Thesis (M.S.)--West Virginia University, 2004. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains viii, 40 p. : ill. (some col.), map. Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 36-39).

Heidelberg, Universiẗat, Diss., 2002.

As toxinas Cry de Bacillus thuringiensis apresentam atividade inseticida e alto grau de especificidade a certos grupos de insetos, sendo inócuas para vertebrados. Estas características vêm sendo utilizadas no desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas para o controle de pragas. O inseto-praga de maior importância na cotonicultura brasileira é o bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis), inseto de hábitos larvais endofíticos, e, por isso, de difícil controle. O objetivo deste trabalho foi identificar os prováveis receptores deste inseto para toxinas Cry. O gene para a toxina Cry8Ka1 foi clonado e um mutante com alta toxicidade foi obtido pelas técnicas de DNA Shuffling e Phage Display. Este mutante, Cry8Ka5, foi utilizado para identificação dos receptores. Experimentos de ligação realizados após SDS-PAGE indicam que as toxinas Cry1Ac, Cry8Ka1 e Cry8Ka5 marcadas com biotina são capazes de ligação às mesmas proteínas presentes no epitélio intestinal do inseto. Destas, uma HSP70 cognate e uma V-ATPase, foram identificadas via seqüenciamento de novo, enquanto um ligante de ~120kDa não pôde ser identificado. Cinco spots capazes de reconhecimento pela Cry8Ka5 foram identificados em 2DE, demonstrando capacidade de ligação a diferentes isoformas ou a proteínas apresentando modificações pós-translacionais. Como Cry1Ac não é tóxica para A. grandis e é capaz de ligação às mesmas proteínas, um bioensaio foi conduzido com o objetivo de validar o papel funcional dos ligantes. Foram feitos quatro tratamentos: 1) Controle negativo (H2O); 2) Cry1Ac; 3) Cry8Ka5; 4) Cry8Ka5+Cry1Ac. Apenas o tratamento 3 diferiu estatisticamente dos demais, indicando que a ligação de Cry1Ac a estas proteínas bloqueia o mecanismo de ação de Cry8Ka5. / The Cry toxins from Bacillus thuringiensis display insecticidal activity and are highly specific to certain groups of insects, being harmless to vertebrates. These characteristics have been used to the development of genetically modified plants to control economically important insect-pests. The insect pest of major importance in the Brazilian cotton culture is the cotton boll weevil (Anthonomus grandis), insect of endophytic larval habits, and therefore difficult to control. The aim of this work was to identify putative receptors of this insect to Cry toxins. A gene for Cry8Ka1 toxin was cloned and a mutant with high toxicity against A. grandis was obtained by DNA Shuffling and Phage Display techniques. This mutant, called Cry8Ka5, was used to identify the receptors. Ligand blot experiments performed after SDS-PAGE indicated that biotin-labeled Cry1Ac toxin (not toxic to A. grandis), Cry8Ka5 and Cry8Ka1 are able to recognize the same proteins from the midgut of A. grandis. Two of them, a HSP70 cognate and a V-ATPase were identified by de novo sequencing, whereas a ~120kDa protein was not identified. The characterization of these proteins via two-dimensional gel electrophoresis revealed the presence of five spots capable of binding to Cry8Ka5, demonstrating its ability to recognize different isoforms or showing post-translational modifications. As Cry1Ac is not toxic to A. grandis and is able to bind to the same proteins, a bioassay was conducted to evaluate the functional role of the ligands. Four treatments were conducted: 1) negative control (H2O); 2) Cry1Ac, 3) Cry8Ka5 4) Cry8Ka5 + Cry1Ac. Only treatment 3 presented statistical difference, indicating that the Cry1Ac binding to these proteins blocks Cry8Ka5 mechanism of action.

