Orientador: Solange Bento Farah Kooke / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T06:48:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sartorato_EdiLucia_D.pdf: 6257921 bytes, checksum: b356e6f9bb04e096fb161a1d404cc805 (MD5) Previous issue date: 1997 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T08:29:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_LuisAntonioViolinDias_M.pdf: 9053899 bytes, checksum: 56f4c8213597e5f34e7aa65fda3c418e (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Face à dificuldade do estudo de material humano, muitos modelos experimentais, que mimetizam doenças desmielinizantes, têm sido utilizados no estudo das características celulares da desmielinização e da limitada remielinização do sistema nervoso central. O objetivo desta investigação foi estudar o fenômeno desmielinizante causado pela droga intercalante brometo de etídio (BE), bem como o conseqüente processo de remielinização, no tronco cerebral de ratos Wistar adultos. Foram utilizados 34 animais divididos em grupo I (3 animais) utilizados para as análises histológica e ultraestrutural da porção ventral da ponte, grupo 11 (21 animais) que receberam uma única injeção de 1O,u1 (0,1 % de BE em solução salina 0,15M) na cisterna basal, e grupo 111 (10 animais) que receberam uma única injeção de 10 ,ul de solução salina 0,15M. Do grupo 11, 3 animais foram perfundidos (1 para histologia e 2 para ultraestrutura) nos seguintes intervalos de tempo (dias): 1,3,7, 11, 15,21 e 30. Do grupo 111, 2 animais foram perfundidos (1 para histologia e 2 para ultraestrutura) até o período de 15 dias. No grupo 11, lesões desmielinizantes foram encontradas principalmente na superfície ventral da ponte e se estendem de 1/3 a 1/2 na estrutura em sentido dorsal e posteriormente constituem formações císticas. As lesões eram caracterizadas por espongiose do tecido nervoso confirmados à microscopia eletrônica de transmissão por cariorréxis das células gliais, severas alterações citoplasmáticas, formação de figuras de "honey comb", vesículas de mielina e grande aumento do espaço extracelular. Aos 3 dias, a lesão apresentava-se povoada por células fagocíticas que iniciavam a remoção dos restos de mielina. A remielinização ficava confinada à periferia da lesão e era iniciada pelos oligodendrócitos aos 11 dias. Embora neste mesmo período as células de Schwann estivessem relacionadas com axônios, a produção de mielina por essas células só foi evidenciada aos 15 dias após a injeção do BE. Na área de remielinização os oligodendrócitos estavam sempre associados a nichos de fibras desmielinizadas onde eram evidentes processos citoplasmáticos astrocitários, por outro lado, as células de Schwann apresentavam-se associadas apenas a fibras individualizadas que não estivessem relacionadas com processos astrocitários. Nesta investigação a remielinização do encéfalo foi significativamente realizada por oligodendrócitos, e na ausência de processos astrocitários as células de Schwann remielinizantes migravam para a lesão, e não se relacionavam obrigatoriamente com os espaços perivasculares e subpiais. Provavelmente a astrocitose, per se, não deve ser responsabilizada pelo impedimento da remielinização por oligodendrócitos / Abstract: The difficulty to study human tissue, had led to the development of many experimental models, that mimic the nervous system demyelinating diseases. The models have contributed to the understanding of many cellular events involving the demyelination as well as the limited remyelination of the central nervous system. The objective of this investigation was to study the process of demyelination caused by the intercalant drug ethidium bromide (EB) , as well as the consequent remyelination in the brainstem of Wistar adult rats. It were utilized 34 animaIs divided into group 1 (3 animaIs) as used for histologycal and ultrastructural analyses of the ventral part of the pons, the group 11 (21 animaIs) received a single injection of 10 #1 (EB/O,l % of 0,15M saline) into the basal cisterna; the group 111 (10 animaIs) that received a single injection of 10 #1 of saline solution 0,15M. In the group 11 3 animaIs were perfused (1 for histology and 2 for ultrastructure) in time intervals (days): 1,3, 7, 11 and 15 days after EB injection. In the group 111,. Demyelinated lesions were found find mainly in the ventral surface of the pons and extended by 1/3 to 1/2 along the dorsal direction and later on constitute cystic formations. The lesions were characterized by status spongiosus on the nervous tissue, which is corroborated by ultrastructural observations showing cariorrexis of the glial cells, severe cytoplasmic alterations, honey comb formation, myelin vesicculation and finally loss of the myelin by the axons and widening of extracellular space. After 3 