxs está organizado en distintas clases. Los animales cuentan con sólo dos tipos, una citoplasmática y otra mitocondrial. En plantas hay, al menos, diez familias de TRXs con más de 40 miembros presentes en casi todos los compartimentos celulares. En mitocondrias vegetales sólo se han descrito dos tipos de Trxs; la Trxh en álamo (Populus) y la Trxo1 en Arabidopsis (A. thaliana) y guisante (Pisum sativum), donde ha sido también co-localizada en el núcleo. En esta Tesis hemos llevado a cabo diferentes aproximaciones experimentales con el fin de estudiar con detalle algunas de las posibles funciones de la Trxo1 en células vegetales. En primer lugar, hemos identificado posibles proteínas diana nucleares de PsTrxo1 a través de la utilización de técnicas de cromatografía de afinidad. La identificación de la proteína PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) y el componente regulador de rutas de ácido abcísico, el receptor de pirabactina 1 (PYR1) establece nuevas funciones para la PsTrxo1 relacionadas con la síntesis de ADN, ciclo celular, metabolismo hormonal y respuesta al estrés. Otra de las funciones descubiertas para esta Trxo1 durante esta Tesis ha sido su papel durante la germinación de la semilla de Arabidopsis. Ensayos de expresión de AtTrxo1 han señalado un alto nivel durante la germinación, particularmente en el embrión de las semillas sugiriendo un papel para AtTrxo1 durante la movilización de reservas en este proceso. Además, ensayos de germinación mostraron que las semillas del mutante KO AtTrxo1 germinaban antes que las semillas silvestres (Wt) en condiciones salinas, si bien, bajo condiciones estándar de crecimiento, ambos genotipos germinaban y se desarrollaban normalmente sugiriendo la importancia de la Trxo1 en el proceso germinativo y la adaptación a la salinidad. La escasa información relativa a la regulación transcripcional de las Trxs vegetales nos condujo en la búsqueda de elementos cis-trans en el promotor de AtTrxo1. Para ello, se realizaron estudios filogenéticos donde se identificaron seis elementos en cis-funcionalmente relevantes que fueron validados por ensayos de β-glucuronidasa. Posteriormente, los ensayos de un híbrido en levadura nos permitieron identificar más de 30 factores de transcripción pertenecientes a seis familias diferentes como posibles reguladores de la expresión de AtTrxo1. Entre ellos, bZIP9 mostró una fuerte interacción con pAtTrxo1 y se comportó como un posible regulador positivo de AtTrxo1, mientras que AZF2, un factor de dedo de zinc fuertemente relacionado con la respuesta a salinidad, se mostró como un posible represor. Finalmente, se iniciaron estudios de muerte celular. Para ello, utilizamos cultivos de células TBY-2 que sobre-expresaban PsTrxo1 y H2O2 como un inductor de PCD (Programmed Cell Death). La respuesta de las células dependió de la intensidad del tratamiento aplicado. Una concentración 15 mM H2O2 provocó una ligera disminución en la viabilidad del cultivo celular sin diferencias entre líneas. Sin embargo, concentraciones superiores a 35 mM causaron un efecto diferenciador sobre la viabilidad de ambas líneas y la línea sobre-expresante murió varios días después que la línea control. En este sentido, las células sobre-expresantes presentaron un menor estrés oxidativo y diferentes marcadores de PCD que justificaron el retraso observado en la muerte celular. En conclusión, estos resultados podrían sugerir la implicación de PsTrxo1 en la tolerancia de TBY-2 a un tratamiento con H2O2 y en el proceso de muerte celular desarrollado en estas condiciones. / Thioredoxins (Trxs) are ubiquitous small proteins involved in the reduction of disulfide bonds of target proteins. Trxs´ group is organized in different types. Animals contain only two types, one cytoplasmic and one mitochondrial. In plants there are at least ten families of Trxs with more than 40 members present in almost all the cellular compartments. In plant mitochondria only two types of Trx have been described, Trxh found in Populus and Trxo1 type in Arabidopsis (A. thaliana) and pea (Pisum sativum), where it has been also co-localized in the nucleus. In this thesis we have carried out different experimental approaches in order to study in greater depth some of the possible functions of the Trxo1 in plant cells. Firstly, we have identified specific potential nuclear targets of PsTrxo1 using affinity chromatographic techniques. The identification of PCNA protein (Proliferating Cell Nuclear Antigen) and the pyrabactin resistance 1 (PYR1) regulatory component of abscisic acid (ABA) receptor establishes new functions of PsTrxo1 related to DNA synthesis, cell cycle, hormonal metabolism and stress response. The role of Trxo1 in seed germination has been studied in this Thesis. Expression assays of AtTrxo1 