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Neue Untersuchungsmöglichkeiten mit dem BacT/Alert 3D (bioMèrieux) Mykobakterien-TestsystemUlber, Heidi 08 March 2017 (has links) (PDF)
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Untersuchungsmöglichkeiten mit dem BacT/Alert 3D Mykobakterien-Testsystem erprobt. Erstens wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Testkonzentrationen für Protionamid (PTH) und Linezolid (LIZ) für die standardmäßige Empfindlichkeitstestung von M. tuberculosis (Mtb) mit dem BacT/Alert 3D-System festzulegen. Dazu wurden die MHK-Werte für 32 Mtb-Stämme bestimmt: Referenzstamm Mtb H37Rv, sensible Patientenstämme, Patientenstämme mit verschiedenen Resistenzen (u. a. PTH-Resistenz) sowie eigens für die Arbeit isolierte LIZ-resistente Mutanten. Die PTH-MHK betrug für 20 von 21 sensiblen Mtb-Stämmen einschließlich des Referenzstammes Mtb H37Rv 0,125 - 1 mg/l (0,25 mg/l bei 11 von 21 Stämmen). Lediglich ein Stamm mit Resistenz gegenüber Isoniazid, Ethambutol und Streptomycin fiel mit einer etwas erhöhten PTH-MHK von 2 mg/l auf. Sechs PTH-resistente Stämme (z. T. mit anderen Resistenzen gegenüber Erstrang-Antituberkulotika) zeigten PTH-MHK von 4 - 16 mg/l. Die Gruppen der PTH-sensiblen und resistenten Stämme zeigten ein bimodales Verteilungsmuster, das mit einem Schwellenwert von 2 mg PTH/l gut zu differenzieren ist. Für die standardmäßige Durchführung der Empfindlichkeitstestung gegenüber PTH mit dem BacT/Alert 3D-System empfehlen wir deshalb eine PTH-Testkonzentration von 2 mg/l.
Die LIZ-MHK betrug für 20 sensible Mtb-Stämme (inklusive Referenzstamm Mtb H37Rv) und sieben Stämme mit verschiedenen Resistenzen gegenüber Erstrang-Antituberkulotika 0,25 - 2 mg/l (0,5 mg/l bei 17 von 27 Stämmen). Für die vier isolierten LIZ-resistenten Mutanten betrug die LIZ-MHK 8 - 16 mg/l. Es zeigt sich auch bei der Verteilung der LIZ-MHK ein bimodales Verteilungsmuster; die Gruppen der sensiblen und resistenten Stämme sind gut zu differenzieren. Wir empfehlen für die standardmäßige Durchführung der Empfindlichkeitstestung gegenüber LIZ mit dem BacT/Alert 3D-System eine LIZ-Testkonzentration von 4 mg/l. Die festgestellten MHK-Werte von PTH und LIZ und die vorgeschlagenen Testkonzentrationen entsprechen Ergebnissen aus der Literatur, die mit ähnlichen Methoden erhoben wurden.
Zweitens wurden mit dem BacT/Alert 3D-System Untersuchungen zur Kombinationstestung von Antituberkulotika bei Mtb und Stämmen des MAC-Komplexes durchgeführt, bisher liegen keine Publikationen für Untersuchungen von Wirkstoff-Kombinationen bei Mykobakterien mit diesem System vor. Es wurde geprüft, ob die MHK eines Antituberkulotikums durch die Zugabe einer subinhibitorischen Menge eines anderen Antituberkulotikums verändert wird. Bei Mtb wurden dazu folgende Kombinationen geprüft: Rifampicin (RMP) + LIZ, Moxifloxacin + LIZ, Isoniazid + PTH, RMP + PTH, PTH + LIZ. In keinem Fall konnten signifikante Effekte beobachtet werden. Ein tendenziell synergistischer Effekt der PTH-RMP-Kombination beim Stamm Mtb H37Rv (Reduktion der RMP-MHK um eine Stufe) wurde durch die Analyse der Wachstumskinetik des Stammes unterstützt. Bei zufällig ausgewählten Stämmen des MAC-Komplexes wurde die Kombination Ciprofloxacin (CIP) + Ethambutol (EMB) geprüft. Es zeigte sich bei sieben von zehn Stämmen eine Reduzierung der CIP-MHK um mindestens drei Stufen bei Zugabe einer subinhibitorischen Konzentration von EMB. Dieser synergistische Effekt wurde bereits in den 1990er Jahren mit einer ähnlichen Methode festgestellt, allerdings ohne die Stämme des MAC-Komplexes zu differenzieren (Arbeitsgruppe von S. Hoffner). Interessanterweise handelte es sich bei den von uns untersuchten Stämmen, bei denen dieser synergistische Effekt nachgewiesen wurde, um M. avium-Stämme. Diese Problematik sollte weiter verfolgt werden, da sich daraus Konsequenzen für die Therapieempfehlung ergeben könnten.