days the lesion is invaded by phagocytic cells that began the removal of myelin debris.The remyelination was confined to the periphery of the lesion and began with the oligodendrocytes by 11 days by this time the Schwann cells were already connected with axons, but myelin production only began by 15 days after EB injection. In the remyelinated area the oligodendrocytes were always associated with groups of demyelinated tibers, where are evident in between several cytoplasmic astrocytic processes, on the hand, the Schwann cells were seen associated with individualized fibers without any contact with astrocytes processes. In this model, the encephalic remyelination was chiefly carryed out by oligodendrocytes. In the absence of the astrocytic processes the remyelinating Schwann cells, migrate to the lesioned area / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Introdução: Os processos degenerativos vêm sendo considerados determinantes da progressão do déficit neurológico na esclerose múltipla (EM) e são associados sobretudo à perda neuronal e axonal. A patologia na substância branca (SB) manifesta-se pela quebra de membranas e perda da complexidade microestrutural dos tratos cerebrais, o que pode ser estudado indiretamente pelas alterações nos índices de fração de anisotropia (FA) e difusividade média (DM), obtidos por meio das análises das imagens por tensores de difusão (diffusion tensor imaging - DTI). Essa técnica oferece outros dois índices mais específicos, a difusividade axial () e difusividade radial (), que são associados aos processos de perda axonal e desmielinização, respectivamente. A perda neuronal na substância cinzenta (SC) pode ser avaliada pelo grau de atrofia do córtex cerebral. Este estudo tem como objetivos mensurar os índices de DTI na maior comissura cerebral, o corpo caloso (CC), e o grau e distribuição da atrofia cortical em indivíduos com EM remitente-recorrente (EMRR) e baixos escores de incapacidade funcional, correlacionando essas alterações com o volume de lesões macroscópicas e os principais parâmetros clínicos. Método: 31 indivíduos (22 mulheres, idade média 30,5 anos ± 8,7) com EMRR e um grupo controle (GC) composto por 34 indivíduos saudáveis (27 mulheres, idade média 32,3 anos ± 7,8) realizaram exames de crânio em aparelho de ressonância magnética de 3 Tesla (3T), sendo adquiridas imagens de DTI com 32 direções de gradiente, obtendo-se os índices de FA, DM, e de cinco segmentos na secção sagital do corpo caloso (CC). Através da segmentação de imagens volumétricas ponderadas em T1 foram obtidas as espessuras corticais regionais nos grupos. Esses resultados foram correlacionados com os volumes lesionais de imagens ponderadas em T1 e T2/FLAIR e os escores da escala expandida do estado de incapacidade (Expanded Disability Status Scale - EDSS), considerando-se significativos resultados com p< 0,05. Resultados: Os índices de FA, DM e do CC estavam difusamente alterados no grupo EMRR e a , alterada significativamente no esplênio, tronco médio anterior e tronco médio posterior do CC. Observou-se atrofia cortical significativa no terço anterior dos lobos temporais, bilateralmente, e nas regiões parietal inferior, insular e fronto-orbitária direitas, com uma tendência à atrofia no giro frontal superior esquerdo. As FA, DM e correlacionaram-se com os volumes lesionais T1 e, mais significativamente, com os volumes lesionais T2/FLAIR, porém não houve correlação entre os volumes lesionais e a . A espessura cortical no grupo EMRR apresentou correlações com ambos os volumes lesionais, mais significativamente com as lesões em T1. O escore médio da EDSS era 1,1 ± 0,9 (variando de 0-3), apresentando correlações com a DM e a no esplênio, tronco médio anterior e posterior do CC, com uma correlação com a no tronco médio posterior. O EDSS correlacionou-se com a espessura cortical na topografia do giro frontal superior esquerdo. Discussão e conclusão: Houve alteração difusa nos índices de FA, DM e nos segmentos do CC, com acometimento mais localizado, predominantemente médio posterior, da , o que pode sugerir desmielinização difusa do CC, porém axonopatia ou degeneração mais acentuada em algumas regiões da SB. A atrofia cortical também apresentou uma distribuição regional característica, afetando sobretudo as regiões temporais, bilateralmente, parietal inferior, insular e fronto-orbitária direitas. As correlações encontradas entre os índices de DTI e a espessura cortical e os volumes lesionais demonstraram que, ao menos em parte, as degenerações das SB e SC podem ser relacionadas à degeneração Walleriana, secundária ao acúmulo de placas lesionais. As correlações entre a DM, de alguns segmentos do CC e a espessura cortical do giro frontal superior com os escores da EDSS favoreceram à hipótese de que a degeneração tecidual