pointed out a high level during germination, particularly in seeds embryo suggesting the feasible role of AtTrxo1 in storage proteins mobilization occurring in this process. In addition, germination tests showed that mutant seeds (KO AtTrxo1) germinated earlier than wild type seeds (Wt) in saline conditions, although under standard growth conditions, both genotypes germinated and developed normally, suggesting the importance of Trxo1 in germination and adaptation to salinity. The scarce information on the transcriptional regulation of plant Trxs led us to search cis-trans elements in the promoter of AtTrxo1. For this purpose, phylogenetic studies were done and six cis-functionally relevant elements were found. These elements were validated performing tests of β-glucuronidase. Subsequently, one hybrid assays in yeast allowed us to identify more than 30 transcription factors belonging to six different families showed as feasible regulators of AtTrxo1 expression. Among them, bZIP9 showed a strong interaction with pAtTrxo1 and it was identified as a positive regulator, while AZF2, a transcription factor strongly related with salinity response, was identified as a feasible AtTrxo1 repressor. Finally, we initiated different studies on the possible involvement of Trxo1 in cell death. We used overexpressing PsTrxo1 TBY-2 cell cultures and H2O2 as a PCD (Programmed Cell Death) inductor. The response of cells depended on the severity of the treatment. A concentration of 15 mM H2O2 caused a slight decrease in the viability of the cell culture with no differences between control versus overexpressing line. However, concentrations above 35 mM caused a differentiating effect on the viability and the over-expressing line died several days after the control line. In this situation, over-expressing cells presented lower oxidative stress and several PCD markers justifying the observed delay in cell death. In conclusion, these results could suggest the involvement of PsTrxo1 in TBY-2 of H2O2 treatment and in the cell death process developed in these conditions.

La proteïna CK2 és una serina/treonina quinasa present en tots els organismes eucariotes i que actua sobre una àmplia varietat de substrats cel·lulars, implicats en una àmplia gamma de funcions diferents, moltes de les quals són essencials per la cèl·lula. De fet, CK2 ha estat considerada com una proteïna quinasa essencial per la viabilitat de les cèl·lules eucariotes. Les alteracions de CK2 en una àmplia varietat de tumors malignes s’han confirmat en diversos estudis, mostrant-se una activitat quinasa i nivells de subunitats catalítiques incrementades en diferents tipus de tumors humans. Curiosament el paper de CK2 en el carcinoma renal de cèl·lules clares (ccRCC) –un càncer altament agressiu i que constitueix la major part de càncers renals humans- ha estat poc estudiada, malgrat el fet que un informe preliminar indicava que en aquest tipus de tumor la subunitat reguladora CK2β augmentava fins i tot en quantitats superiors que la subunitat catalítica CK2α. L’objectiu d’aquest treball ha estat profunditzar en el coneixement de la situació de CK2 en el ccRCC i estudiar com alteracions i desregulacions entre les seves subunitats poden afectar a la progressió del ccRCC. Amb aquesta finalitat s’han usat d’extractes de teixits i Tissue MicroArrays (TMAs) de biòpsies de pacients amb ccRCC i amb línies renals humanes derivades de túbul proximal silenciades de forma estable per les subunitats reguladores CK2β o les catalítiques CK2α de CK2, les quals han estat usades com a model ex vivo per l’estudi de la patologia. Els resultats obtinguts en aquest treball indiquen que en el ccRCC, no només apareixen alteracions en l’expressió dels nivells de CK2β (donant lloc a relacions CK2α/CK2β diferents en funció del grau i estadiatge tumoral) sinó que hi ha també canvis significatius en les localitzacions d’aquestes subunitats en les etapes més primerencs del tumor. D’altra banda, la disminució de l’expressió mitjançant el silenciament estable de les subunitats reguladores o catalítiques en línies renals humanes, fa que les línies adquireixin un fenotip EMT parcial, presentant característiques pròpies de cèl·lules mesenquimàtiques tals com la pèrdua del marcador epitelial E-cadherina, així com canvis en la morfologia i capacitat de creixement independent d’ancoratge. El fet que alteracions en les relacions de les subunitats de CK2 donin lloc a aquestes propietats mesenquimàtiques, acompanyades per canvis en les seves propietats migratòries i proliferatives, suggereix que alteracions en les relacions entre les subunitats durant el procés neoplàsic participarien en les diferents etapes de la progressió tumoral. / Protein kinase CK2 is a serine /threonine kinase present in all eukaryotes which acts on