Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Eduardo Cleto Pires / Banca: Celso Omoto / Resumo: A bactéria Bacillus thuringiensis é conhecida como uma das melhores opções no controle biológico de pragas devido à ação entomopatogênica e especificidade de suas proteínas. As proteínas Vip3, que são secretadas durante o crescimento vegetativo de B. thuringiensis e Cry1, que são produzidas durante a fase de esporulação, atuam no controle de importantes pragas de lepidópteros. Um dos principais riscos ambientais associados à utilização de inseticidas é o potencial para o desenvolvimento de graus crescentes de resistência pelas pragas alvo. O uso de diferentes proteínas entomopatogênica produzidos por B. thuringiensis, bem como os estudos que envolvem suas interações podem ajudar a superar o desenvolvimento de pragas resistentes. As proteínas utilizadas neste estudo foram preparadas a partir de estirpes recombinantes de Escherichia coli que expressam uma única toxina. Para a expressão das proteínas Cry1 células recombinantes foram inoculadas em meio TB com ampicilina e incubadas por 60 h a 28 oC. Enquanto que para a expressão de Vip3Aa o inóculo foi feito em meio LB (2x) e ampicilina, e induzidas com IPTG durante a incubação por 12 h sob agitação de 190 rpm, mantidas a 37 oC. As proteínas foram ativadas utilizando 10% de tripsina comercial, e visualizadas em gel SDS-PAGE 12%. Os bioensaios foram realizados com dieta artificial semissólidas artificial adicionadas em bandejas de poliestireno de 128 poços de 1 cm de diâmetro. Cinquenta microlitros das toxinas ativadas foram espalhados sobre a superfície da dieta artificial e para cada concentração de proteína foram reproduzidos 4 repetições. Dezesseis lagartas no primeiro instar de Spodoptera frugiperda foram utilizadas para a adição de um total de 64 larvas para cada concentração de proteína... / Abstract: Bacillus thuringiensis is kwon as one of the best options for biological control of pests due to the entomophotogenic and specific action of some of its proteins. The Vip3 proteins, that are secreted during the vegetative growth of B. thuringiensis and Cry1, which are produced during the sporulation phase, act controlling important lepidopteran pests. One of the most important environmental risks associated to the use of insecticides is the potential for the development of increasing degrees of resistance by the target pests. The use of different entomopathogenic proteins produced by B. thuringiensis, as well as the studies involving their interactions might help overcoming the development of resistant pests. The proteins used in this study were prepared from recombinant Escherichia coli strains expressing a sole toxin. For the expression of the Cry1 proteins, the recombinant cells were inoculated in TB broth containing ampicillin and incubated at 28ºC during 60 h. While for the expression of the Vip3Aa protein the culture was made using LB 2X broth also containing ampicillin and induced with IPTG during incubation for 12 h at 190 rpm kept at 37ºC. The proteins were activated using 10% commercial trypsin, and observed on 12% SDS-PAGE gels. The bioassays were carried out using artificial semi-solid diet added to polystyrene trays with 128 wells measuring 1 cm of diameter. Fifty microliters of activated toxins were spread over the surface of the artificial diet contained wells and for each protein concentration, four repetitions were reproduced. Sixteen Spodoptera frugiperda first instar larvae were used adding to a total of 64 larvae for each protein concentration... