The aim of this thesis was to study the technological possibilities of producing biopreservatives for meat products using the by-products obtained from the fermentation process of two strains of lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum and Pediococcus pentosaceus. Both are part of the collection of starter cultures of the collaborating company of this project, and are marketed for this purpose. In the first part of this project, the conditions of industrial production of starter cultures were studied to determine the growth curves in a reference culture medium (MRS) and in experimental media. Whereas the highest counts and increased production of acids were obtained in MRS, this medium was selected to be used in the next phases of the project. Next, different techniques for microbiological stabilization of the exhausted culture broths were tested, so that the antimicrobial effect would depended only on the metabolites produced by the microorganisms studied. To determine the effect of the stabilization process on the antimicrobial properties of the stabilized broths, in vitro tests were performed against Listeria innocua. It was observed that pasteurization (P) and filtration (F) kept the antimicrobial properties of broths, unlike partial purification (PP), through which the antimicrobial activity was completely lost. Finally filtration (F) was selected since this procedure would recover viable microorganisms (for producing starter cultures) while it is obtained an stabilized broth with its antimicrobial metabolites. Considering the antimicrobial effect observed, it was studied the production of organic acids and the presence of other antimicrobial substances, such as hydrogen peroxide or bacteriocins. Both could not be detected in the fermentation broths, so that in the conditions studied, the antimicrobial effect is attributed only to the presence of organic acids. To characterize the antimicrobial capacity it was determined the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum lethal concentration (CML). Comparing the antimicrobial effect of fermentation broths of 24 hours of both microorganisms on L. innocua. As stated above, this project aims to develop a biopreservative that could be conveniently incorporated in a meat product. For this purpose, two drying techniques of the cell-free broths were compared: spray drying and lyophilization. Two support substances were tested, dextrin or maltodextrin. The powdered biopreservatives showed lower antimicrobial effect in vitro (on L. innocua, L. monocytogenes and E. coli O157: H7) than broths, which was attributed to the presence of the support. The product obtained from L. plantarum showed the greatest antimicrobial capacity based on MIC and CML, in accordance to the increased acid production observed in fermentation broths before the drying process. Finally, after characterizing the antimicrobial activity of powdered products, the antimicrobial effect on the native flora of meat products was studied. In the case of the powdered product obtained for L. plantarum (L-24FR), this study was performed in raw minced pork, showing a significant inhibitory effect especially over enterobacteria. In the case of the product obtained from P. pentosaceus (P-24FR,) a similar study was conducted but utilizing raw minced chicken. In this case it was also analyzed the use of the biopreservative along with modified atmosphere packaging (MAP) (22% O2, 30% CO2 and 48% N2). It was observed a synergistic effect of the biopreservative and MAP, with a significant reduction of Brochothrix thermosphacta and pseudomonas counts. The results of this thesis show the possibility of producing biopreservatives from L. plantarum and P. pentosaceus starter cultures from the collaborating company, although it should be considered the specific characteristics of the meat product and the doses required to achieve the desired extension of shelf life without altering its physicochemical and sensory properties. / El objetivo de esta tesis fue estudiar las posibilidades tecnológicas de producir bioconservantes para productos cárnicos a partir de los subproductos del proceso de fermentación de dos cepas de bacterias ácido-lácticas, Lactobacillus plantarum y Pediococcus pentosaceus. Ambas son parte de la colección de cultivos starter de la empresa colaboradora del proyecto, y son comercializadas con este fin. Se estudiaron las condiciones de producción industrial de los cultivos iniciadores para determinar las curvas de crecimiento de los mismos en un medio de cultivo de referencia (MRS) y en medios experimentales. Considerando que los recuentos más