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Re-Evaluierung, methodische Optimierung und weitergehende Charakterisierung der Empfindlichkeitstestung von Mycobacterium tuberculosis mit dem BacT/Alert 3D (bioMérieux)Knigge, Anna Sophie 07 April 2014 (has links) (PDF)
Es erfolgte die Re-Evaluierung der Empfindlichkeitstestung von Tuberkuloseerregern mit dem BacT/Alert-3D-System (bioMérieux) unter besonderer Berücksichtigung des Materialwechsels der Kulturflasche von Glas auf Plastik. Dazu wurden insgesamt 61 vergleichende MHK-Bestimmungen mit diesen beiden Flaschentypen durchgeführt, wobei sechs Antituberkulotika (INH, RMP, EMB, SM, PTH und MOX) sowie zwölf Mykobakterienstämme (davon neun Mtb.) untersucht wurden. Dabei findet sich kein Unterschied in den MHK-Werten zwischen Glas- und Plastikflaschen. Die Plastikflaschen sind folglich ebenso wie die Glasflaschen zur Empfindlichkeitstestung von Tuberkuloseerregern mit dem BacT/Alert-3D-System geeignet. Bei der bisherigen Methode wurde bei der PZA-Testung auf die Verwendung der Kontrollflasche zur Festlegung der Untersuchungszeit verzichtet, weil der erniedrigte pH-Wert ein unverhältnismäßig langsames oder gar fehlendes Wachstum in dieser Flasche bewirkt. Durch Optimierung von pH-Wert (pH 5,9) und PZA-Testkonzentration (200 mg/l) wurde erreicht, dass die PZA-Testung nach der gleichen Methode wie auch bei den anderen Antituberkulotika praktiziert, durchgeführt werden kann. Im weiteren wurde untersucht, wie hoch der Anteil resistenter Mutanten in Mischkulturen sein muss, um erkannt zu werden. Dazu wurden dem sensiblen Stamm H37Rv jeweils isogene Mutanten mit Monoresistenzen gegen INH, RMP oder SM bzw. EMB- und PZA-resistente Stämme in verschiedenen Anteilen zugesetzt. Es zeigte sich, dass ein Anteil von 1% resistenter Stämme noch nicht sicher detektiert wird. / The purpose of this paper is to optimize and reevaluate the methods of susceptibility testing of M.tuberculosis with the BacT/Alert 3D System (bioMérieux). The key aspect was the comparison between culture bottles from glass between those made out of plastic material. Therefore 61 comparative MIC-tests were carried out, with six antituberculous drugs (INH, RMP; EMB, SM, PTH and MOX) and twelve mycobacterial strains (nine Mtb.) in order to compare the MIC in the two different bottle types. The MIC of 40 comparative tests between plastic culture bottles were identical to those in glass material. Only 18 test results deviated between the two bottle types. In each of those tests the discrepancy was only one degree of dilution, which is considered as not relevant. Resistant strains were found in three tests, with no difference between glass and plastic bottles. The deviant twelve results of Mtb. strains show a six times higher MIC-value in plastic bottles and a six times lower MIC in plastic bottles. In the case of the substance INH all four discrepant results had a higher MIC in the plastic bottle. Since these results were known by the Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie of the University Leipzig, it was consequently used with good results in the laboratory routine, as well as in external quality control (INSTAND-Ringversuche 2009 to 2011).