a wide variety of cellular substrates involved in a wide range of different functions, many of which are essential for the cell. In fact, CK2 has been considered as a protein kinase essential for the viability of eukaryotic cells. The alterations of CK2 in a wide variety of malignancies have been confirmed in different studies, showing increased kinase activity and catalytic subunit levels in different types of human tumours. Interestingly, the involvement of CK2 in clear cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC) -a highly aggressive cancer that constitutes most of the human renal cancers- has been little studied despite the fact that a preliminary report indicated that in this type of tumour the regulatory CK2β subunit increased even in higher amounts than the catalytic CK2α subunit. The aim of this work was to deepen in the knowledge of the status of CK2 in ccRCC tumours and to study how alterations and deregulations between its subunits can affect ccRCC progression. To this purpose we have made use of tissue extracts and Tissue MicroArrays (TMAs) from biopsies of ccRCC human tumours and human renal proximal tubular cell lines stably silenced either for the regulatory CK2β or the catalytic CK2α subunits of CK2, which have been used as an ex vivo model for the study of this pathology. The results obtained in this study indicate that in ccRCC, CK2 shows not only alterations in the CK2β expression levels (resulting in different CK2α/CK2β ratios depending on tumour grading and staging) but there are also significant changes in the localizations of these subunits in the early stages of this tumour. Moreover, the decrease in expression through the stable silencing of the catalytic or regulatory subunits of CK2 in human renal cell lines, provokes the acquisition of a partial-EMT phenotype, showing mesenchymal cell properties such as the loss of epithelial marker E-cadherin, as well as changes in their morphology and anchorage independent growth capacity. The fact that changes in CK2 subunits ratios give rise to those mesenchymal properties, accompanied by changes in their proliferative and migratory properties, suggest that alterations in the ratios between these subunits during the neoplasic process participates at different stages of tumour progression.

La proteïna quinasa CK2 és una serina/treonina quinasa molt conservada i ubiqua en organismes eucariotes, implicada en diversos processos cel·lulars importants com proliferació o tumorigénesis. L'enzim de mamífers està format por dues subunitats catalítiques (a y/o a') y dues subunitats reguladores (b) encara que també s'ha descrit l'existència de subunitats catalítiques lliures. La regulació de l'activitat CK2 no és una regulació clàssica mitjançant segons missatgers o fosforilació, de fet la subunitat catalítica té activitat constitutiva. Es postula que la regulació es podria dur a terme per variació de la localització subcel.lular mitjançant interacció con proteïnes adscrites a compartiments subcel.lulares concrets. La proteïna xaperona grp94 (94 kDa-glucose regulated protein) és una proteïna d'estrès que pertany a la família de les hsp90 i que es localitza al Reticle Endoplásmic (RE) de totes les cèl·lules eucariotes. S'expressa constitutivament en condiciones normals y es sobreexpressa en situacions d'estrès com depleció de calci, inhibició de la glicosilació, infecció vírica, agents reductores etc. Utilitzant tècniques de Ressonància Plasmònica, Far Western y Pull down demostrem que el domini carboxi terminal de grp94 interacciona amb la subunitat catalítica de CK2 (CK2a) però no amb la subunitat reguladora ni amb l'holoenzim (a2b2). S'ha pogut mapejar la regió d'interacció entre ambdues proteïnes, utilizant diversos mutants de CK2a, així la regió s'ha delimitat a una regió de lisines (K74-77) molt conservada entre las CK2a de diferents espècies. D'altra banda s'ha demostrat que grp94 té activitat xaperona in vitro sobre CK2a i citrat sintasa (CS). Utilizant assajos d'agregació induïda por xoc tèrmic y tècniques de microscòpia electrònica s'ha determinat que grp94 es capaç d'inhibir l'agregación de CK2a i CS. L'activitat xaperona depén fortament de l'estat d'oligomerització de grp94, de forma que en condicions reductores en que grp94 perd la seva estructura quaternària, la capacitat d'inhibir agregació de proteïnes està disminuïda. S'ha estudiat també la distribució subcel·lular de CK2 i grp94 en un model animal de rates genèticament obeses (fa/fa). Aquestes rates són hiperinsulinèmiques i resistents a insulina degut a una down-regulation del receptor de insulina. S'había descrit en cèl·lules en cultiu que el tractament amb dosis altes d'insulina induïa la sínstesi de grp94. S'ha observat que no hi ha variació ni en els nivells ni en la distribució