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-29Bitstream added on 2014-06-13T20:11:55Z : No. of bitstreams: 1 000737270.pdf: 1006873 bytes, checksum: ca3c40d5b7f6e5b3f636fbe27cab0376 (MD5) / A bactéria Bacillus thuringiensis é conhecida como uma das melhores opções no controle biológico de pragas devido à ação entomopatogênica e especificidade de suas proteínas. As proteínas Vip3, que são secretadas durante o crescimento vegetativo de B. thuringiensis e Cry1, que são produzidas durante a fase de esporulação, atuam no controle de importantes pragas de lepidópteros. Um dos principais riscos ambientais associados à utilização de inseticidas é o potencial para o desenvolvimento de graus crescentes de resistência pelas pragas alvo. O uso de diferentes proteínas entomopatogênica produzidos por B. thuringiensis, bem como os estudos que envolvem suas interações podem ajudar a superar o desenvolvimento de pragas resistentes. As proteínas utilizadas neste estudo foram preparadas a partir de estirpes recombinantes de Escherichia coli que expressam uma única toxina. Para a expressão das proteínas Cry1 células recombinantes foram inoculadas em meio TB com ampicilina e incubadas por 60 h a 28 oC. Enquanto que para a expressão de Vip3Aa o inóculo foi feito em meio LB (2x) e ampicilina, e induzidas com IPTG durante a incubação por 12 h sob agitação de 190 rpm, mantidas a 37 oC. As proteínas foram ativadas utilizando 10% de tripsina comercial, e visualizadas em gel SDS-PAGE 12%. Os bioensaios foram realizados com dieta artificial semissólidas artificial adicionadas em bandejas de poliestireno de 128 poços de 1 cm de diâmetro. Cinquenta microlitros das toxinas ativadas foram espalhados sobre a superfície da dieta artificial e para cada concentração de proteína foram reproduzidos 4 repetições. Dezesseis lagartas no primeiro instar de Spodoptera frugiperda foram utilizadas para a adição de um total de 64 larvas para cada concentração de proteína... / Bacillus thuringiensis is kwon as one of the best options for biological control of pests due to the entomophotogenic and specific action of some of its proteins. The Vip3 proteins, that are secreted during the vegetative growth of B. thuringiensis and Cry1, which are produced during the sporulation phase, act controlling important lepidopteran pests. One of the most important environmental risks associated to the use of insecticides is the potential for the development of increasing degrees of resistance by the target pests. The use of different entomopathogenic proteins produced by B. thuringiensis, as well as the studies involving their interactions might help overcoming the development of resistant pests. The proteins used in this study were prepared from recombinant Escherichia coli strains expressing a sole toxin. For the expression of the Cry1 proteins, the recombinant cells were inoculated in TB broth containing ampicillin and incubated at 28ºC during 60 h. While for the expression of the Vip3Aa protein the culture was made using LB 2X broth also containing ampicillin and induced with IPTG during incubation for 12 h at 190 rpm kept at 37ºC. The proteins were activated using 10% commercial trypsin, and observed on 12% SDS-PAGE gels. The bioassays were carried out using artificial semi-solid diet added to polystyrene trays with 128 wells measuring 1 cm of diameter. Fifty microliters of activated toxins were spread over the surface of the artificial diet contained wells and for each protein concentration, four repetitions were reproduced. Sixteen Spodoptera frugiperda first instar larvae were used adding to a total of 64 larvae for each protein concentration...

Orientador: Janete Apparecida Desidério / Banca: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Janaína Fernandes Gonçalves / Resumo: A bactéria Bacillus thuringiensis é vista como uma das melhores opções no controle biológico devido à ação entomopatogênica e a especificidade de suas proteínas. As proteínas Vip3, que são secretadas durante o crescimento vegetativo do B. thuringiensis, atuam no controle de importantes lepidópteros praga. