Diese Arbeit untersucht den Einsatz von keramischen Materialien in der Trinkwasseraufbereitung mittels Filtration und fokussiert dabei die Entfernung von Viren. Herkömmliche, auf Kieselgur basierende Tiefenfilter (Filterkerzen) mit Porengrößen im unteren Mikrometerbereich, werden hinsichtlich ihres Rückhaltevermögens gegenüber Kolloiden (Viren sowie Polystyrolpartikel) untersucht, um deren Einsatzfähigkeit in der Entfernung von Mikroorganismen im Allgemeinen abschätzen zu können. Ferner wird gezeigt, wie durch ein einfaches Verfahren solche Filter modifiziert werden können, um auch kleinste Viren mit ca. 30 nm Durchmessern aus dem Rohwasser zu entfernen. Die Zugabe von MgO während der Granulierungsstufe im Herstellungsprozess der Filterkerzen bewirkt eine erhebliche Verbesserung des Virenrückhalts bis zu über 99.9999%. Die experimentellen Ergebnisse wurden dabei mit theoretischen Modellen verglichen, um Aussagen über die Mechanismen der Virenentfernung treffen zu können.

Diese Arbeit untersucht den Einsatz von keramischen Materialien in der Trinkwasseraufbereitung mittels Filtration und fokussiert dabei die Entfernung von Viren. Herkömmliche, auf Kieselgur basierende Tiefenfilter (Filterkerzen) mit Porengrößen im unteren Mikrometerbereich, werden hinsichtlich ihres Rückhaltevermögens gegenüber Kolloiden (Viren sowie Polystyrolpartikel) untersucht, um deren Einsatzfähigkeit in der Entfernung von Mikroorganismen im Allgemeinen abschätzen zu können. Ferner wird gezeigt, wie durch ein einfaches Verfahren solche Filter modifiziert werden können, um auch kleinste Viren mit ca. 30 nm Durchmessern aus dem Rohwasser zu entfernen. Die Zugabe von MgO während der Granulierungsstufe im Herstellungsprozess der Filterkerzen bewirkt eine erhebliche Verbesserung des Virenrückhalts bis zu über 99.9999%. Die experimentellen Ergebnisse wurden dabei mit theoretischen Modellen verglichen, um Aussagen über die Mechanismen der Virenentfernung treffen zu können.:Contents Chapter I Introduction 1 Chapter II Removal or inactivation of microorganisms, in particular viruses, for drinking water purposes with focus on small-scale, decentralised systems: A literature review 7 II. I Physical and chemical treatments 8 II. II Filtration processes 10 II. III Conclusions 15 Chapter III Mechanisms of adsorption in depth filtration 17 III.I Surface charge and the electrical double layer 18 III.II van der Waals interactions 22 III.III DLVO theory 23 III.IV Non-DLVO forces 25 III.V Extended DLVO Theory 27 Chapter IV Virus adsorption studies 29 IV.I A literature review 30 IV.I.I Virus concentration by adsorption-elution 33 IV.I.II Improved virus adsorption in filtration 35 IV.II The electrostatic enhanced adsorption approach 37 Chapter V Viruses 39 V.I Literature review 40 V.I.I Structure and morphology 40 V.I.II The viral life cycle 41 V.I.III Human pathogenic viruses in the aquatic environment 42 V.II Experimental 46 V.II.I The choice of viruses for adsorption studies 46 V.II.II Propagation and enumeration of the bacteriophages 48 V.II.III Characterisation of bacteriophages 51 V.III Results and discussion 54 V.III.I Production of high-titre and high-purity phage stocks 54 V.III.II Characteristics of bacteriophages 59 V.III.III Detection of a viral contaminant - the ‘Siphophage’ 64 Chapter VI The diatomaceous earth-based depth filter 69 VI.I Literature review 70 VI.I.I Diatomaceous earth 70 VI.I.II Retention of microorganisms in the DE-based depth filter 71 VI.II Experimental 73 VI.II.I Manufacturing the depth filter 73 VI.II.II Physical characterisation 74 VI.II.III Performing filter retention tests 75 VI.II.IV Latex retention test 76 VI.II.V Studying adsorption kinetics in a batch experiment 79 VI.II.VI Applying (X-)DLVO theory 80 VI.III Results and discussion 83 VI.III.I Characterisation of the depth filter 83 VI.III.II Latex removal in the depth filter 86 VI.III.III Filter performance on virus removal 94 VI.III.IV Batch-sorption experiments 99 VI.IV Summary and conclusions 102 Chapter VII The magnesium oxide modified depth filter 103 VII.I Experimental 104 VII.I.I Choice of the adsorbent material 104 VII.I.II Manufacturing the MgO-modified filter and characterisation methods 105 VII.II Results and discussion 106 VII.II.I The adsorbent: Magnesium oxide powder 106 VII.II.II Physical characterisation of modified depth filters 108 VII.II.III Virus removal in depth filters containing MgO 113 VII.II.IV Ageing behaviour of MgO modified filters 118 VII.II.V Discussion on the removal mechanisms 130 VII.III Summary and conclusions 134 Chapter VIII Summary, conclusions and outlook 135 VIII.I Summary and conclusions 136 VIII.II Outlook 137 Abbreviations, symbols and physical constants 139 Reference list 142