The second topic of this study was to optimize the current method of susceptibility testing of Mtb. concerning pyrazinamide (PZA). In the current method the low pH of the dilution (5.5) with the resulting weak growth of the strains forced the laboratory assistant to abandon the 1% control bottle as endpoint of measurement. The new and optimized pH of 5.9 and a concentration of PZA of 200 mg/l allows the susceptibility testing of PZA with the same method as practiced for the other antituberculous drugs.
Yet another focus of this study was the sensitivity of the BacT/Alert 3D System to detect heteroresistant clones in the mycobacterial broth. Resistant clones and fully susceptible Mtb. strain (H37Rv) were mixed in different percentages and susceptibility testing was performed. It could be shown, that a secure detection of resistant clones is not possible at a percentage 1% of resistant clones in the culture.
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Neue Untersuchungsmöglichkeiten mit dem BacT/Alert 3D (bioMèrieux) Mykobakterien-Testsystem: -Empfindlichkeitstestung von M. tuberculosis gegenüber Protionamid und Linezolid- Testung von Wirkstoffkombinationen bei MykobakterienUlber, Heidi 25 January 2017 (has links)
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Untersuchungsmöglichkeiten mit dem BacT/Alert 3D Mykobakterien-Testsystem erprobt. Erstens wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Testkonzentrationen für Protionamid (PTH) und Linezolid (LIZ) für die standardmäßige Empfindlichkeitstestung von M. tuberculosis (Mtb) mit dem BacT/Alert 3D-System festzulegen. Dazu wurden die MHK-Werte für 32 Mtb-Stämme bestimmt: Referenzstamm Mtb H37Rv, sensible Patientenstämme, Patientenstämme mit verschiedenen Resistenzen (u. a. PTH-Resistenz) sowie eigens für die Arbeit isolierte LIZ-resistente Mutanten. Die PTH-MHK betrug für 20 von 21 sensiblen Mtb-Stämmen einschließlich des Referenzstammes Mtb H37Rv 0,125 - 1 mg/l (0,25 mg/l bei 11 von 21 Stämmen). Lediglich ein Stamm mit Resistenz gegenüber Isoniazid, Ethambutol und Streptomycin fiel mit einer etwas erhöhten PTH-MHK von 2 mg/l auf. Sechs PTH-resistente Stämme (z. T. mit anderen Resistenzen gegenüber Erstrang-Antituberkulotika) zeigten PTH-MHK von 4 - 16 mg/l. Die Gruppen der PTH-sensiblen und resistenten Stämme zeigten ein bimodales Verteilungsmuster, das mit einem Schwellenwert von 2 mg PTH/l gut zu differenzieren ist. Für die standardmäßige Durchführung der Empfindlichkeitstestung gegenüber PTH mit dem BacT/Alert 3D-System empfehlen wir deshalb eine PTH-Testkonzentration von 2 mg/l.
Die LIZ-MHK betrug für 20 sensible Mtb-Stämme (inklusive Referenzstamm Mtb H37Rv) und sieben Stämme mit verschiedenen Resistenzen gegenüber Erstrang-Antituberkulotika 0,25 - 2 mg/l (0,5 mg/l bei 17 von 27 Stämmen). Für die vier isolierten LIZ-resistenten Mutanten betrug die LIZ-MHK 8 - 16 mg/l. Es zeigt sich auch bei der Verteilung der LIZ-MHK ein bimodales Verteilungsmuster; die Gruppen der sensiblen und resistenten Stämme sind gut zu differenzieren. Wir empfehlen für die standardmäßige Durchführung der Empfindlichkeitstestung gegenüber LIZ mit dem BacT/Alert 3D-System eine LIZ-Testkonzentration von 4 mg/l. Die festgestellten MHK-Werte von PTH und LIZ und die vorgeschlagenen Testkonzentrationen entsprechen Ergebnissen aus der Literatur, die mit ähnlichen Methoden erhoben wurden.