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um gene vip3A de um isolado de B. thuringiensis, expressar a proteína e verificar sua toxicidade contra larvas de Anticarsia gemmatalis e. Spodoptera frugiperda Para tanto, o gene foi amplificado com iniciadores específicos por PCR, gerando um fragmento de 2370 pb. O fragmento foi clonado em vetor pGEM - T Easy para sequenciamento, subclonado em vetor de expressão pET-28a (+) e o conjunto inserido em células de Escherichia coli BL21 (DE3). A expressão da proteína foi induzida por IPTG, a proteína Vip3Aa50 foi visualizada em SDS-PAGE e detectada por "Western blotting". Os ensaios de toxicidade revelaram alta virulência às larvas neonatas de A. gemmatalis e S. frugiperda, sendo as larvas da população de A. gemmatalis mais sensíveis. O isolado utilizado neste estudo é altamente promissor como fonte de gene vip3A para controle de ambas as pragas por meio da produção de plantas transgênicas como milho e soja. / Abstract: The bacterium Bacillus thuringiensis is seen as one the best options for the biological control due to entomopathogenic action and protein specificity. The Vip3 proteins, which are secreted during the vegetative growth of B. thuringiensis, act to the control the most important lepidopteran pests. The aim of this study was to characterize a vip3A gene from an isolate of B. thuringiensis, to induce the protein and evalute its toxicity against Anticarsia gemmatalis and Spodoptera frugiperda larvae. Therefore, the gene was amplified by specific PCR's primers, generating a 2370 pb fragment. The fragment was cloned into the pGEM-T Easy vector and subsequently, it was sequenced and subcloned into the pET-28a (+)'s expression vector and inserted in to the Escherichia coli BL21 (DE3) cells. The Vip3Aa50 protein expression was induced by IPTG, observed using SDS-PAGE and detected by Western blotting. The toxicity bioassay showed intense virulence for A. gemmatalis and S. frugiperda's neonate larvae. The results showed that A. gemmatalis larval population was more sensitive. The isolate used in this study is highly promising as vip3A source gene to control both plagues through transgenic plant production, such as, corn and soybean. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-18Bitstream added on 2014-06-13T20:52:57Z : No. of bitstreams: 1 laurentis_vl_me_jabo.pdf: 513772 bytes, checksum: 73a372dc0e5a8eefae0dce1ee2a31a2d (MD5) / O objetivo deste estudo foi verificar, por meio de métodos moleculares, possíveis diferenças entre populações de Plutella xylostella (PX, PA, PC e PJ) de três estados brasileiros produtores de brassicáceas e avaliar a suscetibilidade e os efeitos subletais nestas populações à bioinseticidas e isolados de Bacillus thuringiensis. Foram utilizados os métodos de sequenciamento do gene COI e ISSR-PCR para analisar a estrutura genética das populações. Para avaliar a suscetibilidade e os efeitos subletais foram pulverizados em discos foliares de couve de 8 cm de diâmetro os isolados 153.30A, 49.19A, T08.024, E7, E28, E47, 41.7L, 20.7L, HD-1 e Bt tenebrionis e os produtos Btt090®, Dipel®, Agree® e Xentari®. Após a secagem, os discos foliares foram oferecidos para alimentação de lagartas de segundo ínstar de P. xylostella de cada população, em placas de Petri. As pupas foram individualizadas em placas com poços tipo Elisa® até a emergência dos adultos. Os adultos foram separados em casais e transferidos para gaiolas para oviposição. Os insetos foram observados até a morte dos adultos, sendo avaliado: viabilidade e duração larval e pupal, consumo foliar, peso das pupas, razão sexual, longevidade, número de ovos/fêmea/dia, período de incubação e viabilidade dos ovos. Os produtos/isolados que causaram mortalidade superior a 80% foram utilizados para estimar os valores de CL50. As populações apresentaram diferenças nas estruturas genéticas, sendo PJ a mais diferente. Os produtos Agree®, Dipel® e Xentari® e os isolados 49.19A, E47 e HD1 causaram 100% de mortalidade para todas as populações. De modo geral, Dipel® e HD1 foram mais tóxicos dentre os produtos e isolados, respectivamente, devido às menores CL50. Os isolados T08.024 e E28 foram os que mais afetaram negativamente as características biológicas da... / The aim of this study was to detect possible differences among populations of Plutella xylostella (PX, PA, PC and PJ), from three Brazilian states that produce brassicaceas, and to evaluate the susceptibility and sublethal effects of these populations to Bacillus thuringiensis bioinsecticides and