As toxinas Cry de Bacillus thuringiensis apresentam atividade inseticida e alto grau de especificidade a certos grupos de insetos, sendo inócuas para vertebrados. Estas características vêm sendo utilizadas no desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas para o controle de pragas. O inseto-praga de maior importância na cotonicultura brasileira é o bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis), inseto de hábitos larvais endofíticos, e, por isso, de difícil controle. O objetivo deste trabalho foi identificar os prováveis receptores deste inseto para toxinas Cry. O gene para a toxina Cry8Ka1 foi clonado e um mutante com alta toxicidade foi obtido pelas técnicas de DNA Shuffling e Phage Display. Este mutante, Cry8Ka5, foi utilizado para identificação dos receptores. Experimentos de ligação realizados após SDS-PAGE indicam que as toxinas Cry1Ac, Cry8Ka1 e Cry8Ka5 marcadas com biotina são capazes de ligação às mesmas proteínas presentes no epitélio intestinal do inseto. Destas, uma HSP70 cognate e uma V-ATPase, foram identificadas via seqüenciamento de novo, enquanto um ligante de ~120kDa não pôde ser identificado. Cinco spots capazes de reconhecimento pela Cry8Ka5 foram identificados em 2DE, demonstrando capacidade de ligação a diferentes isoformas ou a proteínas apresentando modificações pós-translacionais. Como Cry1Ac não é tóxica para A. grandis e é capaz de ligação às mesmas proteínas, um bioensaio foi conduzido com o objetivo de validar o papel funcional dos ligantes. Foram feitos quatro tratamentos: 1) Controle negativo (H2O); 2) Cry1Ac; 3) Cry8Ka5; 4) Cry8Ka5+Cry1Ac. Apenas o tratamento 3 diferiu estatisticamente dos demais, indicando que a ligação de Cry1Ac a estas proteínas bloqueia o mecanismo de ação de Cry8Ka5. / The Cry toxins from Bacillus thuringiensis display insecticidal activity and are highly specific to certain groups of insects, being harmless to vertebrates. These characteristics have been used to the development of genetically modified plants to control economically important insect-pests. The insect pest of major importance in the Brazilian cotton culture is the cotton boll weevil (Anthonomus grandis), insect of endophytic larval habits, and therefore difficult to control. The aim of this work was to identify putative receptors of this insect to Cry toxins. A gene for Cry8Ka1 toxin was cloned and a mutant with high toxicity against A. grandis was obtained by DNA Shuffling and Phage Display techniques. This mutant, called Cry8Ka5, was used to identify the receptors. Ligand blot experiments performed after SDS-PAGE indicated that biotin-labeled Cry1Ac toxin (not toxic to A. grandis), Cry8Ka5 and Cry8Ka1 are able to recognize the same proteins from the midgut of A. grandis. Two of them, a HSP70 cognate and a V-ATPase were identified by de novo sequencing, whereas a ~120kDa protein was not identified. The characterization of these proteins via two-dimensional gel electrophoresis revealed the presence of five spots capable of binding to Cry8Ka5, demonstrating its ability to recognize different isoforms or showing post-translational modifications. As Cry1Ac is not toxic to A. grandis and is able to bind to the same proteins, a bioassay was conducted to evaluate the functional role of the ligands. Four treatments were conducted: 1) negative control (H2O); 2) Cry1Ac, 3) Cry8Ka5 4) Cry8Ka5 + Cry1Ac. Only treatment 3 presented statistical difference, indicating that the Cry1Ac binding to these proteins blocks Cry8Ka5 mechanism of action.