subcel·lular de grp94 però si hi ha variació tan en els nivells com en la distribució de CK2, que disminueix marcadament en citosol i augmenta en les fraccions membranoses. / Protein kinase CK2 is a highly conserved and ubiquitously distributed serin/threonin kinase described in all eukaryotic organisms. CK2 has been implied in different cellular processes as proliferation or cancer. The mammalian enzyme is composed of two catalytic subunits (a and/or a') and two regulatory subunits (b), but have been described free catalytic and regulatory subunits. Regulation of CK2 is not a classic regulation through second messengers or phosphorylation, furthermore the catalytic subunit posses constitutive activity and it has been postulated that regulation could be done by changes in subcellular distribution due to interaction with different proteins from defined subcellular compartments. The protein chaperone grp94 (94 kDa-glucose regulated protein) belongs to the hsp90 family and is localized in the Endoplasmic Reticulum (ER) of all eukaryotic cells. Is constitutively expressed in absence of stress and is overexpressed under stress conditions as calcium depletion, virus infection, reducing agents etc. In the present work using techniques as Surface Plasmon Ressonance (SPR), Far Western and Pull down assays we have demonstrated that carboxy-terminal domain of grp94 interacts with the catalytic subunit of CK2 (CK2a) but not with the regulatory subunit or with the holoenzyme (a2b2). We mapped the interacting region using different mutants of CK2a, and we delimited the interacting domain to the cluster of lysines present in the helix aC(K74-77) on CK2a. This basic cluster is highly conserved in CK2a from different species but is not present in other kinases of the same family. Furthermore we demonstrated that grp94 has chaperone activity in vitro on CK2a and citrate synthase (CS). Light scattering of aggregated samples (aggregation promoted by heat shock) and electronic microscope imaging of aggregated samples have demonstrated that grp94 is able to protect CK2a and CS from aggregation. Chaperone activity depends on the maintenance of oligomeric state of grp94, then in reducing conditions when grp94 has lost its quaternary structure the ability to inhibit aggregation is diminished. In this work we also have been studied the subcellular distribution of CK2 and grp94 in an animal model of genetically obese rats (fa/fa). Zucker fa/fa rats are hyperinsulinemics and insulin resistant due to a down-regulation of insulin receptor. Additionally it has been described that in cultured cells insulin promoted the overexpression of grp94. In our model there is no variation of the levels or distribution of grp94 but exist differences in the levels and distribution of CK2 in liver of obese rats. In this rats CK2 is lower in the cytosolic fraction and increase in membranous fractions.

L'objectiu principal de la present tesis doctoral ha estat l'estudi de la possible contribució de l'Amino Oxidasa Sensible a Semicarbazida (SSAO) en el dany vascular, la seva implicació en l'Angiopatia Cerebral Amiloide (CAA) i la Malaltia d'Alzheimer (AD). La SSAO és un enzim multifuncional, al qual se li han atribuït diferents papers biològics depenent del teixit on es localitzi. La seva expressió es troba amplament distribuïda en mamífers, especialment en teixits altament vascularitzats, associat a cèl·lules endotelial i de múscul llis. Així mateix, existeix una forma de SSAO soluble present en el plasma de totes les espècies de mamífers estudiades. En el present treball, en primer lloc, es va estudiar la possible alteració de l'enzim en el desordre neurodegeneratiu tipus AD associat a CAA. Els resultats obtinguts van permetre demostrar, per una part, una sobreexpressió SSAO a nivell cerebrovascular humà en pacients amb AD-CAA. Per altra banda, es va determinar l'activitat SSAO plasmàtica de pacients amb demència tipus AD esporàdic i es va establir una correlació positiva entre els valors d'activitat SSAO soluble present en plasma i la severitat de la demència.Donat que els productes generats de l'acció catalítica de la SSAO són considerats altament reactius i amb propietats potencialment tòxiques, es va estudiar l'efecte de l'oxidació del substrat fisiològic de la SSAO, la metilamina, sobre cèl·lules vasculars en cultiu. Els resultats van permetre confirmar que l'oxidació de la metilamina, per part tant de la SSAO soluble com la SSAO tissular, era capaç d'induir apoptosis en cèl·lules de múscul llis. En resum, en situacions patològiques, on els nivells de SSAO cel·lular i SSAO soluble es troben incrementats, la seva acció catalítica podria contribuir al dany vascular en desordenes cerebrovasculars com l'Angiopatia Cerebral Amiloide associada a la Malaltia d'Alzheimer.