strains. We used the methods of COI gene sequencing and ISSR-PCR to analyze the genetic structure of the populations. To evaluate the susceptibility and sublethal effects, isolates 153.30A, 49.19A, T08.024, E7, E28, E47, 41.7L, 20.7L, HD-1 and Bt tenebrionis and products Btt090®, Dipel®, Agree® and Xentari® were sprayed on 8-cm-diameter kale leaf discs. After drying, the leaf disks were offered to fed second instar caterpillars of P. xylostella from each population, in Petri dishes. The pupae were placed in separated wells plates with Elisa ® until adult emergence. The adults were separated into couples and transferred to cages for oviposition. We observed the insects until the adults death, evaluating: larval and pupal viability and period, leaf consumption, pupal weight, sex ratio, longevity, number of eggs/female/day, incubation period and egg viability. Products/strains that caused mortality exceeding 80% were used to estimate the values of LC50. The populations showed differences in genetic structures, being PJ the most different one. Agree®, Dipel®, Xentari®, and the isolates 49.19A, E47 and HD1 caused 100% mortality for all populations. Generally, HD1 and Dipel® were the most toxic among products and strains, due to lower LC50. The isolates T08.024 and E28 were the ones that most affected negatively the biological characteristics of the pest, despite they didn’t cause 100% of mortality... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-25Bitstream added on 2014-06-13T18:29:31Z : No. of bitstreams: 1 figueiredo_cs_me_jabo_parcial.pdf: 433594 bytes, checksum: 5db23a3d4c3ab1bce497f29f193cd674 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-25T13:00:47Z: figueiredo_cs_me_jabo_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-25T13:03:13Z : No. of bitstreams: 1 000718405_20160225.pdf: 327253 bytes, checksum: 949c202d3f1b517f66218611f9a1bd5a (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-26T14:03:56Z: 000718405_20160225.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-26T14:04:50Z : No. of bitstreams: 1 000718405.pdf: 781931 bytes, checksum: cd606945171aa0e2251919afe0b3aec7 (MD5) / A bactéria Bacillus thuringiensis é vista como uma das melhores opções no controle biológico devido à ação entomopatogênica e a especificidade de suas proteínas. As proteínas Vip3, que são secretadas durante o crescimento vegetativo do B. thuringiensis, atuam no controle de importantes lepidópteros praga. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um gene vip3A de um isolado de B. thuringiensis, expressar a proteína e verificar sua toxicidade contra larvas de Anticarsia gemmatalis e. Spodoptera frugiperda Para tanto, o gene foi amplificado com iniciadores específicos por PCR, gerando um fragmento de 2370 pb. O fragmento foi clonado em vetor pGEM - T Easy para sequenciamento, subclonado em vetor de expressão pET-28a (+) e o conjunto inserido em células de Escherichia coli BL21 (DE3). A expressão da proteína foi induzida por IPTG, a proteína Vip3Aa50 foi visualizada em SDS-PAGE e detectada por “Western blotting”. Os ensaios de toxicidade revelaram alta virulência às larvas neonatas de A. gemmatalis e S. frugiperda, sendo as larvas da população de A. gemmatalis mais sensíveis. O isolado utilizado neste estudo é altamente promissor como fonte de gene vip3A para controle de ambas as pragas por meio da produção de plantas transgênicas como milho e soja. / The bacterium Bacillus thuringiensis is seen as one the best options for the biological control due to entomopathogenic action and protein specificity. The Vip3 proteins, which are secreted during the vegetative growth of B. thuringiensis, act to the control the most important lepidopteran pests. The aim of this study was to characterize a vip3A gene from an isolate of B. thuringiensis, to induce the protein and evalute its toxicity against Anticarsia gemmatalis and Spodoptera frugiperda larvae. Therefore, the gene was amplified by specific PCR’s primers, generating a 2370 pb fragment. The fragment was cloned into the pGEM-T Easy vector and subsequently, it was sequenced and subcloned into the pET-28a (+)’s expression vector and inserted in to the Escherichia coli BL21 (DE3) cells. The Vip3Aa50 protein expression was induced by IPTG, observed using SDS-PAGE and detected by Western blotting. The toxicity bioassay showed intense virulence for A. gemmatalis and S. frugiperda’s neonate larvae. The results showed that A. gemmatalis larval population was more sensitive. The isolate used in this study is highly promising as vip3A source gene to control both plagues through transgenic plant production, such as, corn and soybean.

