Die Arbeit beschreibt das phänotypische Verhalten von kultivierten Langerhanszellen, antigenpräsentierenden Zellen der Epidermis, sowie die Art und Weise ihrer Elimination. Hierfür wurden Zellkulturen von Langerhanszellen durch Migration aus normaler menschlicher Haut gewonnen. Die Langerhanszellen durchlaufen dabei die gleiche funktionelle Entwicklung, wie nach Antigenpräsentation in situ. Ziel der Untersuchung war es, die funktionellen und zellulären Eigenschaften und die Elimination von Langerhanszellen in der Zellkultur zu ermitteln. Die Anzahl viabler Zellen wurde mittels Trypanblauausschluß zu verschiedenen Zeitpunkten der Kultur ermittelt. Außerdem wurden die Zellen mittels Elektronenmikroskopie und Immuncytochemie untersucht. Die Befunde zeigen, daß die Zellen in der Kultur eine Veränderung ihres Phänotyps sowie funktionelle Änderungen im Sinne einer Ausreifung zu antigenpräsentierenden, T-Zell stimulierenden Zellen erfahren. Das in-vitro-Verhalten entspricht dem von Langerhanszellen in vivo nach Kontaktsensibilisierung. Mit Hilfe von eines für Apoptose spezifischen ELISA (= Enzyme-linked immunosorbent assay: eine Nachweisreaktion für Antigene bzw. Antikörper mithilfe von Enzymen) und Elektronenmikroskopie wurde nachgewiesen, daß die Zellen in unseren Kulturen durch Apoptose starben. Es gibt keinen Anhaltspunkt dafür, daß sich die Zellen nicht auch in vivo apoptotisch eliminieren. Die Verlauf der Funktionsmarker weist darauf hin, daß vorwiegend die maturierten Zellen von Apoptose betroffen waren, und die Apoptose über das CD 95/CD 95 L- System gesteuert wurde. Die Versuche zeigten insgesamt, daß Langerhanszellen durch Apoptose aus der Kultur eliminiert werden. Da sich die Zellen nach Migration in vitro wie Langerhanszellen nach Antigenpräsentation in vivo verhalten, scheint die Apoptose ein biologisches Regulativ für die Elimination von funktionell ausgereiften Langerhanszellen darzustellen. / This work describes the phenotypic behavior of cultivated Langerhans-cells, epidermal cells presenting antigenes and how they are eliminated . Therefore cultures of Langerhans-cells won by migration from normal human skin were used. The migrated Langerhans-cells have the same phenotypic features as Langerhans-cells after presentation of antigenes in situ. The aim of this work was to show the functional and cellular features of Langerhans-cells in culture and the way of their elimination. The cells still alive were count at distinct times using the Trypan-blue-exclusion-method. Additionally the cells were examined by electron microscopy and immuncytochemical methods. The findings show, that the cells in culture have the same characteristics of the phenotype and change of their function in the direction of developing to antigen-presenting, T-cell-stimulating cells. The in vitro behaviour is the same as of Langerhans-cells in vivo after contact-sensitization. With the help of an elisa (=Enzyme-linked immunosorbent assay) specific for apoptosis ( Cell Death Detection Elisa = CDDE) and with electron microscopy was shown, that the cultivated cells died by apoptosis. There is no reference point, that the cells do not do the same in vivo. The process of the functional markers shows, that predominantly the matured cells die by apoptosis and that it was controled by the CD 95/CD 95-L -system The investigations showed, that the Langerhans-cells were eliminated by apoptosis of the culture. The cells after migration in vitro behave in the same manner as after presentation of antigen in vivo. This indicates apoptosis to be the biologic regulation for the elimination of functional matured Langerhans-cells.