La Ciclosporina A (CsA) és un immunosupressor àmpliament utilitzat per evitar el rebuig de l'òrgan trasplantat. Malgrat tot, el seu ús s'ha vist limitat pels seus marcats efectes nefrotòxics. En el ronyó s'observa una diferent sensibilitat a la CsA segons el tipus cel·lular, sent les cèl·lules dels túbuls proximals les més sensibles. En aquest sentit, diversos treballs anteriors demostren la capacitat de la CsA d'induir efectes tòxics directament sobre la cèl·lula tubular en cultiu. L'objectiu d'aquesta tesi ha estat estudiar els efectes tòxics de la CsA en cèl·lules derivades del túbul proximal de ratolins i intentar determinar els mecanismes moleculars implicats en la toxicitat per CsA. Per a aquest fi s'ha analitzat els efectes del tractament amb CsA en la viabilitat cel·lular i sobre dues importants vies de senyalització implicades en mecanismes de supervivència i mort com són les vies ERK 1/2 i PI3K. Els nostres resultats mostren que el tractament amb CsA indueix toxicitat i pèrdua de la viabilitat cel·lular de manera dosis i temps depenent. El tractament amb CsA també indueix l'activació d'ambdues vies, si bé amb diferents conseqüències fisiològiques. Així, l'activació d'ERK no participa en els efectes tòxics de la CsA mentre que el bloqueig d'algunes isoformes de PI3K resulta en un important rescat de la citotoxicitat. En analitzar els mecanismes que condueixen a aquests efectes, hem observat que els efectes de la CsA sobre la viabilitat i l'activació d'aquestes vies de senyalització venen mediades per la transactivació del receptor de EGF (EGFR). L'activació del EGFR depèn, al seu torn, de la secreció d'un o més factors en resposta a CsA i que actuarien per un mecanisme autocrí sobre la pròpia cèl·lula. En el procés d'activació de EGFR estarien implicades també les metal·loproteïnases de matriu (MMPs). Els nostres resultats mostren que aquest component secretat en resposta a CsA és un factor d'unió a heparina que actuaria a través de la unió a proteoglicans de tipus heparan sulfats (HSPGs) de la superfície cel·lular. En l'intent d'identificar aquest factor hem pogut descartar la implicació del TGF-β, a priori un bon candidat, i hem comprovat la implicació al menys indirecta de la Ciclofilina B (CypB), el receptor intracel·lular de la CsA. En conclusió, els nostres resultats demostren que la CsA és capaç d'induir diferents respostes en les cèl·lules PCT3, on part d'aquest efectes vindrien mediats per un "loop" autocrí en la que es secretaria un factor d'unió a heparina que activaria EGFR i desencadenaria l'activació de ERK, PI3K i la toxicitat cel·lular. En un futur, la identificació dels factors secretats en resposta a CsA podria aportar una valuosa informació en el tractament de la nefrotoxicitat crònica per CsA. / The immunosuppressor cyclosporine A (CsA) has been widely used to prevent organ transplant rejection. The beneficial effects of CsA are restricted by its toxic side effects, with nephrotoxicity being the most remarkable one. In the kidney, there is a site-selective action of CsA on the cells of the proximal tubular region of the nephron, preferentially in epithelial cells of the S3 segment. In addition, recent reports have concluded that CsA exerts a direct toxic effect on cultured proximal tubular cells. The aim oh the present thesis was to study the toxic effects of CsA on the PKSV-PCT (PCT3) cell line, derived from the convoluted portion of the proximal tubule of kidneys from transgenic mice. For this purpose we have analyzed the effects of CsA treatment on cell viability and on ERK 1/2 and PI3K pathways, two important signalling pathways involved in cell survival and death processes. Our results show that CsA treatment affected cell viability and induces activation of both ERK and PI3K pathways in a dose and time-dependent manner. ERK activation was not involved in CsA-induced toxic effects while inhibition of some PI3K isoforms resulted in a significant decrease of CsA-induced cytotoxicity. We have observed that CsA triggered effects on cell viability and ERK and PI3K pathways activation where mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) and EGF receptor (EGFR) transactivation. EGFR activation in response to CsA was also dependent of the secretion of an heparin binding factor that would actuate through autocrine signalling. Cell surface proteoglycans of the heparin sulphate family (HSPGs) were also implicated in CsA triggered effects. To further explore the underlying mechanism of CsA triggered effects, we tried to identify the secreted factor responsible of CsA effects. Although TGF-β was a suitable candidate, our results show that it was not involved. Moreover, our results show that Cyclophilin B, the CsA intracellular receptor, was probably implicated in CsA effects. In conclusion, our results show that CsA is able to trigger different cell responses in PCT3 cells with different physiological outcomes. These effects would be mediated by an autocrine loop where an heparin binding factor would be secreted and would activate EGFR thus leading to ERK and PI3K activation and cell toxicity. In a future, the identification of the secreted factors in response to CsA could give us valuable information in the treatment of CsA-induced chronic nephrotoxicity.

