Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-16T16:34:25Z No. of bitstreams: 1 2015_JosefaNeianeGoulartBatista.pdf: 1197579 bytes, checksum: 35d111a817d27403622bf10c4e105c6d (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-27T14:29:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_JosefaNeianeGoulartBatista.pdf: 1197579 bytes, checksum: 35d111a817d27403622bf10c4e105c6d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T14:29:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_JosefaNeianeGoulartBatista.pdf: 1197579 bytes, checksum: 35d111a817d27403622bf10c4e105c6d (MD5) / A Murcha Bacteriana (Ralstonia solanacearum) é uma das mais importantes doenças do tomateiro em regiões tropicais. Seu controle é difícil, a principal medida é evitar a entrada da bactéria no local de plantio, principalmente em cultivo protegido. O objetivo deste trabalho foi encontrar isolados de Pseudomonas fluorescentes provenientes da rizosfera de solanáceas do cerrado, para uso no controle biológico de R. solanacearum. Foram realizadas coletas de solo da rizosfera de diversas plantas da família Solanaceae, de onde foram obtidos 40 isolados de Pseudomonas spp. Esses isolados foram submetidos a teste in vitro pela metodologia de prospecção de antibiose pelo teste de dupla camada, onde verificou se que 33 isolados conseguiram inibir o crescimento de R. solanacearum. Os isolados que induziram os maiores diâmetros do halo de inibição, 12 (F 1.5, PEDRA, F 1.2, F 4.1, JOMG 1.1, JBR, T3, RJ 1.1, JOBA, PSD 9, JAL, JCP 8.1) e foram selecionados para os ensaios em casa de vegetação. Os ensaios em casa de vegetação foram divididos em dois, um com uma estirpe de R. solanacearum (UnB 1173), outro com a mistura de três estirpes do patógeno ( UnB, 1033, 1103 e 1173). Cinco isolados (RJ 1.1, F 4.1, JCP 1.1, PEDRA e JOBA) controlaram a doença no ensaio com uma estirpe do patógeno. Oito isolados (RJ 1.1, F 1.2, F 1.5, F 4.1, JCP 8.1, PSD 9, JOBA e JAL) controlaram a doença com a mistura de três estirpes do patógeno. Os isolados RJ 1.1, F 4.1, JAL, JOBA conseguiram controlar a doença nos dois ensaios, demonstrando assim potencial para uso no controle biológico da murcha bacteriana. / The bacterial wilt (Ralstonia solanacearum) is one of the most important tomato diseases in tropical regions. His control is difficult, the key measure is to prevent bacteria from entering the local planting, especially in protected cultivation. The objective of this study was to find fluorescent Pseudomonas isolated from the rhizosphere of the cerrado nightshade, for use in the biological control of R. solanacearum. Soil samples were collected from the rhizosphere of various plants of the Solanaceae family, from which they were obtained 40 isolates of Pseudomonas spp. These isolates were subjected to in vitro test methodology for prospecting antibiosis the double layer pattern, which found that 33 isolates were able to inhibit the growth of R. solanacearum. Isolates that induced the larger diameters of inhibition zone, 12 (F 1.5, STONE, F 1.2, F 4.1, JOMG 1.1, JBR, T3, RJ 1.1 JOBA, PSD 9, JAL, JCP 8.1) and were selected for the trials in the greenhouse. The tests in the greenhouse were divided into two, one with a strain of R. solanacearum (UNB 1173), another with a mixture of three strains of the pathogen (UNB, 1033, 1103 and 1173). Five isolates (RJ 1.1, F 4.1, JCP 1.1, PEDRA and JOBA) controlled the disease in the test with a strain of the pathogen. Eight isolates (RJ 1.1, F 1.2, F 1.5, F 4.1, JCP 8.1, PSD 9, JOBA and JAL) controlled the disease with the mixture of three strains of the pathogen. Isolated RJ 1.1, F 4.1, JAL, JOBA managed to control the disease in two trials, demonstrating potential for use in biological control of bacterial wilt.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-23T16:08:50Z No. of bitstreams: 1 2014_EdivânioRodriguesdeAraújo (2).pdf: 3003726 bytes, checksum: 23430b119aff14a628af0d6d8cbfc70c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-12T12:15:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_EdivânioRodriguesdeAraújo (2).pdf: 3003726 bytes, checksum: 23430b119aff14a628af0d6d8cbfc70c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-12T12:15:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_EdivânioRodriguesdeAraújo (2).pdf: 3003726 bytes, checksum: 23430b119aff14a628af0d6d8cbfc70c (MD5) / A mancha-bacteriana está entre os fatores que prejudicam a produção de tomate no Brasil. A doença é causada por um complexo de espécies do gênero Xanthomonas: X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans e X. gardneri. Os objetivos dessa tese são: i) realizar um levantamento da frequência de ocorrência de espécies e raças causadoras da doença em lavouras brasileiras de tomate, tanto destinadas ao consumo in natura quanto ao processamento industrial; ii) estabelecer protocolos de detecção e identificação simultânea das espécies causadoras da doença; iii) compreender o efeito da temperatura e molhamento foliar no monociclo da doença; iv) identificar possíveis agentes causadores da mancha-bacteriana e a comunidade bacteriana presente em mudas assintomáticas cultivadas em viveiro comercial e sementes comerciais de tomateiro. Para alcance desses objetivos, testes de patogenicidade, técnicas moleculares baseadas na PCR (BOX-PCR, iniciadores específicos), além de sequenciamento do gene de avirulência avrXv3 foram utilizados. O efeito da temperatura (15; 20; 25; 30 e 35°C) e molhamento foliar (0; 6; 12; 24 e 48 horas) na severidade da doença foi avaliado para as duas espécies de maior ocorrência: X. perforans e X. gardneri. Da mesma forma, foi verificado o efeito in vitro da temperatura na taxa de multiplicação em meio de cultura dessas espécies. Por fim, por meio de coletas de água superficial