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-07-13T21:03:09Z No. of bitstreams: 1 2012_RobertoFrancoTeixeiraCorrea.pdf: 2720649 bytes, checksum: b945bd8be445442134dfe63f5b6e8f6b (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-16T12:25:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RobertoFrancoTeixeiraCorrea.pdf: 2720649 bytes, checksum: b945bd8be445442134dfe63f5b6e8f6b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T12:25:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RobertoFrancoTeixeiraCorrea.pdf: 2720649 bytes, checksum: b945bd8be445442134dfe63f5b6e8f6b (MD5) / Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva que produz proteínas formadoras de cristal ou δ-endotoxinas que compreendem as toxinas Cry, com atividade inseticida específica, e Cyt, com atividade citolítica inespecífica. Diferentes δ-endotoxinas mostram-se específicas para diferentes insetos-alvos. Esta especificidade deve-se a receptores de membrana distintos nas células do intestino dos insetos e à presença de diferentes proteases próprias dos insetos, necessárias para ativação proteolítica da prótoxina produzida na fase de esporulação do B. thuringiensis. Os genes cry4Aa, cry11A e cyt2Ba foram amplificados por PCR a partir das estirpes de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, S-1989 ou S-1806. Os produtos das PCR foram clonados em um vetor de expressão em B. thuringiensis, pSVP27A. O gene cyt2Ba foi também clonado em vetores de transferência para construção de baculovírus recombinantes para expressão da proteína Cyt2Ba nativa ou fusionada à proteína Poliedrina. Estirpes de B. thuringiensis acristalíferas foram usadas para expressão individual das proteínas. Após purificação e solubilização das proteínas heterólogas, as memsmas foram ativadas com tripsina ou suco gástrico de Spodoptera frugiperda, para a realização de ensaios de atividade em culturas de células de Lepidoptera, Diptera e mamífero. Foram usados, nos ensaios de citotoxicidade, 20 μg/mL de cada toxina Cry individual ou em combinações e 20 μg/mL ou 5 μg/mL da toxina Cyt2Ba. Atividades tóxicas das toxinas heterólogas ativadas por tripsina foram detectadas para todas as linhagens de células de insetos testadas, fato que não ocorreu após ativação das mesmas toxinas com suco gástrico de S. frugiperda. Para células humanas, apenas Cyt2Ba mostrou-se tóxica. Entretanto, a combinação entre Cyt2Ba e as toxinas Cry4Aa e Cry11A apresentou citotóxicidade maior que Cyt2Ba isoladamente, o que pode sugerir que Cyt2Ba funcione como receptor para Cry4Aa e Cry11A em células humanas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bacillus thuringiensis is a Gram-positive bacterium that produces crystal forming proteins, δ-endotoxins, which consist of Cry toxins harboring specific insecticidal activity, and Cyt toxins that contain non-specific cytolytic activity. Different δ-endotoxins are specific to different target insects. This specificity is due to distinct membrane receptors on the surface of the insect´s midgut cells and to the presence of different host´s proteases, which are necessary to proteolytic activation of the protoxin expressed during B. thuringiensis sporulation phase. The cry4Aa, Cry11A and cyt2Ba genes were amplified from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Brazilian strains, S-1989 or S-1806 by PCR. The PCR products were cloned into the B. thuringiensis expression vector, pSVP27A. The cyt2Ba gene was also cloned into transfer vectors to allow construction of recombinant baculoviruses, in order to express the native Cyt2Ba protein, or Cyt2Ba fusioned to the Polyhedrin protein. Acrystaliferous B. thuringiensis strains were used for the expression of the proteins individually. After purification and solubilization of the heterologous proteins, toxin activation by either trypsin or Spodoptera frugiperda´s gastric juice was carried out to perform citotoxicity assays using Lepidopteran, Dipteran and human cultured cells. Each Cry toxin was used at the concentration of 20 μg/mL, while Cyt2Ba was used at two different concentrations: 20 μg/mL or 5 μg/mL. Cytotoxic activities of the trypsin activated heterologous proteins were detected to all insect cell lines tested, but when the same proteins were digested by S. frugiperda´s gastric juice, no toxic activities were detected. Only Cyt2Ba was shown to be toxic to the human cells tested. Nevertheless, the combination of Cyt2Ba and both Cry4Aa and Cry11A toxins yelded a higher toxicity than that produced by Cyt2Ba isolatedly, which could suggest that Cyt2Ba could be functioning as a receptor for Cry4Aa and Cry11A on the surface of human cells.