na EM foi um fator preponderante na progressão do déficit neurológico na EMRR / Introduction: The degenerative processes are gaining attention as predictors of the neurological deficit in multiple sclerosis (MS), being reflected by the degree of axon loss and central nervous system atrophy. The white matter pathology (WM) is characterized by cellular membranes disruption and loss of the microstructural complexity, which can be accessed by the diffusion tensor imaging (DTI) indices of fractional anisotropy (FA) and mean diffusivity (MD). This imaging technique also offers two more specific indices: the axial diffusivity () and radial diffusivity (), which are useful to differentiate between axon loss and demyelination, respectively. The gray matter (GM) neuronal loss can be accessed by the degree of cortical atrophy. The aim of this study is to measure the DTI indices in the greatest WM commisure, the corpus callosum (CC), and the degree and distribution of cortical atrophy in patients with relapsing remitting MS (RRMS) and low disability scores, correlating them to the macroscopic lesion load and the main clinical scores. Method: 31 RRMS patients (22 women, mean age 30.5 years ± 8.7) and 34 healthy control (HC) subjects (27 women, mean age 32.3 years ± 7.8) were submitted to brain examinations in a 3T magnetic resonance image scanner. From DTI with 32 gradient encoding directions were extracted the indices of FA, MD, and , which were measured in 5 segments of the mid-sagital section of the corpus callosum (CC). The cortical thickness was obtained from the segmentation of volumetric T1 images. These results were correlated with the macroscopic lesion loads in the T1 and T2/FLAIR images and the scores in the Expanded Disability Status Scale EDSS, considering significant the results with p< 0.05. Results: The FA, MD and were diffusively abnormal in all 5 segments of the CC in the RRMS group and the was abnormal only in the splenium, anterior midbody and posterior mid-body. The anterior area of the both temporal lobes and right inferior parietal, some orbital-frontal and insular regions showed significant atrophy, with a tendency of atrophy in the superior frontal gyrus. The FA, MD and correlated with the T1 lesion load and, more significantly, with the T2/FLAIR lesion load. The cortical thickness correlated with T1 and T2/FLAIR lesion loads, more significantly with the T1 lesion load. The mean EDSS in the RRMS group was 1.1 ± 0.9 (range 0-3), correlating with the MD and of the splenium, anterior and posterior mid-body of the CC. The EDSS correlated to cortical thickness in the topography of the superior frontal gyrus. Discussion and conclusion: The FA, MD and are diffusively abnormal in the CC, with abnormalities in the , restricted to the medial and posterior segments. These results can be interpreted as signs of diffuse demyelination in the CC and a predominance of axonopathy or more advanced degeneration in some segments. The cortical atrophy also followed a characteristic regional distribution, affecting predominantly the bilateral temporal lobes, and inferior parietal, orbital-frontal and insular regions, in the right hemisphere. The correlations found between the DTI indices and the cortical thickness and the macroscopic lesion loads show that, at least partially, the WM and GM degeneration can be related to Wallerian degeneration secondary to macroscopic lesion accumulation. The correlations between the DM, , in some of the CC segments, and cortical thickness, in the superior frontal gyrus, and the EDSS scores reinforces the hypothesis that the degenerative processes in MS can play a role in the disability status of the patients

A glicoproteína oligodendrocítica da mielina (MOG) e proteína básica da mielina (MBP) têm sido implicadas como os antígenos-alvo mais importantes nos processos desmielinizantes do sistema nervoso central (SNC), e mais importantes autoantígenos que surgiram dos estudos com o modelo animal para a esclerose múltipla (EM), a encefalomielite autoimune experimental (EAE). Os primeiros autoanticorpos detectados no soro e liquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com EM foram anticorpos contra antígenos da mielina. O diagnóstico diferencial da EM inclui a presença de bandas oligoclonais (BOCs) no LCR e ausência no soro, demonstrando dessa forma síntese intratecal de imunoclobulinas G (IgG). As técnicas de detecção de anticorpos mais utilizadas atualmente são ELISA, ensaio baseado em células e western blot (WB). Neste contexto, o estudo da anti-MOG e anti-MBP e seu papel na EM podem ser estudados através da técnica de espectroscopia de força atômica (AFS). Esta é uma técnica altamente sensível que permite a detecção molecular, com a interação de uma ponta funcionalizada de microscópio de força atômica (AFM) com uma amostra, a qual fornece desta forma a força de adesão (Fad) específica para o sistema. Nesta pesquisa, foi inserido na ponta de AFM funcionalizada os peptídeos encefalitogênicos MOG92-106 e MBP85-99, para detectar e estudar os anticorpos específicos IgG anti- MOG92-106 e MBP85-99, no soro e LCR de pacientes na amostra, utilizando a técnica AFS. Sendo assim, este estudo foi realizado de forma inédita utilizando a AFS, auxiliando diretamente na investigação da EM e doenças desmielinizantes relacionadas. / Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and myelin basic protein (MBP) have been implied as the most important target antigens in demyelinating processes of central nervous system (CNS) and the most important antigens candidates whom arised from the animal model for multiple sclerosis (MS), the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The first autoantibodies detected in serum and cerebrospinal fluid (CSF) of MS patients were antibodies against myelin antigens. Differential diagnostic to MS includes the presence of oligoclonal bands (OCBs) in CSF and absence in serum, which demonstrate intrathecal IgG synthesis. Most applied techniques to detection of antibodies nowadays are ELISA, cell-based assay and western blot (WB). In this context, the study of anti-MOG role in e disease may be supported through its detection by atomic force spectroscopy (AFS) technique. AFS is a highly sensitive technique that allows molecular detection as a functionalized atomic force microscope (AFM) tip interacts with the sample, providing the system specific adhesion force (Fad). In this research, it was attached in the functionalized AFM tip the notable encephalitogenic peptides MOG92-106 and MBP85-99 to detect and study the specific antibodies anti-MOG92-106 and anti-MBP85-99 on the sample with AFS technique. Thus, this study was applied for the first time in research with AFS, assisting directly to MS and other demyelinating diseases investigation.

Introdução: Os processos degenerativos vêm sendo considerados determinantes da progressão do déficit neurológico na esclerose múltipla (EM) e são associados sobretudo à perda neuronal e axonal. A patologia na substância branca (SB) manifesta-se pela quebra de membranas e perda da complexidade microestrutural dos tratos cerebrais, o que pode ser estudado indiretamente pelas alterações nos índices de fração de anisotropia (FA) e difusividade média (DM), obtidos por meio das análises das imagens por tensores de difusão (diffusion tensor imaging - DTI). Essa técnica oferece outros dois índices mais específicos, a difusividade axial () e difusividade radial (), que são associados aos processos de perda axonal e desmielinização, respectivamente. A perda neuronal na substância cinzenta (SC) pode ser avaliada pelo grau de atrofia do córtex cerebral. Este estudo tem como objetivos mensurar os índices de DTI na maior comissura cerebral, o corpo caloso (CC), e o grau e distribuição da atrofia cortical em indivíduos com EM remitente-recorrente (EMRR) e baixos escores de incapacidade funcional, correlacionando essas alterações com o volume de lesões macroscópicas e os principais parâmetros clínicos. Método: 31 indivíduos (22 mulheres, idade média 30,5 anos ± 8,7) com EMRR e um grupo controle (GC) composto por 34 indivíduos saudáveis (27 mulheres, idade média 32,3 anos ± 7,8) realizaram exames de crânio em aparelho de ressonância magnética de 3 Tesla (3T), sendo adquiridas imagens de DTI com 32 direções de gradiente, obtendo-se os índices de FA, DM, e de cinco segmentos na secção sagital do corpo caloso (CC). Através da segmentação de imagens volumétricas ponderadas em T1 foram obtidas as espessuras corticais regionais nos grupos. Esses resultados foram correlacionados com os volumes lesionais de imagens ponderadas em T1 e T2/FLAIR e os escores da escala expandida do estado de incapacidade (Expanded Disability Status Scale - EDSS), considerando-se significativos resultados com p< 0,05. Resultados: Os índices de FA, DM e do CC estavam difusamente alterados no grupo EMRR e a , alterada significativamente no esplênio, tronco médio anterior e tronco médio posterior do CC. Observou-se atrofia cortical significativa no terço anterior dos lobos temporais, bilateralmente, e nas regiões parietal inferior, insular e fronto-orbitária direitas, com uma tendência à atrofia no giro frontal superior esquerdo. As FA, DM e correlacionaram-se com os volumes lesionais T1 e, mais significativamente, com os volumes lesionais T2/FLAIR, porém não houve correlação entre os volumes lesionais e a . A espessura cortical no grupo EMRR apresentou correlações com ambos os volumes lesionais, mais significativamente com as lesões em T1. O escore médio da EDSS era 1,1 ± 0,9 (variando de 0-3), apresentando correlações