Zweitens wurden mit dem BacT/Alert 3D-System Untersuchungen zur Kombinationstestung von Antituberkulotika bei Mtb und Stämmen des MAC-Komplexes durchgeführt, bisher liegen keine Publikationen für Untersuchungen von Wirkstoff-Kombinationen bei Mykobakterien mit diesem System vor. Es wurde geprüft, ob die MHK eines Antituberkulotikums durch die Zugabe einer subinhibitorischen Menge eines anderen Antituberkulotikums verändert wird. Bei Mtb wurden dazu folgende Kombinationen geprüft: Rifampicin (RMP) + LIZ, Moxifloxacin + LIZ, Isoniazid + PTH, RMP + PTH, PTH + LIZ. In keinem Fall konnten signifikante Effekte beobachtet werden. Ein tendenziell synergistischer Effekt der PTH-RMP-Kombination beim Stamm Mtb H37Rv (Reduktion der RMP-MHK um eine Stufe) wurde durch die Analyse der Wachstumskinetik des Stammes unterstützt. Bei zufällig ausgewählten Stämmen des MAC-Komplexes wurde die Kombination Ciprofloxacin (CIP) + Ethambutol (EMB) geprüft. Es zeigte sich bei sieben von zehn Stämmen eine Reduzierung der CIP-MHK um mindestens drei Stufen bei Zugabe einer subinhibitorischen Konzentration von EMB. Dieser synergistische Effekt wurde bereits in den 1990er Jahren mit einer ähnlichen Methode festgestellt, allerdings ohne die Stämme des MAC-Komplexes zu differenzieren (Arbeitsgruppe von S. Hoffner). Interessanterweise handelte es sich bei den von uns untersuchten Stämmen, bei denen dieser synergistische Effekt nachgewiesen wurde, um M. avium-Stämme. Diese Problematik sollte weiter verfolgt werden, da sich daraus Konsequenzen für die Therapieempfehlung ergeben könnten.
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Art- och genusbestämning av bakterier direkt från blododlingar med MALDI-TOF MSElvingson, Ebba January 2014 (has links)
Sepsis är ett allvarligt tillstånd som uppstår när bakterier går från vävnad till blodbanan. Positiva blododlingar odlas på agarplattor och bakterier analyseras med Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-flight Mass spectrometry (MALDI-TOF MS) där prov blandas med en matrix och sedan bestrålas med laser. Proteinerna i provet joniseras och rör sig mot en detektor, vilket ger ett m/z-spektrum som jämförs med referensspektrum i en databas och ett score-värde erhålls över hur väl analyten liknar referensen. Arbetets syfte var att undersöka möjligheten att direktidentifiera bakterier från blod med en viss preparation innan analys med MALDI-TOF MS och på så vis möjliggöra snabbare preliminära svar samt undersöka möjligheten att särskilja Staphylocoocus aureus och koagulasnegativa stafylokocker. Innan analys med MALDI-TOF MS centrifugerades blod från positiva blododlingar blod i flera steg med 5 % natriumkloridlösning (NaCl-metoden). Dessutom testades ett kommersiellt kit (Sepsityper, Bruker Daltonics). Med NaCl-metoden sågs korrekt identifiering hos 66 % av inokulerade proverna. Av blododlingar innehållande med S. aureus respektive koagulasnegativa stafylokocker identifierades 60 % respektive 43 % av bakterierna korrekt. Med Sepsiptyper erhöll 58 % av proverna godkänt score-värde. Slutsatsen blev att det är möjligt att identifiera bakterier direkt från blod efter viss preparation, men metoden bör utvecklas mer då det fanns en signifikant skillnad i score mellan NaCl-metoden och nuvarande metod. Det är dock möjligt att skilja mellan Staphylococcus aureus och koagulasnegativa stafylokocker. Fler studier är nödvändiga för att avgöra möjligheten att föra in någon av metoderna i rutindiagnostiken.
