Application of molecular techniques for identification and enumeration of acetic acid bacteria:Los principales objetivos de la tesis son el desarrollo de técnicas de biología molecular rápidas y fiables para caracterizar bacterias acéticas.Las bacterias acéticas son las principales responsables del picado de los vinos y de la producción de vinagre. Sin embargo, existe un desconocimiento importante sobre su comportamiento y evolución. Las técnicas de enumeración y de identificación basadas en características fisico-químicas existentes son lentas y poco fiables mientras que las técnicas moleculares utilizadas son muy lentas y excesivamente caras y no son aplicables en un trabajo de rutina en el laboratorio ni adecuadas para una gran cantidad de muestras. En primer lugar se ha conseguido identificar a nivel de especie, mediante dos técnicas de biología molecular como son la PCR-RFLP del rDNA 16S y PCR-RFLP del rDNA 16S-23S ITS. Se lograron identificar todas las especies de bacterias acéticas existentes hasta el momento mediante la combinación de ambas técnicas. Estas técnicas se han utilizado también en estudios ecológicos.Se han desarrollado dos técnicas para la caracterización a nivel de cepa: ERIC- y REP-PCR. Estas técnicas han permitido la realización de estudios ecológicos en fermentaciones en distintas condiciones, permitiendo profundizar en el conocimiento de su comportamiento y desarrollo en fermentaciones vínicas. Se han desarrollado dos técnicas para la enumeración, real-time PCR y la detección nested-PCR respectivamente de bacterias acéticas. Estas técnicas presentan la ventaja de no tener que cultivar y por lo tanto de detectar la presencia de bacterias viables pero no cultivables, que han sido descritas dentro de las bacterias acéticas.Artículos en revistas internacionales:A González, N Hierro, M Poblet, N Rozès, A Mas, JM Guillamón: Application of molecular methods for the differentiation of acetic acid bacteria in a red wine fermentation Journal of Applied Microbiology, 96, 853-860, 2004A González, N Hierro, M Poblet, A Mas, JM Guillamón: Application of molecular methods to demonstrate species and strain evolution of acetic acid bacteria population during wine production. International Journal of Food Microbiology (en prensa), 2005. A González, JM Guillamón, A Mas, M Poblet: Application of molecular methods for routine identification of acetic acid bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (enviado).A. González, Núria Hierro, Montserrat Poblet, Albert Mas and José Manuel Guillamón. Enumeration and detection of acetic acid bacteria by real-time PCR and nested-PCR. FEMS Microbial Letters. (enviado).JM Guillamón, Hierro, N., A González, A Mas: New PCR-based methods for yeast identification. Journal of Applied Microbiology, 97, 792-801; 2004.Núria Hierro, Ángel González, Albert Mas, José Manuel Guillamón.(2005) Diversity and evolution of non-Saccharomyces yeast populations during wine fermentations: Efecto of grape ripeness and cold maceration. FEMS yeast research. (enviado).Artículos en revistas nacionales:A Mas, A González, N Hierro, M Poblet, N Rozès, JM Guillamón: Bacterias acéticas durante la fermentación vínica: Interacciones con otros microorganismos. Tecnología del vino, 11: 27-30, 2003.A Mas, N Hierro, JM Guillamón, A González, M Poblet, N Rozès: Nuevas técnicas de identificación, detección y cuantificación de levaduras de importancia en Enología. Tecnología del vino, 15, 65-70, 2004. Y. Quintero, A González, M Poblet, JM Guillamón, A Mas: Importancia de las bacterias acéticas en el vino. Enorigen, 1, 6-12, 2004Congresos y capítulos:A. González, M. Poblet, N. Rozés, JM. Guillamón, A. Mas. Desarrollo de técnicas moleculares de análisis de bacterias acéticas. Valencia, España. Gienol, 2001.A. González, N. Hierro, M. Poblet, N. Rozés, A. Mas, JM. Guillamón. Development of molécular techniques for the análisis of acetic acid bacteria. París, Francia. Xth international congress of Bacteriology and applied microbiology. 2002.J.M. Guillamón, A. González, M. Poblet, A. Mas. Development of molecular techniques for the analysis of acetic acid bacteria in winemaking. En: Yeast-Bacteria Interactions. Lallemand Tecnical Meetings, 10. Lallemand, S.A., 45-49, 2002.N. Hierro, A. González, N. Rozès, A. Mas, J.M. Guillamón: Nuevos métodos de identificación de levaduras basados en PCR. VII Jornadas Grupos de Investigación Enológica. Logroño.195-197, 2003Gonzalez, A.; Hierro, N.; Chiva, R.; Poblet, M.; Rozès, N.; Mas, A.; Guillamón, JM.: Dinámica poblacional de las bacterias acéticas en fermentaciones de vino tinto. VII Jornadas Grupos de Investigación Enológica. Logroño. 204 - 206. 2003.A. González, N. Hierro, M. Poblet, N. Rozés, A. Mas, JM. Guillamón. Population dynamics of acetic acid bacteria during red wine fermentations. 1st FEMS congress of European microbiologists. Lubiana, Eslovenia, 2003.N. Hierro, A. González, A. Mas, JM Guillamón. New PCR-based methods for yeast identification. Ponencia. Budapest, Hungría. ISSY 2003J.M. Guillamón, A. González, N. Hierro, N. Rozès, A. Mas, M. Poblet: Técnicas de identificación de bacterias acéticas. En: Primeras Jornadas de I+D+i en la Elaboración de Vinagres de vino. URV-CeRTA. 9-16, 2003.A. González, N. Hierro, M. Poblet, A. Mas, N. Rozès, J.M. Guillamón Bacterias acéticas durante la fermentación vínica. En: Primeras Jornadas de I+D+i en la Elaboración de Vinagres de vino. URV-CeRTA. 25-30, 2003.JM Guillamón, A González, M Poblet, A Mas: I microorganismi dell'Aceto Balsamico. Modena. 