Orientador: Sergio Antonio De Bortoli / Coorientador: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Alessandra Marieli Vacari / Banca: Fernando Hercos Valicente / Resumo: O objetivo deste estudo foi verificar, por meio de métodos moleculares, possíveis diferenças entre populações de Plutella xylostella (PX, PA, PC e PJ) de três estados brasileiros produtores de brassicáceas e avaliar a suscetibilidade e os efeitos subletais nestas populações à bioinseticidas e isolados de Bacillus thuringiensis. Foram utilizados os métodos de sequenciamento do gene COI e ISSR-PCR para analisar a estrutura genética das populações. Para avaliar a suscetibilidade e os efeitos subletais foram pulverizados em discos foliares de couve de 8 cm de diâmetro os isolados 153.30A, 49.19A, T08.024, E7, E28, E47, 41.7L, 20.7L, HD-1 e Bt tenebrionis e os produtos Btt090®, Dipel®, Agree® e Xentari®. Após a secagem, os discos foliares foram oferecidos para alimentação de lagartas de segundo ínstar de P. xylostella de cada população, em placas de Petri. As pupas foram individualizadas em placas com poços tipo Elisa® até a emergência dos adultos. Os adultos foram separados em casais e transferidos para gaiolas para oviposição. Os insetos foram observados até a morte dos adultos, sendo avaliado: viabilidade e duração larval e pupal, consumo foliar, peso das pupas, razão sexual, longevidade, número de ovos/fêmea/dia, período de incubação e viabilidade dos ovos. Os produtos/isolados que causaram mortalidade superior a 80% foram utilizados para estimar os valores de CL50. As populações apresentaram diferenças nas estruturas genéticas, sendo PJ a mais diferente. Os produtos Agree®, Dipel® e Xentari® e os isolados 49.19A, E47 e HD1 causaram 100% de mortalidade para todas as populações. De modo geral, Dipel® e HD1 foram mais tóxicos dentre os produtos e isolados, respectivamente, devido às menores CL50. Os isolados T08.024 e E28 foram os que mais afetaram negativamente as características biológicas da...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to detect possible differences among populations of Plutella xylostella (PX, PA, PC and PJ), from three Brazilian states that produce brassicaceas, and to evaluate the susceptibility and sublethal effects of these populations to Bacillus thuringiensis bioinsecticides and strains. We used the methods of COI gene sequencing and ISSR-PCR to analyze the genetic structure of the populations. To evaluate the susceptibility and sublethal effects, isolates 153.30A, 49.19A, T08.024, E7, E28, E47, 41.7L, 20.7L, HD-1 and Bt tenebrionis and products Btt090®, Dipel®, Agree® and Xentari® were sprayed on 8-cm-diameter kale leaf discs. After drying, the leaf disks were offered to fed second instar caterpillars of P. xylostella from each population, in Petri dishes. The pupae were placed in separated wells plates with Elisa ® until adult emergence. The adults were separated into couples and transferred to cages for oviposition. We observed the insects until the adults death, evaluating: larval and pupal viability and period, leaf consumption, pupal weight, sex ratio, longevity, number of eggs/female/day, incubation period and egg viability. Products/strains that caused mortality exceeding 80% were used to estimate the values of LC50. The populations showed differences in genetic structures, being PJ the most different one. Agree®, Dipel®, Xentari®, and the isolates 49.19A, E47 and HD1 caused 100% mortality for all populations. Generally, HD1 and Dipel® were the most toxic among products and strains, due to lower LC50. The isolates T08.024 and E28 were the ones that most affected negatively the biological characteristics of the pest, despite they didn't cause 100% of mortality... