La cicatrisation cornéenne représente un processus de réparation complexe qui vise à restaurer l'intégrité, la structure et la transparence de la cornée. Cependant, dans un certain nombre de cas, ce processus peut évoluer de façon anormale et se stabiliser en entraînant la formation d'une opacité cornéenne installée. Les mécanismes impliqués dans la formation de ces cicatrices persistantes ne sont pas encore complètement élucidés, mais il est établi que la composition et l'organisation de la matrice extracellulaire du stroma jouent un rôle majeur dans la restauration de la transparence de la cornée. Ce projet s’est concentré sur la métalloprotéase extracellulaire BMP-1 (Bone Morphogenetic Protein 1), déjà connue pour son rôle dans l'assemblage de la matrice extracellulaire et l'activation du TGF-bêta. Afin d’identifier les processus contrôlés par BMP-1 dans la cornée, nous avons d’abord effectué une comparaison systématique des inhibiteurs de BMP-1 connus ou potentiels, de différentes origines, pour caractériser leurs propriétés à la fois in vitro et dans des cultures cellulaires. Ensuite, nous avons mené une étude approfondie du sécrétome des cellules stromales de la cornée humaine (kératocytes), et des conséquences de la différenciation de ces cellules en myofibroblastes. Enfin, nous avons analysé les événements protéolytiques médiés par BMP-1 dans le sécrétome des kératocytes en utilisant principalement une approche de protéomique quantitative basée sur le marquage iTRAQ des protéines entières (technique TAILS). La comparaison des inhibiteurs disponibles de BMP-1 a permis de mettre en évidence différents profils d’efficacité, de spécificité et de toxicité et a conduit à l’identification d’un inhibiteur hydroxamate et d’un inhibiteur protéique efficaces, peu toxiques et très spécifiques de BMP-1. Le sécrétome des kératocytes s’est avéré être un modèle adéquat pour l’étude des activités de BMP-1 dans le contexte cornéen. Plus de 2022 protéines ont été identifiées, dont la métalloprotéase BMP-1 et 16 de ses 33 substrats connus jusqu’à présent. Enfin, 76 protéines modifiées par l’activité de BMP-1 ont été identifiées dans le sécrétome des kératocytes. Ces résultats confirment les liens forts entre BMP-1, l'assemblage de la matrice extracellulaire et le TGF-bêta, mais suggèrent également de nouveaux rôles pour la protéase dans l'inflammation. Certains des substrats nouvellement identifiés (TGFBI, HSP47 et collagène VI) sont très pertinents dans le contexte de la cicatrisation de la cornée et ont été validés d’un point de vue biochimique. En conclusion, BMP-1 est confirmée comme une cible potentielle intéressante pour traiter ou prévenir la formation des opacités cornéennes et la caractérisation des inhibiteurs disponibles ouvre des perspectives importantes pour des études précliniques chez l’animal / When the cornea is injured, a complex multi-step healing process is triggered which aims at restoring corneal integrity, structure and transparency. However, in some cases, corneal healing results in the formation of a stable scar associated with a prolonged loss of corneal transparency and with functional blindness. The mechanisms involved in the formation of these persistent scars are still not fully understood but it is known that the composition and organization of the extracellular matrix significantly contributes to the maintenance of corneal transparency. This work focused on the extracellular metalloproteinase called BMP-1 (Bone Morphogenetic Protein 1), a major player in the control of extracellular matrix assembly and TGF-beta activation, which was previously shown to be up-regulated in corneal healing and scarring. In order to further probe BMP-1 functions in corneal healing, we first performed a systematic comparison of known or potential BMP-1 inhibitors from different origins to characterize their properties both in vitro and in cell cultures. We then carried out an in-depth study of the secretome of human corneal stromal cells (keratocytes) and of the consequences of the differentiation of these cells into myofibroblasts. Finally, we analyzed BMP-1-mediated proteolytic events in keratocyte secretomes, mainly using a quantitative proteomic approach based on iTRAQ labeling of proteins (TAILS technique). The comparison of BMP-1 available inhibitors revealed different profiles of efficacy, specificity and toxicity and led to the identification of one hydroxamate inhibitor and one protein inhibitor, which were very efficient, non-toxic and very specific of BMP-1. The keratocyte secretome was shown to be a suitable model for the study of BMP-1 activities in the corneal context. More than 2022 proteins were identified, including the BMP-1 metalloprotease and 16 of its 33 already known substrates. Finally, 76 proteins modified by BMP-1 activity were identified in the keratocyte secretome. These results confirm the strong links between BMP-1, extracellular matrix assembly and TGF-beta, but also suggest new roles for this protease in cell proliferation and inflammation. Some of the newly identified substrates (TGFBI, HSP47 and collagen VI) are highly relevant in the context of corneal healing and were validated at the biochemical standpoint. In conclusion, BMP-1 is confirmed as a potential target to treat or prevent the formation of corneal opacities and the characterization of available inhibitors opens up important perspectives for preclinical studies in animals