altos y la mayor producción de ácidos se obtuvieron con MRS, se seleccionó este medio para desarrollar las siguientes fases del proyecto. Luego, se estudiaron técnicas para la estabilización microbiológica de los caldos de fermentación de manera que el efecto antimicrobiano dependiese únicamente de los metabolitos producidos al inactivarse los microorganismos vivos. Dichas técnicas fueron la pasteurización, la purificación parcial y la filtración. Se observó que la pasteurización (P) y la filtración mantenían las propiedades antimicrobianas del caldo, a diferencia de la purificación parcial (PP), con la cual se perdía el poder antimicrobiano. Se seleccionó la Filtración (F) dado que permitiría recuperar los microorganismos viables (para producir cultivos starter) mientras se obtiene un caldo estabilizado con los metabolitos antimicrobianos. Se caracterizó la producción de ácidos orgánicos y la presencia de otras sustancias antimicrobianas, como el peróxido de hidrógeno o las bacteriocinas. Ambas no se detectaron en los caldos de fermentación, de modo que en las condiciones estudiadas, el efecto antimicrobiano se debe a la presencia de ácidos orgánicos. Para caracterizar la capacidad antimicrobiana se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima letal (CML). Se observó que la CMI y la CML fueron inferiores para el caldo de L. plantarum (L-24F) en comparación con los de P. pentosaceus (P-24F), lo cual se relaciona a una mayor producción de ácidos del primero. Como se ha comentado anteriormente, este proyecto tiene como finalidad elaborar un producto bioconservante que pudiera ser incorporado de forma conveniente en un producto cárnico. Para ello, se obtuvieron productos en polvo a partir del extracto libre de células empleando las técnicas de secado por atomización y liofilización. Se testaron como soportes dextrina o maltodextrina. Los bioconservantes mostraron un efecto antimicrobiano in vitro (sobre L. innocua, L. monocytogenes y E. coli O157:H7) inferior al de los caldos, lo cual se atribuyó a la presencia del soporte. El producto obtenido a partir de L. plantarum fue el que mostró un poder antimicrobiano mayor en base a la CMI y CML, en concordancia con la mayor producción de ácidos, observada en las caldos de fermentación antes del proceso de secado. Por último, se estudió el efecto antimicrobiano de los mismos sobre la flora autóctona de productos cárnicos. En el caso de L-24F los ensayos se realizaron en carne picada de cerdo, observándose un efecto inhibitorio importante especialmente sobre las enterobacterias. En el caso de P-24F se realizó un estudio similar pero en carne picada de pollo, analizándose además la aplicación del bioconservante en conjunto con el envasado en atmósfera modificada (MAP) (22% O2, 30% CO2, y 48% N2). Se observó un efecto sinérgico del bioconservante y MAP, con una reducción importante del crecimiento de pseudomonas y Brochothrix thermosphacta. Los resultados de esta tesis demuestran la posibilidad de producir bioconservantes a partir de los cultivos starter L. plantarum y P. pentosaceus de la empresa colaboradora, aunque debe considerarse las características del producto cárnico y las dosis requeridas para lograr la extensión deseada de la vida útil del / L'objectiu d'esta tesi va ser estudiar les possibilitats tecnològiques de produir bioconservants per a productes càrnics a partir dels subproductes del procés de fermentació de dos ceps de bacteris àcid-làctiques, Lactobacillus plantarum i Pediococcus pentosaceus. Ambdós són part de la col·lecció de cultius estàrter de l'empresa col·laboradora del projecte i són comercialitzades amb este fi. Es van estudiar les condicions de producció industrial dels cultius iniciadors per a determinar les corbes de creixement dels mateixos en un mitjà de cultiu de referència (MRS) i en mitjans experimentals. Considerant que els recomptes més alts i la major producció d'àcids (major descens de pH) es van obtindre amb MRS, es va seleccionar este mig per a desenrotllar les següents fases del projecte. A continuació, es van estudiar tècniques per a l'estabilització microbiològica dels caldos de manera que l'efecte antimicrobià depenguera únicament dels metabòlits produïts a l'inactivar-se els microorganismes vius. Dites tècniques van ser la pasteurització, la purificació parcial i la filtració. Així, es va observar que la Pasteurització (P) i la Filtració (F) mantenien les propietats antimicrobianes del caldo, a diferència de la purificació parcial (PP), a través de la qual es perdia el poder antimicrobià. Es va seleccionar la Filtració atès que és un procediment que permetria recuperar els