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Natalia de Souza Gonçalves (natalia.goncalves@ufpe.br) on 2016-09-23T13:38:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese - Paulo Geovani Silva Martins - 2016.pdf: 11199647 bytes, checksum: e9d2a3a59d3656debcafdd36c106889f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-23T13:38:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese - Paulo Geovani Silva Martins - 2016.pdf: 11199647 bytes, checksum: e9d2a3a59d3656debcafdd36c106889f (MD5) Previous issue date: 2016-03-11 / CAPES / A cultura da cana-de-açúcar possui importância econômica para o Brasil pela produção de açúcar e etanol. No entanto, parte da produção é ameaçada pelo ataque de insetos-praga, destacando-se a broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis), que causa graves perdas econômicas. O controle biológico é alternativo ao controle químico e consiste no emprego de inimigos naturais como patógenos, que regulam a população de insetos-praga em níveis nãoprejudiciais. Dentre os patógenos destaca-se a bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) que produz toxinas, codificadas pelos genes cry, no formato de cristais proteicos com atividade entomotóxica para diversas ordens de insetos. O presente trabalho teve como objetivo o isolamento e caracterização de novas estirpes de Bt com potencial entomotóxico para controle biológico da D. saccharalis em cana-de-açúcar. Amostras de solo coletadas possibilitaram o isolamento de 97 colônias bacterianas com características fenotípicas compatíveis para Bt. O DNA extraído foi amplificado com primers para os genes cry1, cry2 e cry9, ativos contra dípteros e lepidópteros. Em 11,4% e 12,4% dos isolados foram constatados os genes cry2 e cry9, respectivamente, e 10 destes patogenicidade variando entre 3,47% a 20,05% para D.saccharalis. Após comparação dos perfis proteômicos dos isolados Bt.Pri 4.7, Bt.Pri 4.29, Bt.CDi 1.3 e Bt.CDi 1.11, de maior e menor potencial patogênico de cada classe gênica, foram identificadas proteínas como a shikimato quinase, envolvida na produção de toxinas em Bt, e que auxiliam o entendimento da patogênese deste microorganismo. / Sugarcane production has economical importance to Brazil, especially due to production of sugar and ethanol. However, a proportion of the production is lost owing to damage of pest insects, including sugarcane borer (Diatraea saccharalis), which cause severe economical lost in the sugar/ethanol industry. Biological control, alternatively to chemical control, which cause damage to human health and environment, is based on use of natural enemies such as pathogens that regulated pest insects population to a non-prejudicial level. Among pathogens, especially bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) that produce toxins, encoding by cry genes, which are protein crystal with entomotoxicity activity for diverse insect orders. The present work aims to isolate and characterize new strains of Bt with potential entomotoxicity to biological control of D. saccharalis in sugarcane. Soil samples collected allowed the isolation of 97 bacterial colonies phenotypically compatible to Bt. DNA extracted was used in PCR reaction using primers to amplify cry1, cry2 and cry9 genes, with activity against Lepidoptera and Diptera. In 11.4 and 12.4% of the strains was observed fragments with pattern expected for cry2 and cry9 genes, respectively, and ten isolated shown pathogenicity ranging from 3.47% to 15.62% for D.saccharalis. After comparing the proteomic profiles of the isolates Bt.Pri 4.7 Bt.Pri 4.29, Bt.CDi 1.3 and Bt.CDi 1.11 of major and minor pathogenic potential of every gene class proteins were identified as shikimate kinase, involved in the production of Bt toxins, and assist the understanding of the pathogenesis of this microorganism.