com a DM e a no esplênio, tronco médio anterior e posterior do CC, com uma correlação com a no tronco médio posterior. O EDSS correlacionou-se com a espessura cortical na topografia do giro frontal superior esquerdo. Discussão e conclusão: Houve alteração difusa nos índices de FA, DM e nos segmentos do CC, com acometimento mais localizado, predominantemente médio posterior, da , o que pode sugerir desmielinização difusa do CC, porém axonopatia ou degeneração mais acentuada em algumas regiões da SB. A atrofia cortical também apresentou uma distribuição regional característica, afetando sobretudo as regiões temporais, bilateralmente, parietal inferior, insular e fronto-orbitária direitas. As correlações encontradas entre os índices de DTI e a espessura cortical e os volumes lesionais demonstraram que, ao menos em parte, as degenerações das SB e SC podem ser relacionadas à degeneração Walleriana, secundária ao acúmulo de placas lesionais. As correlações entre a DM, de alguns segmentos do CC e a espessura cortical do giro frontal superior com os escores da EDSS favoreceram à hipótese de que a degeneração tecidual na EM foi um fator preponderante na progressão do déficit neurológico na EMRR / Introduction: The degenerative processes are gaining attention as predictors of the neurological deficit in multiple sclerosis (MS), being reflected by the degree of axon loss and central nervous system atrophy. The white matter pathology (WM) is characterized by cellular membranes disruption and loss of the microstructural complexity, which can be accessed by the diffusion tensor imaging (DTI) indices of fractional anisotropy (FA) and mean diffusivity (MD). This imaging technique also offers two more specific indices: the axial diffusivity () and radial diffusivity (), which are useful to differentiate between axon loss and demyelination, respectively. The gray matter (GM) neuronal loss can be accessed by the degree of cortical atrophy. The aim of this study is to measure the DTI indices in the greatest WM commisure, the corpus callosum (CC), and the degree and distribution of cortical atrophy in patients with relapsing remitting MS (RRMS) and low disability scores, correlating them to the macroscopic lesion load and the main clinical scores. Method: 31 RRMS patients (22 women, mean age 30.5 years ± 8.7) and 34 healthy control (HC) subjects (27 women, mean age 32.3 years ± 7.8) were submitted to brain examinations in a 3T magnetic resonance image scanner. From DTI with 32 gradient encoding directions were extracted the indices of FA, MD, and , which were measured in 5 segments of the mid-sagital section of the corpus callosum (CC). The cortical thickness was obtained from the segmentation of volumetric T1 images. These results were correlated with the macroscopic lesion loads in the T1 and T2/FLAIR images and the scores in the Expanded Disability Status Scale EDSS, considering significant the results with p< 0.05. Results: The FA, MD and were diffusively abnormal in all 5 segments of the CC in the RRMS group and the was abnormal only in the splenium, anterior midbody and posterior mid-body. The anterior area of the both temporal lobes and right inferior parietal, some orbital-frontal and insular regions showed significant atrophy, with a tendency of atrophy in the superior frontal gyrus. The FA, MD and correlated with the T1 lesion load and, more significantly, with the T2/FLAIR lesion load. The cortical thickness correlated with T1 and T2/FLAIR lesion loads, more significantly with the T1 lesion load. The mean EDSS in the RRMS group was 1.1 ± 0.9 (range 0-3), correlating with the MD and of the splenium, anterior and posterior mid-body of the CC. The EDSS correlated to cortical thickness in the topography of the superior frontal gyrus. Discussion and conclusion: The FA, MD and are diffusively abnormal in the CC, with abnormalities in the , restricted to the medial and posterior segments. These results can be interpreted as signs of diffuse demyelination in the CC and a predominance of axonopathy or more advanced degeneration in some segments. The cortical atrophy also followed a characteristic regional distribution, affecting predominantly the bilateral temporal lobes, and inferior parietal, orbital-frontal and insular regions, in the right hemisphere. The correlations found between the DTI indices and the cortical thickness and the macroscopic lesion loads show that, at least partially, the WM and GM degeneration can be related to Wallerian degeneration secondary to macroscopic lesion accumulation. The correlations between the DM, , in some of the CC segments, and cortical thickness, in the superior frontal gyrus, and the EDSS scores reinforces the hypothesis that the degenerative processes in MS can play a role in the disability status of the patients