microorganismes viables (per a la producció de cultius estàrter) mentres s'obté un caldo estabilitzat amb els metabòlits antimicrobians. Es va caracteritzar la producció d'àcids orgànics i la presència d'altres substàncies antimicrobianes, com el peròxid d'hidrogen o les bacteriocines. Ambdós no van poder ser detectades en els caldos de fermentació, de manera que l'efecte antimicrobià s'atribuïx exclusivament a la presència d'àcids orgànics. Per a caracteritzar la capacitat antimicrobiana es va determinar la concentració mínima inhibitòria (CMI) i la concentració mínima letal (CML). Es va observar que la CMI i la CML van ser inferiors per al caldo de L. plantarum (L-24F) en comparació amb els de P. pentosaceus (P-24F), la qual cosa es relaciona a una major producció d'àcids del primer. Com s'ha comentat anteriorment, este projecte té com a finalitat elaborar un producte bioconservant que poguera ser incorporat de forma convenient en un producte càrnic. Per a això, es van obtindre productes en pols a partir de l'extracte lliure de cèl·lules emprant les tècniques d'assecat per atomització i liofilització. Es van testar com a suports dextrina o maltodextrina. Els bioconservants van mostrar un efecte antimicrobià in vitro (sobre L. innòcua, L. monocytogenes i E. coli O157:H7) inferior al dels caldos, la qual cosa es va atribuir a la presència del suport. El producte obtingut a partir de L. plantarum va ser el que va mostrar un poder antimicrobià major basant-se en la CMI i CML, en concordança amb una major producció d'àcids, observada en les caldos de fermentació abans del procés d'assecat. Finalment, es va estudiar l'efecte antimicrobià dels mateixos sobre la flora autòctona de productes càrnics. En el cas de L-24F els assajos es van realitzar en carn picada de porc, observant-se un efecte inhibitori important especialment sobre les enterobacteries. En el cas de P-24F es va realitzar un estudi semblant però en carn picada de pollastre, analitzant-se a més l'aplicació amb del bioconservant en conjunt amb l'envasament en MAP (22% O2, 30% CO2, i 48% N2). Es va observar un efecte sinèrgic del bioconservant i MAP, amb una reducció important del creixement de pseudomones i Brochothrix thermosphacta. Els resultats d'esta tesi demostren la possibilitat de produir bioconservants a partir dels cultius estàrter L. plantarum i P. pentosaceus, encara que han de considerar-se les característiques del producte càrnic i les dosis requerides per a aconseguir l'extensió desitjada de la / De Jesus De Barros, CA. (2016). PRODUCCIÓN Y RECUPERACIÓN DE SUSTANCIAS BIOCONSERVANTES A PARTIR DE CULTIVOS INICIADORES DE PRODUCTOS CÁRNICOS-CURADOS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/76733 / TESIS

En Argentina, la explotación avícola se ha intensificado progresivamente hasta convertirse en industrial. Tal situación, ha conducido a mayores riesgos de contraer enfermedades de origen alimentario a través del consumo de carne contaminada. La transmisión de microorganismos patógenos en la cadena productiva se asocia con la crianza de los animales, el tratamiento en las plantas de faena y la manipulación durante la comercialización. Dentro de los patógenos alimentarios, Listeria monocytogenes es uno de los más importantes, debido a su impacto económico e interés para la salud pública. Esta bacteria crece a temperaturas de refrigeración y se adapta a diferentes condiciones de estrés. En la búsqueda de alternativas seguras e inocuas para controlar L. monocytogenes surge explorar el potencial de las bacterias ácido lácticas (BAL) endógenas de pollos parrilleros. Estas cumplen un rol fundamental en el mantenimiento de la microbiota intestinal y la homeostasis, pudiendo inhibir cepas potencialmente patógenas a través de la producción de sustancias inhibidoras tipo bacteriocinas. Dentro de las estrategias para promover su desarrollo, se encuentra el empleo de dietas basadas en probióticos u otros suplementos naturales. Hallar BAL adaptadas al ambiente intestinal que funcionen como antagonistas, es un desafío interesante por su fácil disponibilidad y bajo costo. En este Trabajo de Tesis se evaluó previamente en el Capítulo I la calidad microbiológica de distintos cortes de pollo provenientes de comercios locales. Los resultados evidenciaron la presencia de L. monocytogenes, con otras especies acompañantes incluyendo L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi y L. murrayi. Posteriormente, en el Capítulo II se analizó la capacidad adaptativa de las cepas de L. monocytogenes en medios conteniendo 1,5 % y 3 % p/v de cloruro de sodio (NaCl). Los estudios mostraron un comportamiento heterogéneo de las