La activación del Receptor de Muerte Fas, también llamado APO-1 o CD95, da lugar a la formación del Death Inducing Signaling Complex (DISC). Este complejo proteico contiene FADD y caspasa-8, entre otras proteínas, y causa el corte y activación de caspasa-8, que finalmente da lugar a la apoptosis. Existen dos vías de señalización diferenciadas en la apoptosis inducida por Fas. En las células tipo I, la activación de Fas da lugar a la formación de altos niveles de DISC, y los niveles de caspasa-8 son suficientes para cortar directamente la caspasa-3 ejecutora, que desencadena la apoptosis. En las células tipo II, los niveles de formación de DISC son más bajos y caspasa-3 no es cortada directamente por caspasa-8. En vez de ello, caspasa-8 corta la proteína BH3- only Bid, dando lugar a su forma truncada tBid, que transloca a la mitocondria e induce su permeabilización. Esto conlleva la salida de factores apoptogénicos de la mitocondria al citosol, como citocromo c, que da lugar a la activación de caspasa-3 a través del apoptosoma. Así, las células tipo II necesitan un paso de amplificación de la señal a través de la mitocondria. Los Antagonistas de los Receptores de Muerte son proteínas que son capaces de modular la actividad de los Receptores de Muerte. Entre ellos, Lifeguard (LFG), también llamado NMP35 o FAIM2, es un antagonista de Fas altamente expresado en el sistema nervioso. Esta proteína ha sido caracterizada como un inhibidor de la apoptosis inducida por Fas, y se ha comprobado su localización en los sitios postsinápticos y en las dendritas. Además, se ha comprobado que interacciona directamente con el receptor Fas en los rafts, e inhibe la actividad de las caspasas-8 y -3 tras la activación de Fas. Sin embargo, su mecanismo de acción aún no ha sido descrito. En este trabajo tratamos de arrojar algo de luz sobre este problema. Primero, resultados previos en nuestro laboratorio mostraron que LFG interacciona con varias proteínas del sistema ubiquitina. Confirmamos que LFG está ubiquitinado, y también mostramos que esta ubiquitinización no induce su degradación. Además, nuestros resultados sugieren que la ubiquitinización de LFG es no-canónica. Por otro lado, llevamos a cabo un extenso estudio para elucidar la localización subcelular de LFG. Demostramos que LFG localiza en las membranas del RE y del Golgi, y en menor medida, también en los endosomas. Dado que LFG es miembro de la familia de proteínas TMBIM, que son capaces de modular la actividad de las proteínas de la familia Bcl-2, investigamos su relación con ellas, y encontramos que interacciona con Bcl-xL y Bcl-2 a través de su región C-terminal. Además, demostramos que LFG solamente protege a las células tipo II de la muerte inducida por Fas, y esta protección es dependiente de la expresión endógena de Bcl-xL. Para finalizar, nuestros resultados revelan un paso no descrito hasta el momento en la vía de señalización de las células tipo II. La movilización de calcio del RE se ha comprobado que es relevante en la vía de señalización apoptótica inducida por Fas. Aquí, demostramos que LFG modula la salida de calcio del RE tras la estimulación de Fas, e inhibe la apoptosis inducida por Fas en células tipo II. Basándonos en estas observaciones, proponemos que LFG protege de la apoptosis inducida por Fas mediante la modulación de la salida de calcio del RE. / Activation of the Death Receptor Fas, also called APO-1 or CD95, leads to the formation of the Death Inducing Signaling Complex (DISC). This protein complex comprises FADD and caspase-8, among other proteins, and it causes the cleavage and activation of caspase-8, that ultimately leads to apoptosis. There are two differentiated pathways in the Fas induced apoptosis. In type I cells, high levels of DISC are formed upon Fas activation, and caspase-8 levels are sufficient to directly cleave the effector caspase-3, which will trigger apoptosis. In type II cells, DISC formation levels are lower and caspase-3 is not directly cleaved by caspase-8. Instead, caspase-8 cleaves the BH3-only protein Bid, generating its truncated form tBid, which translocates to the mitochondria and induce its permeabilization. This will result in release of apoptogenic factors from the mitochondria to the cytosol, such as cytochrome c, which will activate caspase-3 through the apoptosome. Thus, type II cells need a signal amplification step through the mitochondria. Death Receptor Antagonists are proteins that are able to modulate Death Receptor activity. Among them, Lifeguard (LFG), also called NMP35 or FAIM2, is a Fas antagonist highly expressed in the nervous system. This protein has been characterized as a Fas-induced apoptosis inhibitor, and it has been shown that localizes at postsynaptic sites and