As toxinas Cry de Bacillus thuringiensis apresentam atividade inseticida e alto grau de especificidade a certos grupos de insetos, sendo inócuas para vertebrados. Estas características vêm sendo utilizadas no desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas para o controle de pragas. O inseto-praga de maior importância na cotonicultura brasileira é o bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis), inseto de hábitos larvais endofíticos, e, por isso, de difícil controle. O objetivo deste trabalho foi identificar os prováveis receptores deste inseto para toxinas Cry. O gene para a toxina Cry8Ka1 foi clonado e um mutante com alta toxicidade foi obtido pelas técnicas de DNA Shuffling e Phage Display. Este mutante, Cry8Ka5, foi utilizado para identificação dos receptores. Experimentos de ligação realizados após SDS-PAGE indicam que as toxinas Cry1Ac, Cry8Ka1 e Cry8Ka5 marcadas com biotina são capazes de ligação às mesmas proteínas presentes no epitélio intestinal do inseto. Destas, uma HSP70 cognate e uma V-ATPase, foram identificadas via seqüenciamento de novo, enquanto um ligante de ~120kDa não pôde ser identificado. Cinco spots capazes de reconhecimento pela Cry8Ka5 foram identificados em 2DE, demonstrando capacidade de ligação a diferentes isoformas ou a proteínas apresentando modificações pós-translacionais. Como Cry1Ac não é tóxica para A. grandis e é capaz de ligação às mesmas proteínas, um bioensaio foi conduzido com o objetivo de validar o papel funcional dos ligantes. Foram feitos quatro tratamentos: 1) Controle negativo (H2O); 2) Cry1Ac; 3) Cry8Ka5; 4) Cry8Ka5+Cry1Ac. Apenas o tratamento 3 diferiu estatisticamente dos demais, indicando que a ligação de Cry1Ac a estas proteínas bloqueia o mecanismo de ação de Cry8Ka5. / The Cry toxins from Bacillus thuringiensis display insecticidal activity and are highly specific to certain groups of insects, being harmless to vertebrates. These characteristics have been used to the development of genetically modified plants to control economically important insect-pests. The insect pest of major importance in the Brazilian cotton culture is the cotton boll weevil (Anthonomus grandis), insect of endophytic larval habits, and therefore difficult to control. The aim of this work was to identify putative receptors of this insect to Cry toxins. A gene for Cry8Ka1 toxin was cloned and a mutant with high toxicity against A. grandis was obtained by DNA Shuffling and Phage Display techniques. This mutant, called Cry8Ka5, was used to identify the receptors. Ligand blot experiments performed after SDS-PAGE indicated that biotin-labeled Cry1Ac toxin (not toxic to A. grandis), Cry8Ka5 and Cry8Ka1 are able to recognize the same proteins from the midgut of A. grandis. Two of them, a HSP70 cognate and a V-ATPase were identified by de novo sequencing, whereas a ~120kDa protein was not identified. The characterization of these proteins via two-dimensional gel electrophoresis revealed the presence of five spots capable of binding to Cry8Ka5, demonstrating its ability to recognize different isoforms or showing post-translational modifications. As Cry1Ac is not toxic to A. grandis and is able to bind to the same proteins, a bioassay was conducted to evaluate the functional role of the ligands. Four treatments were conducted: 1) negative control (H2O); 2) Cry1Ac, 3) Cry8Ka5 4) Cry8Ka5 + Cry1Ac. Only treatment 3 presented statistical difference, indicating that the Cry1Ac binding to these proteins blocks Cry8Ka5 mechanism of action.

Orientador: Iracema de Oliveira Moraes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-15T14:14:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santana_MariaHelenaAndrade_M.pdf: 1628643 bytes, checksum: 1b1b0ded4dfa983ebc0ce992a4baeeed (MD5) Previous issue date: 1980 / Resumo: Foi estudada a influência da concntração de oxigênio na produção de inseticida bacteriano por fermentação submersa usando Bacillus Thuringiensis. Os ensaios foram realizados em fermentador descontínuo de 20 litros, usando meio de cultura composto de melaço e água de maceração de milho. A concentração de oxigêncio variou de 0,195 a 1,560 mg/l (2,5 a 20% da concentração de saturação) ...Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The effect of Oxygen concentration on the production of bacterial insecticide by submerged fermentation enployng Bacillus Thuringiensis is the subject of this present study. The experimental work was carried out in 20 liters batch fermentator, using a culture medium composed by sugar cane molasses and corn steep liquor as carbon and nitrogen sources. The oxygen concentration varied from 0,195 mg/l to 1,56 mg/l (2,5 to 20% of the saturation) ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Acompanha memorial / Tese (livre docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-17T05:18:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_IracemadeOliveira_LD.pdf: 3907062 bytes, checksum: 71bbcc4d9cfabc470916b89c23f70079 (MD5) Previous issue date: 1981 / Resumo: Com vistas â produção de insecticidas bacteriaos foi estudada a fração solúvel e termo-estável denominada exotoxina, a partir de Bacillus thuringienéis. Foram empregados meios de cultura industriais contendo melaço de cana de açúcar e água de maceração de milho. 