no filoplano de mudas assintomáticas e maceração de sementes, buscou-se identificar possíveis agentes patogênicos, tentando identificá-los por isolamento direto, uso de iniciadores específicos e sequenciamento do rRNA de 16S. Com base nos resultados obtidos, verificou-se que X. perforans é a espécie predominante (≈ 92% dos isolados) nos campos brasileiros de produção de tomate, em ambos os segmentos produtivos: consumo in natura e processamento industrial. Entre os isolados de X. perforans, a raça T3 predomina, representando 97,3% desses isolados. Cinco isolado foram identificados como raça T4. Esses isolados apresentaram uma inserção de 858 pb no gene avrXv3, relacionada à família de proteínas YscJ/HrcJ. Por meio dos protocolos estabelecidos foi possível identificar as quatro espécies causadoras da doença com iniciadores específicos tanto utilizando PCR convencional como PCR multiplex. As espécies X. perforans e X. gardneri apresentaram comportamento distinto com relação ao ótimo de temperatura para seu desenvolvimento. Enquanto X. perforans incitou maior porcentagem de área foliar lesionada quando exposta a temperaturas acima de v 25°C, com agressividade crescente até o limite superior testado (35°C), observou-se para X. gardneri uma redução da agressividade nos limites inferior (15°C) e superior de temperatura. Essas espécies só incitaram doença quando o período de molhamento foliar foi igual ou maior que 12 horas. Do mesmo modo, a temperatura teve efeito direto na taxa de crescimento in vitro de X. perforans. Por fim, foi possível identificar um isolado de X. euvesicatoria associado a mudas assintomáticas de tomateiro, além dos gêneros Agrobacterium, Enterobacter, Microbacterium, Sphingobium e Sphingomonas. Com isso, estratégias de manejo da doença devem focalizar X. perforans, já que é a espécie predominante. No mesmo sentido, estratégias de controle denominadas evasivas devem ser adotadas, uma vez que a doença apresenta faixas limítrofes para as variáveis temperatura e molhamento foliar. Este é o primeiro registro da ocorrência da raça T4 no país. Os isolados bacterianos dos demais gêneros encontrados em sementes e mudas devem ser avaliados quanto ao seu potencial como agentes de controle biológico. Levantamentos sistemáticos das espécies/raças causadoras da doença devem ser continuados para o auxílio nas tomadas de decisão. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bacterial spot is among the limiting factors in tomato production in Brazil. The disease is caused by a species complex of the genus Xanthomonas: X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans and X. gardneri. The aims of this thesis were: i) to perform a survey the frequency of occurrence of species and races causing bacterial spot on Brazilian tomato crops; ii) to establish protocols for simultaneous detection and identification of the species causing disease; iii) to understand the effect of temperature and leaf wetness on the monocycle of tomato bacterial spot; iv) to identify possible causal agents of tomato bacterial spot and bacterial community present in asymptomatic seedlings and seeds. For achieving these objectives, pathogenicity tests, molecular techniques based on PCR (BOX-PCR, specific primers) and sequencing of avirulence gene avrXv3 were used. The effect of temperature (15, 20, 25, 30, and 35°C) and leaf wetness (0, 6, 12, 24, and 48 hours) on disease severity was assessed. Likewise, the in vitro effect of temperature on the population growth rate of X. perforans and X. gardneri was checked. Finally, by collecting surface water on the phylloplane of asymptomatic seedlings and soaking commercial seeds, the presence of potential pathogens were surveyed. Direct isolation, using PCR with specific primers and sequencing of 16S rRNA were the tempted methods applied. Based on the results, we found that X. perforans is the predominant species (≈ 92% of isolates) in Brazilian tomato fields, in both production segments: fresh market and processing. Among strains of X. perforans, the T3 race was predominant, representing 97.3% of these isolates. Five isolates were identified as T4 race. These isolates had an insertion of 858 bp in avrXv3 gene related to a protein YscJ/HrcJ family. The protocols enabled the identification of the four species causing the disease with specific primers using both conventional PCR and multiplex PCR. The species X. perforans and X. gardneri showed different behaviors with respect to the optimum temperature for development. Xanthomonas perforans caused more disease at temperatures above 25°C, with increasing aggressiveness up to the upper limit tested (35°C). On the other hand, X. gardneri decreased the disease severity from the optimal temperature for both lower and upper limit of temperature. Both species only incited disease vii when leaf wetness periods were longer than six hours. In the same way, the temperature had a direct effect on the in vitro growth rate of X. perforans. Finally, it was possible to identify an isolate of X. euvesicatoria associated with asymptomatic tomato seedlings in a commercial nursery production, besides the genus Agrobacterium, Enterobacter, Microbacterium, Sphingomonas and Sphingobium. Thus, disease management strategies should focus on the species X. perforans, since it is the predominant species. Similarly, control strategies based on evasion should be applied, since the disease has a borderline range for the temperature and leaf wetness. This is the first report of occurrence of race T4 in Brazil. Bacterial isolates from other genus found in seeds and seedlings should be evaluated to assess their biological control potential. Systematic surveys of species/races causing the disease should be continued to aid in the control decision taking.