dendrites. Moreover, it has been reported to interact directly with Fas receptor in the lipid rafts and inhibit caspase-8 and caspase-3 activity upon Fas activation. However, its mechanism of action has remained elusive. In this work, we try to shed some light on this problem. First, previous results in our lab have shown that LFG interacts with several proteins from the ubiquitin system. We confirmed that LFG is ubiquitinated, and we also show that this ubiquitination does not induce its degradation. In addition, we present data that suggest that LFG ubiquitination is done in a non-canonycal way. On the other hand, we make an extensive study to elucidate LFG subcellular localization. We demonstrate that LFG localizes to ER and Golgi membranes, and to a lesser extent, to endosomes. Since LFG is member of the TMBIM family proteins, that are able to modulate Bcl-2 family activity, we investigated its relationship with them, and found that it interacts with Bcl-xL and Bcl-2, through its C-terminal region. Moreover, we prove that LFG protects only type II cells from Fasinduced apoptosis, and this protection is dependant on Bcl-xL endogenous expression. Finally, our results reveal a hitherto undescribed step in the signaling pathway in type II cells. Calcium mobilization from the ER has been shown to be relevant in Fas apoptotic signaling. We demonstrate that LFG modulates calcium release from the ER after Fas stimulation and inhibits Fasinduced apoptosis in type II cells. On the basis of our observations, we propose that LFG protects against Fas-induced apoptosis by modulating calcium release from the ER.

La retinosis pigmentària (RP) es una enfermedad hereditaria que provoca una degeneración progresiva de la retina y en la mayoría de los casos conduce a la ceguera.El trabajo realizado ha permitido clasificar genéticamente a los pacientes afectados de RP, atendiendo a su patrón de herencia.Uno de los objetivos ha sido la determinación del origen molecular de la RP en los casos de retinosis pigmentaria autosómico dominante (RPAD) en la población española así como en casos esporádicos o aislados de RP (SRP). Así, se ha realizado el estudio genético directo de los genes de expresión específica de retina asociados a retinosis pigmentària autosómica dominante (RHO, RDS-periferina, ROM-1, RP1, NRL y CRX) y la caracterización de las mutaciones detectadas. Se recogen también la expresión clínica de las mutaciones descritas y, en los casos que ha sido posible, se ha procurado establecer una co-relación genotipo-fenotipo.Así mismo, se han clonado los genes NRL y CRX, factores de transcripción de genes específicos de retina asociados a RPAD. A partir del gen NRL clonado y, mediante mutagénesis dirigida por PCR, se han obtenido in vitro dos mutantes del gen NRL detectados en la población estudiada. Estudios in vitro de expresión génica con estos mutantes muestran una regulación diferencial del promotor del gen de la rodopsina con respecto la proteína salvaje, produciendo una sobre expresión del gen regulado. Se postula que una sobre alteración de la dosis génica puede ser un mecanismo patológico que desencadene la enfermedad. / The retinosis pigmentària (RP) is a hereditary disease that provokes a progressive degeneracy of the retina and in the majority of the cases he(she) drives to the blindness.The realized work has allowed to classify genetically the affected patients of RP, attending to his(her,your) boss of inheritance(heredity).One of the aims(lenses) has been the determination of the molecular origin of the RP in the cases of retinosis pigmentaria autosómico dominant (RPAD) in the Spanish population as well as in cases sporadic or isolated of RP (SRP). This way, there has been realized the genetic direct study of the genes of specific expression of retina associated to retinosis pigmentària autosómica dominant (RHO, RDS-periferina, ROM-1, RP1, NRL and CRX) and the characterization of detected mutations.There is gathered also the clinical expression of the described mutations and, in the cases that it(he,she) has been possible, a co-relation has tried(got) to establish genotype - fenotipo.Likewise, there are clonado the genes NRL and CRX, factors of transcription of specific genes of retina associated with RPAD. From the gene NRL clonado and, by means of mutagénesis directed by PCR, there have been obtained in vitro two mutants of the gene NRL detected in the studied population. In vitro studies of gene expression with these mutants show a differential regulation of the promoter of the gene of the rodopsina with respect the wild protein, producing one on expression of the regular gene. There is postulated that one on alteration of the dose génica can be a pathological mechanism that unleashes the disease.