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Re-Evaluierung, methodische Optimierung und weitergehende Charakterisierung der Empfindlichkeitstestung von Mycobacterium tuberculosis mit dem BacT/Alert 3D (bioMérieux)Knigge, Anna Sophie 12 March 2014 (has links)
Es erfolgte die Re-Evaluierung der Empfindlichkeitstestung von Tuberkuloseerregern mit dem BacT/Alert-3D-System (bioMérieux) unter besonderer Berücksichtigung des Materialwechsels der Kulturflasche von Glas auf Plastik. Dazu wurden insgesamt 61 vergleichende MHK-Bestimmungen mit diesen beiden Flaschentypen durchgeführt, wobei sechs Antituberkulotika (INH, RMP, EMB, SM, PTH und MOX) sowie zwölf Mykobakterienstämme (davon neun Mtb.) untersucht wurden. Dabei findet sich kein Unterschied in den MHK-Werten zwischen Glas- und Plastikflaschen. Die Plastikflaschen sind folglich ebenso wie die Glasflaschen zur Empfindlichkeitstestung von Tuberkuloseerregern mit dem BacT/Alert-3D-System geeignet. Bei der bisherigen Methode wurde bei der PZA-Testung auf die Verwendung der Kontrollflasche zur Festlegung der Untersuchungszeit verzichtet, weil der erniedrigte pH-Wert ein unverhältnismäßig langsames oder gar fehlendes Wachstum in dieser Flasche bewirkt. Durch Optimierung von pH-Wert (pH 5,9) und PZA-Testkonzentration (200 mg/l) wurde erreicht, dass die PZA-Testung nach der gleichen Methode wie auch bei den anderen Antituberkulotika praktiziert, durchgeführt werden kann. Im weiteren wurde untersucht, wie hoch der Anteil resistenter Mutanten in Mischkulturen sein muss, um erkannt zu werden. Dazu wurden dem sensiblen Stamm H37Rv jeweils isogene Mutanten mit Monoresistenzen gegen INH, RMP oder SM bzw. EMB- und PZA-resistente Stämme in verschiedenen Anteilen zugesetzt. Es zeigte sich, dass ein Anteil von 1% resistenter Stämme noch nicht sicher detektiert wird. / The purpose of this paper is to optimize and reevaluate the methods of susceptibility testing of M.tuberculosis with the BacT/Alert 3D System (bioMérieux). The key aspect was the comparison between culture bottles from glass between those made out of plastic material. Therefore 61 comparative MIC-tests were carried out, with six antituberculous drugs (INH, RMP; EMB, SM, PTH and MOX) and twelve mycobacterial strains (nine Mtb.) in order to compare the MIC in the two different bottle types. The MIC of 40 comparative tests between plastic culture bottles were identical to those in glass material. Only 18 test results deviated between the two bottle types. In each of those tests the discrepancy was only one degree of dilution, which is considered as not relevant. Resistant strains were found in three tests, with no difference between glass and plastic bottles. The deviant twelve results of Mtb. strains show a six times higher MIC-value in plastic bottles and a six times lower MIC in plastic bottles. In the case of the substance INH all four discrepant results had a higher MIC in the plastic bottle. Since these results were known by the Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie of the University Leipzig, it was consequently used with good results in the laboratory routine, as well as in external quality control (INSTAND-Ringversuche 2009 to 2011).
The second topic of this study was to optimize the current method of susceptibility testing of Mtb. concerning pyrazinamide (PZA). In the current method the low pH of the dilution (5.5) with the resulting weak growth of the strains forced the laboratory assistant to abandon the 1% control bottle as endpoint of measurement. The new and optimized pH of 5.9 and a concentration of PZA of 200 mg/l allows the susceptibility testing of PZA with the same method as practiced for the other antituberculous drugs.
Yet another focus of this study was the sensitivity of the BacT/Alert 3D System to detect heteroresistant clones in the mycobacterial broth. Resistant clones and fully susceptible Mtb. strain (H37Rv) were mixed in different percentages and susceptibility testing was performed. It could be shown, that a secure detection of resistant clones is not possible at a percentage 1% of resistant clones in the culture.
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