0 comportamento da fermentação nas duas escalas estudadas (1 litro e 20 litros) foi similar com relação ao pH, consumo de açúcar e cinética de crescimento, tendo os tempos, para complementar a fase exponencial, se reduzido de 10 horas na escala de 1 litro para 5 horas em 20 litros, ocasionando considerável aumento na produtividade. Foi verificado o efeito da concentração de Oxigênio sobre o crescimento do microrganismo, observando-se a existência de uma faixa ótima no entorno de 10% do valor de saturação, ocasionando o máximo valor da velocidade específica de crescimento µ = 0,62 h-1 em fermentador de 2 0 litros. O acompanhamento da produção de ácido dipicolínico permitiu estabelecer a fase de máxima esporulação do microrganismo. Estudos de concentração, liofilização e secagem bem como de semi purificação e purificação da exotoxina, comprovaram sua termo estabilidade e solubilidade em água. Foram realizados bio ensaios com Dípteros para comprovar o potencial da exotoxina termo-estável, em Ceratitis capitata (mosca de frutas), Drosophila melanogaster, Chrysomya chloropyga, Chrysomya megacephala e Musca domestica. Os resultados encontrados confirmam a viabilidade tecnológica de produção e emprego da exotoxina termo-estável de Bacillus thuringiensis contra Dípteros, cuja maioria constitui praga da Agricultura e da Saúde Pública / Abstract: The soluble and heat stable fraction of Bacillus thuringiensis was studied with the purpose of producing a bacterial insecticide by fermentation. The fermentation course in the two scales investigated (1 L and 20 L) was similar in relation to pH, sugar consumption and kinetics of growth, the times required for the completion of the exponential growth phase being reduced from 10h in the 1 L scale to 5h in the 20 L fermentor thus ensuring a considerable productivity increase. There was verified the effect of oxygen on the microorganisms growth in observing the existence of an optimum range of 10% of the saturation value; the maximum of specific growth rate being 0,62 h-1 in a 20 L fermentor. The study of dipicolinic acid production made possible to estabish the maximum sporulation phase of microorganisms. Investigation on the concentration, freeze drying and drying as well as of semipurification and purification of exotoxin proved its heat stability and solubility in water. There were carried out bioassays with Diptera (Ceratitis capitata, Drosophila melanogaster, Chrysomya chloropyga, Chrysomya megacephala and Musea domestica) to prove the potential of heat stable exotoxin. The results obtained confirmed the technological viability of production and of the use of heat stable exotoxin of Bacillus thuringiensis for combating Diptera, the majority of which is prejudicial to Agriculture and Public Health / Tese (livre docencia) - Univer / Bioengenharia / Livre Docente em Engenharia de Alimentos

Orientador: Iracema de Oliveira Moraes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-20T01:05:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Capalbo_DeiseMariaFontana_M.pdf: 3233361 bytes, checksum: b0ea05440de31a1e03139f590b6297a5 (MD5) Previous issue date: 1982 / Resumo: Das técnicas de fermentação disponíveis para obtenção do inseticida microbiano, a fermentação continua tem sido pouco utilizada, apesar das tantas vantagens que apresenta. Visando estabelecer as melhores condições para obtenção desse tipo de inseticida, a partir de Bacillus thuringiensis, pela técnica de cultura contínua, estudou-se o efeito da taxa de diluição e tempo de residência, sobre a esporulação desse bacilo. Conseguiu-se um aumento na esporulação, com o decréscimo da taxa de diluição; a taxa de diluição mais eficiente esteve entre 0,05 e 0,10 h -1, para as condições estudadas. Verificou-se também que nessas condições, a fermentação contínua é bem sucedida quando efetivada em múltiplos estágios, com o último deles atuando como fermentador descontínuo. / Abstract: The continuous fermentation technique has received little attention for utilization to produce bacterial insecticide by fermentation. Investigations on the dilution rate and residence time was made to establish the maximum growth and sporulation rate of Bacillus thuringiensis in continuous culture.The results obtained confirmed that the sporulation rate increased when the dilution rate decreased; the best range of dilution rate was from 0,05 to 0,10 h -1 , for the operational conditions used. The continuous fermentation of Bacillus thuringiensis here developed, run well when it was done in multiple stages, and the last one run as a descontinuous fermentor. / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

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