cepas frente a las distintas concentraciones de NaCl. Las diferencias observadas en el recuento se atribuyeron a la variabilidad fenotípica existente dentro de la especie. En el Capítulo III se aislaron BAL en excretas provenientes de pollos sometidos a distintas dietas experimentales. Las dietas incluían suplementos basados en el probiótico B. subtilis y harina de chía (Salvia hispánica L.). Los resultados demostraron que la composición de la dieta altera de forma significativa la abundancia de BAL intestinales, con un efecto positivo tras la incorporación de la harina de chía. Finalmente, en el Capítulo IV se evaluó la capacidad antagonista de las BAL obtenidas. En este caso, se ensayaron sobrenadantes libres de células (SLC) sobre las cepas de L. monocytogenes aisladas de la carne de pollo. Los estudios indicaron que ciertos SLC presentaron antagonismo, aunque la respuesta fue específica en cada caso. Se observó una gran variabilidad en el espectro de control (efectividad) y en la actividad antagónica, con diferencias significativas entre los halos de inhibición medidos. Los datos presentados en esta Tesis, revelan que L. monocytogenes constituye un riesgo para la salud pública y que determinadas BAL nativas o autóctonas provenientes de las excretas, pueden ser útiles para su control. Estas BAL pueden resultar de interés tanto en el desarrollo de probióticos para aves, así como para la producción de sustancias antimicrobianas, de importancia en la industria alimentaria. / In Argentina, poultry farming has progressively intensified to become industrial. Such a situation has led to higher risks of contracting foodborne diseases through the consumption of contaminated meat. The transmission of pathogenic microorganisms in the production chain is associated with the rearing of animals, treatment in slaughter plants and handling during commercialization. Within the food pathogens, Listeria monocytogenes is one of the most important, due to its economic impact and interest for public health. This bacterium grows at refrigeration temperatures and adapts to different stress conditions. In the search for safe and innocuous alternatives to control L. monocytogenes, it is necessary to explore the potential of endogenous lactic acid bacteria (LAB) from broiler chickens. These play a fundamental role in the maintenance of intestinal microbiota and homeostasis, being able to inhibit potentially pathogenic strains through the production of inhibitory substances such as bacteriocins. Among the strategies to promote its development, is the use of diets based on probiotics or other natural supplements. Finding LABs adapted to the intestinal environment that function as antagonists is an interesting challenge due to their easy availability and low cost. In this Thesis Work, the microbiological quality of different cuts of chicken from local businesses was previously evaluated in Chapter I. The results showed the presence of L. monocytogenes, with other companion species including L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi and L. murrayi. Subsequently, in Chapter II, the adaptive capacity of L. monocytogenes strains in media containing 1.5 % and 3 % p/v sodium chloride (NaCl) was analyzed. The studies showed a heterogeneous behavior of the strains against the different concentrations of NaCl. The differences observed in the count were attributed to the phenotypic variability existing within the species. In Chapter III, LAB were isolated in excreta from chickens subjected to different experimental diets. The diets included supplements based on the probiotic B. subtilis and chia flour (Salvia hispánica L.). The results showed that the composition of the diet significantly alters the abundance of intestinal LAB, with a positive effect after the incorporation of chia flour. Finally, in Chapter IV the antagonistic capacity of the LAB obtained was evaluated. In this case, cell-free supernatants (SLC) were tested on L. monocytogenes strains isolated from chicken meat. Studies indicated that certain SLCs were antagonistic, although the response was specific in each case. A great variability was observed in the control spectrum (effectiveness) and antagonistic activity, with significant differences in the measured inhibition halos. The data presented in this Thesis show that L. monocytogenes constitutes a risk to public health and that certain native or autochthonous LABs from excreta may be useful for its control. These LABs may be of interest either in the development of probiotics for poultry, as well as for the production of antimicrobial substances, of importance in the food industry.