Die Entwicklung einer mukosal verabreichbaren, effektiven DNA-Vakzine gegen Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen auf der Basis invasiver attenuierter Bakterien ist eine vielversprechende Alternative zu bisherigen parenteralen Strategien der genetischen Vakzinierung. Innerhalb dieser Arbeit wurden Salmonellen-Impfstämme für die orale Übertragung eines eukaryontischen Expressionsplasmids mit dem kleinen Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus (HBsAg) als Modellantigen optimiert. Die kontinuierliche Sezernierung von Plasmiden als filamentöse Phagenpartikel wurde als ein erster Ansatz getestet, um mit lebenden Bakterien eine DNA-Vakzine innerhalb infizierter Zellen freizusetzen. Die Salmonellen-vermittelte Phagensekretion in der Wirtszelle ist jedoch nicht effizient genug, die Expression des Transgens zu vermitteln. Alternativ wurde ein Ansatz gewählt, durch eine spontan induzierte Lyse der Impfbakterien, Plasmid-DNA in die Wirtszelle zu übertragen. Dazu wurde ein neuartiges bakterielles Autolysesystem etabliert, basierend auf einem Zwei-Phasen-Expressionssystem und von Bakteriophagen abgeleiteten Lysedeterminanten. Dieses System ermöglicht erstmals die kontinuierliche Freisetzung von Plasmid-DNA und Proteinen aus einzelnen, lysierenden Salmonellen innerhalb einer sonst gesunden bakteriellen Gesamtpopulation. Innerhalb infizierter COS7-Zellen führt die Freisetzung des porenformierenden Proteins Listeriolysin O durch autolytische Salmonellen zur Zerstörung der Vakuole, in der die Impfbakterien replizieren, und erleichtert somit den Transfer der Plasmid-DNA aus den Bakterien in das Zytoplasma der Wirtszelle. Die Lysedeterminante und die eukaryontische Expressionskassette für HBsAg wurden auf einem Plasmid kombiniert, sowie eine Kassette zur konstitutiven Expression des Histon-ähnlichen Proteins aus Thermotoga maritima (TmHU) in ein solches Konstrukt integriert. TmHU stabilisiert die Plasmiderhaltung unter nicht selektiven Bedingungen und besitzt das Potential, die Effizienz der DNA-Translokation innerhalb der Wirtszelle zu erhöhen. Durch die orale Gabe optimierter autolytischer Impfbakterien konnte eine potente HBsAg-spezifische Antikörperantwort sowie eine zytotoxische zelluläre Antwort induziert werden. Bereits die einmalige Gabe der autolytischen Bakterien induzierte eine höhere antigenspezifische Antikörperantwort, als die herkömmliche intramuskuläre DNA-Vakzine. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Konzept autolytischer Salmonellen stellt also eine neuartige, effiziente Strategie für den mukosalen DNA-Transfer dar. Die Übertragung des Konzeptes der Autolyse auf andere bakterielle Trägersysteme ist möglich und kann zur Erweiterung des Anwendungspektrums bakterieller Vektoren beitragen. / The development of an effective mucosal DNA vaccine against infectious diseases or tumors based on invasive attenuated bacteria is a very promising alternative to common parenteral routes of genetic vaccination. This work aimed at the optimization of Salmonella vaccine strains for the oral delivery of an eukaryotic expression plasmid encoding the small Hepatitis B Virus surface antigen (HBsAg), here used as model antigen. The continuous secretion of plasmids as filamentous phage particles was first tested as a mean for the delivery of the DNA vaccine by living bacteria inside infected host cells. However, Salmonella-mediated phage secretion inside cells did not suffice for the induction of transgene expression. As alternative approach, inducible spontanous lysis of bacteria was used to mediate the release of plasmid DNA into host cells. For this purpose a novel bacterial autolytic system was established on the basis of a two-phase expression system and lysis determinants derived from bacteriophages. This system allows for the first time the continuous release of plasmid DNA and proteins from only few lysing Salmonella within an otherwise healthy bacterial population. Inside COS7 cells the release of the pore-forming protein listeriolysin O by autolytic Salmonella mediates the destruction of the Salmonella-harbouring vacuole, thereby facilitating the transfer of plasmid DNA from bacteria into the host cell cytoplasm. The lysis determinant was combined with the eukaryotic expression cassette for HBsAg on one plasmid. In addition, a cassette for the constitutive expression of TmHU, a histon-like protein derived from Thermotoga maritima, was integrated in such vector. TmHU stabilizes the plasmid propagation in the absence of selective pressure and has the potential to increase the efficiency of plasmid translocation inside the host cell. The oral administration of the optimized autolytic bacteria stimulated a potent HBsAg-specific antibody response as well as a cytotoxic cellular response. Already a single inoculation of the oral vaccine induced a higher specific antibody response than the conventional intramuscular DNA vaccine. Therefore the concept of autolytic Salmonella carrier strains developed in this work constitutes a novel efficient strategy for mucosal DNA delivery. The transfer of this concept to other bacterial carriers is possible and may widen the application field for bacterial vectors.