2004A. González, N. Hierro, M. Poblet, JM. Guillamón, A. Mas. Quantification of acetic acid bacteria in wine and vinegar samples using rt-PCR. Badajoz, España. BioMicroWorld 2005.J.M. Guillamón, A. González, M. Poblet, A. Mas: Molecualr techniques of identification and quantification of acetic acid bacteria. Vinegars and Acetic Acid Bacteria International Symposium. Reggio Emilia, 2005.A. Mas, A. González, J.M. Guillamón, M. Poblet: Acetic acid bacteria population dynamics during wine fermentation. Vinegars and Acetic Acid Bacteria International Symposium. Reggio Emilia, 2005.F. Barja, A. González, M. Mesa, M. Macías, D. Cantero. Molecular and morphological characterization of acetic acid bacteria from industrial fermenters of wine vinegar production. Vinegars and Acetic Acid Bacteria International Symposium. Reggio Emilia, 2005.A. González, N. Hierro, M. Poblet, JM. Guillamón, A. Mas. Quantitative-PCR for rapid detection of acetic acid bacteria. Vinegars and Acetic Acid Bacteria International Symposium. Reggio Emilia, 2005.N. Hierro, A. González, N. Rozés, A. Mas, JM. Guillamón. PCR-cuantitativa para la detección y cuantificación de levaduras vínicas. Palencia, España. Gienol, 2005.A. González, N. Hierro, M. Poblet, JM. Guillamón, A. Mas. Evolución de la población de las cepas de bacterias acéticas durante la fermentación alcohólica. Palencia, España. Gienol, 2005.Application of molecular techniques for identification and enumeration of acetic acid bacteria:The main objectives of the present thesis is the development of fast and reliable molecular techniques for the identification and characterization of acetic acid bacteria.Acetic acid bacteria are the main responsible of the acetification of the wines and of the Viniegra production. However, there is an important lack of knowledge about their behaviour and evolution through the different processes they are involved. The techniques of enumeration and identification based on their chemo-taxonomic properties are tedious and not reliable meanwhile molecular techniques already used are slow, tedious, very expensive and not useful for routine analysis of big amounts of samples in the laboratory.We have been able to identify at species level, with two molecular techniques such as PCR-RFLP del rDNA 16S and PCR-RFLP del rDNA 16S-23S ITS. We were able to identify all the described acetic acid bacteria species with the combination of the two techniques. Those, have also been used in ecological studies in wine.We have developed two techniques for the characterization of aceic acid bacteria at strain level: ERIC- and REP-PCR. Those techniques have allowed us the development of ecological studies in wine fermentations in different condition, allowing us to improve our knowledge about these bacteria behaviour and development through the wine fermentations.We have developed two techniques for the enumeration, real-time PCR and for the detection, nested-PCR respectively of acetic acid bacteria. Those techniques allow us not to plate the samples before the analysis, therefore they allow the detection of the viable but non-culturable cells, already describes inside the acetic acid bacteria.

En la producción de vinagres no se cuenta con cultivos iniciadores en los que se conozca su composición microbiológica y tampoco se conocen las propiedades oxidativas que presentan. La falta de cultivos iniciadores en la producción de vinagres se ve reflejada en una iniciación lenta de la acetificación o en paradas de acetificación. La utilización de inóculos permite, a la vez, la uniformización en la calidad final del producto, asegurando los parámetros de calidad predeterminados. Las bacterias acéticas son los microorganismos responsables de la biotransformación de vino a vinagre gracias a su capacidad para oxidar el etanol a ácido acético y acumularlo en el medio sin gran toxicidad para ellas. Esta oxidación tiene lugar en dos pasos iniciándose por la acción de la enzima ADH (Alcohol deshidrogenasa). Este trabajo estudia las diferencias en la expresión de la ADH-PQQ en medios con diferentes fuentes de carbono. Las diferencias en la expresión pueden ser utilizadas como indicador de la capacidad acetificadora de diferentes especies de bacterias acéticas. Se propone el uso de la RT-QPCR (real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction), como técnica para cuantificar la expresión relativa de la ADH. Esto permite poner a punto la metodologia para el análisis de la expresión relativa de la ADH y aplicarla posteriormente a otros genes de las bacterias acéticas. Se logró establecer la relación entre la actividad de la ADH con la producción de ácido acético en la producción de vinagres. Esta relación se observo especialmente en el género Acetobacter. Siendo la primera vez que se utiliza esta técnica en el área de las acetificaciones, proponemos esta técnica como una herramienta para el estudio del metabolismo de las bacterias acéticas.

La producción de vinagres por el sistema tradicional tiene como ventaja la gran calidad del producto final pero como inconveniente los tiempos de producción prolongados. El objetivo de esta tesis era mejorar este proceso mediante la utilización de diferentes tipos de barricas y el estudio de la microbiota implicada para un mejor control del proceso microbiológico. A nivel cinético, el uso de maderas más porosas que el roble redujo el tiempo de acetificación, mientras que una disminución del grosor no contribuyó a mejorar el proceso. A nivel microbiológico, se observó que dependiendo de las condiciones de la acetificación Acetobacter pasteurianus y/o diferentes especies del género Gluconacetobacter pueden ser las responsables del proceso. Sin embargo, no se observó la imposición de una cepa a lo largo de todo el proceso, sino una sucesión de cepas a medida que la acidez iba aumentando.