El càncer de pròstata és el segon tumor més freqüent i la segona causa de mort per malaltia oncològica en els homes del món occidental. Per a créixer, les cèl·lules epitelials del tumor necessiten els andrògens, les accions dels quals són mediades pel receptor d’andrògens, l’AR, un factor de transcripció que pertany a la família dels receptors hormonals esteroïdals. L’AR és clau en el desenvolupament del tumor de pròstata i per això és la major diana terapèutica en el tractament amb deprivació hormonal en aquesta patologia. La teràpia és efectiva durant un cert període de temps, però després els tumors esdevenen resistents a la castració, augmentant la seva agressivitat. La diabetis melitus (DM) s’ha associat amb un risc augmentat de patir nombrosos càncers. No obstant, diversos estudis demostren que la DM comporta menys risc de patir càncer de pròstata. Amb tots aquests antecedents en la literatura vam voler investigar quin paper jugava l’AR en el procés de l’hormonoresistència i si era un factor que influïa en el menor risc de patir càncer de pròstata en els pacients diabètics. Els resultats obtinguts en la tesi (gràcies a l’ús de models cel·lulars i un model animal xenograft de càncer de pròstata) demostren que hi ha un procés de metilació durant la supressió hormonal, però aquest procés només té lloc en el promotor de l’AR quan la supressió és constant i prolongada en el temps. A més a més s’ha comprovat que en absència d’hormones l’AR es localitza majoritàriament a la mitocòndria. Hem demostrat l’existència de 5 unitats de transcripció de l’AR, 3 de les quals no havien estat descrites anteriorment, que no presenten illes CpG i que podrien jugar un paper important en el càncer de pròstata i el seu progrés. Finalment vam comprovar que la hiperglicèmia redueix els nivells d’AR, a través de l’activació de NF-kB, per tant, els pacients diabètics tindrien menys risc de patir càncer de pròstata degut al silenciament de l’AR canònic. De tos els resultats obtinguts en la tesi podem concloure que el receptor d’andrògens té una gran importància en el desenvolupament i la progressió del càncer de pròstata i que és una molt bona diana per desenvolupar nous fàrmacs. / Prostate cancer is the second most common tumour and the second cause of cancer death in men in western world. To grow, tumour epithelial cells need androgens whose actions are mediated by androgen receptor, a transcription factor that belong to the family of hormonal receptors. AR is essential in the development of prostate cancer and for this reason is the main target in most of the therapies of the tumour. Androgen depletion is effective for a certain period of time but at the end the tumors become resistant to castration, increasing their aggressiveness. Diabetes mellitus (DM) is associated with an increased risk of developing many cancers. However, several studies show that the DM carries less risk of prostate cancer. With all this background in literature we wanted to investigate the role played by AR in the process of hormone resistance and if it AR was a key factor in the reduced risk of prostate cancer in diabetic patients. Our results show that there is a process of methylation during hormonal suppression but it only occurs in AR promoter when the androgen ablation is prolonged in time. In addition, it was found that in the absence of hormones AR is located basically in mitochondria. We have demonstrated the existence of 5 transcription units of the AR, 3 of which had not been previously described, with no CpG islands. These new transcription units could play an important role in prostate cancer and its progression. Finally we found that hyperglycemia reduces AR levels through the activation of NF-kB, so diabetic patients have less risk of prostate cancer due to silencing of canonical AR. As a summary, our results indicate that the androgen receptor has a important role in the development and progression of prostate cancer and is a key target for developing new drugs.