La Bone Morphogenetic Protein-1 (BMP-1) est une métalloprotéase impliquée dans la maturation et l'activation de nombreuses molécules extracellulaires. Parmi celles-ci, on trouve notamment les collagènes fibrillaires, les protéines les plus abondante chez l'Homme, ainsi que les facteurs de croissance de la superfamille du TGF-ß, des protéines pléiotropes. Au travers de ses fonctions, BMP-1 joue un rôle crucial au cours du développement embryonnaire mais également durant les processus physiologiques et pathologiques de remodelage tissulaire (cicatrisation, fibroses, croissance osseuse, cancers...).Le projet présenté dans ce manuscrit a consisté à étudier plusieurs fonctions importantes de BMP-1 au niveau moléculaire et à caractériser les conséquences de ces activités au niveau de plusieurs types cellulaires.Dans un premier temps, un test quantitatif a été mis au point afin de pouvoir étudier en temps réel l'effet de BMP-1 sur les collagènes fibrillaires ainsi que les mécanismes de sa régulation. Par la suite, de nouveaux substrats de BMP-1 ont été mis en évidence, parmi lesquels des co-récepteurs du TGF-ß (Bétaglycan, CD109) ainsi qu'une protéine matricellulaire (TSP-1). L'étude de ces activités a permis de caractériser les multiples voies par lesquelles BMP-1 est capable de réguler l'activité du facteur de croissance TGF-ß.De plus, nous avons mis en évidence que le clivage de ces différents substrats entraine une modulation importante du phénotype de plusieurs lignées cellulaires (HT1080, HEK-293T) avec des effets au niveau de l'adhésion, la prolifération et la migration cellulaire. En conclusion, ce travail révèle que les activités de BMP-1 s'étendent bien au-delà de ce qui est actuellement décrit / Bone Morphogenetic Protein (BMP-1) is a metalloprotease known to be involved in the maturation and activation of several important extracellular proteins, including fibrillar collagens and growth factors of the TGF-beta superfamily. As a consequence, it is essential for embryonic development and tissue remodeling and has been clearly involved in lethal diseases such as fibrosis and cancer.This thesis project focused on the major molecular functions of BMP-1 and their implications for the phenotype of several cell types. First, a quantitative and real-time assay was developed to study the effect of BMP-1 and associated regulatory proteins on fibrillar collagens. Then, new BMP-1 substrates, such as TGF-ß co-receptors (Betaglycan and CD109) and matricellular proteins (TSP-1) were characterized in detail. Especially, we evidenced that these activities played a major role in the regulation of the TGF-ß pathway.Furthermore, we shown that these BMP-1 activities induce major phenotype changes (adhesion, proliferation, migration) in several cell lines including HT1080 and HEK-293T. Altogether, this work reveals that BMP-1 substrates extend far beyond what is presently described and open several perspectives for future studies

Myostatin (GDF-8) is the chief chalone in skeletal muscle and negatively controls adult skeletal muscle growth. The role of myostatin during overload-induced hypertrophy of adult muscle is unclear. We tested the hypothesis that overloaded adult rodent skeletal muscle would result in reduced myostatin protein levels. Overload-induced hypertrophy was accomplished by unilateral tenotomy of the gastrocnemius tendon in male adult Sprague-Dawley rats followed by a two-week period of compensatory overload of the plantaris and soleus muscles. Western blot analysis was performed to evaluate changes in active, latent and precursor myostatin protein levels. Significant hypertrophy was noted in the plantaris (494 ± 29 vs. 405 ± 15 mg, p < 0.05) and soleus (289 ± 12 vs. 179 ± 37 mg, p < 0.05) muscles following overload. Overloaded soleus muscle decreased the concentration of active myostatin protein by 32.7 ± 9.4% (p < 0.01) while the myostatin precursor protein was unchanged. Overloaded plantaris muscle decreased the concentration of active myostatin protein by 28.5 ± 8.5% (p < 0.01) while myostatin precursor levels were reduced by 17.5 ± 5.9% (p < 0.05). Myostatin latent complex concentration decreased in the overloaded soleus and plantaris muscle by 15.0 ± 5.9% and 70.0 ± 2.3% (p < 0.05), respectively. These data support the hypothesis that the myostatin signaling pathway in overloaded muscles is generally downregulated and contributes to muscle hypertrophy. Plasma concentrations of total and active myostatin proteins were similar in overloaded and control animals and averaged 8865 ± 526 pg/ml and 569 ± 28 pg/ml, respectively. Tissue levels of BMP-1, an extracellular proteinase that converts myostatin to its active form, also decreased in overloaded soleus and plantaris muscles by 40.4 ± 12.9% and 32.9 ± 6.9% (p < 0.01), respectively. These data support the hypothesis that local, rather than systemic, regulation of myostatin contributes to the growth of individual muscles, and that an association exists between the extracellular matrix proteinase BMP-1 and the amount of active myostatin in overloaded muscles.