Multiple Sklerose (MS) ist eine heterogene Krankheit des Zentralnervensystems, deren pathologische Mechanismen noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Die gegenwärtige Hypothese ist, daß pro-inflammatorische T-Zellen entscheidend an der Pathogenese der MS beteiligt sind. Man geht davon aus, daß eine Fehlregulation der T-Zell-Kontrolle, möglicherweise bedingt durch ein Ungleichgewicht an Apoptose-regulierenden Molekülen, dabei eine Rolle spielt. Tatsächlich zielen therapeutische Strategien darauf ab, T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Produktion von Zytokinen zu verringern, oder T-Zell-Eliminierung zu fördern. Diese Arbeit sollte zum einen die Bedeutung regulatorischer Faktoren klären, die für das überleben der T-Zellen von MS-Patienten verantwortlich sind. Zum anderen sollten die antiproliferative oder Apoptose-fördende Wirkung potentiell therapeutisch wirksamer Moleküle untersucht werden. Eine eingeschränkte Regulation der autoreaktiven T-Zellen durch Apoptose in der Peripherie und im ZNS trägt möglicherweise zur Pathophysiologie der MS bei. Als Schlüsselfaktoren der Regulation von Apoptose wurden Mitglieder der Bcl-2-Familie in MS-Patienten und Probanden untersucht. Diese Faktoren wurden in Relation zu der Suszeptibilität der T-Zellen gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (sog. Activation-induced cell death oder AICD) überprüft. Um die in-vivo-Elimination der Antigen-reaktiven T-Zellen nachzuahmen, wurde ein in-vitro-Modell des AICD mit repetitiver T-Zell-Stimulation verwendet. Tatsächlich zeigten polyklonale T-Zellen von MS-Patienten eine verringerte Suszeptibilität für AICD, nachgewiesen sowohl durch verminderte Caspaseaktivtät (p=0.013) als auch durch DNA-Fragmentierung (p=0.0071). Weiter wurden höhere Spiegel des Proteins Bcl-XL in den Immunzellen von MS-Patienten mit Immunoblotting gemessen (p=0.014). Eine inverse Korrelation zwischen der Expression an Bcl-XL und der Empfindlichkeit der T-Zellen gegenüber AICD steht in Übereinstimmung mit vorhergehenden Daten bezüglich der Bedeutung dieses Proteins für die Apoptose-Resistenz von T-Zellen. Es wurde bereits gezeigt, daß dieses Molekül die Ausprägung der experimentell-autoimmun Enzephalomyelitis, des Tiermodells der MS, verstärkt. Zusammen mit den erhöhten Bcl-XL-Werten bei MS-Patienten, ergeben sich nun Perspektiven für einen therapeutischen Ansatz. Abgesehen von dem Konzept die apoptotische Eliminierung von T-Zellen zu unterstützen, streben gegenwärtige therapeutische Strategien an, die Aktivierung und weitere Proliferation der schädlichen T-Zellen zu hemmen. Basierend auf klinischer Erfahrung mit eher unselektiven Therapien, ist es ein therapeutisches Ziel, neue immunomodulatorische Substanzen mit besserer Selektivität zu finden, um das Nutzen/Risiko-Verhältnis zu maximieren. Aus diesem Grund wurden zwei unterschiedliche Substanzen untersucht die beide den Zellzyklus beeinflussen. Als erster Kandidat wurde der kürzlich entdeckte Todesligand TRAIL (engl.: TNF-related apoptosis inducing ligand) aus der TNF/NGF-Familie untersucht, da diesem bereits T-Zell-regulatorische Funktionen zugeschrieben worden waren, humane Antigen-spezifische T-Zellen jedoch resistent gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose sind. Der zweite Kandidat mit potenziell therapeutischer Wirkung bei MS ist Atorvastatin, ein HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, der bereits als Lipidsenker bei Patienten eingesetzt wird. Um die Hypothese zu überprüfen, daß diese Substanzen T-Zell-Rezeptor-Signale beeinflussen können, wurden humane Antigen-spezifische T-Zell-Linien von MS-Patienten und gesunden Probanden eingesetzt. Diese wurden hinsichtlich T-Helfer-Phänotyp und Peptid-Spezifität charakterisiert. Eine Behandlung mit TRAIL führte zur Hemmung der Proliferation in unterschiedlichem Ausmaß (6.2% - 63.8%). Atorvastatin hemmte in Abhängigkeit von der Dosis ebenso die Proliferation Antigen-spezifischer T-Zellen. Beide Substanzen wirkten antiproliferativ unabhängig von der Antigenpräsentation, aufgrund ihrer Fähigkeit, die Proliferation in Abwesenheit von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen zu vermindern. Diese Eigenschaft weißt auf einen direkten Einfluß auf die T-Zell-Funktion hin. Die TRAIL-induzierte Hypoproliferation war assoziiert mit einer Herunterregulation der Zyklin-abhängigen Kinase CDK4 (engl.: cyclin dependent kinase 4), einem Schlüsselenzym für die nach T-Zell-Rezeptor-Stimulation einsetzende Transition von der G1- zur S-Phase des Zellzyklus. Inkubation mit Atorvastatin induzierte ebenso eine Verminderung von CDK4, begleitet von einer Erhöhung von p27Kip1. Die Atorvastatin-vermittelte Proliferations- und Zellzyklus-Blockade konnte durch Mevalonat rückgängig gemacht werden. Mevalonat ist ein Zwischenprodukt des HMG-CoA-Reduktaseweges. Atorvastatin scheint demnach einen direkten Einfluß auf diese Enzymkaskade zu haben, der wichtig für die Isoprenylierung von GTPase-Proteinen der Rho-Familie ist. T-Zell-Rezeptor-Stimulation führt zur Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern und nachfolgend zur Öffnung transmembranöser Kalzium-Kanäle (sog. calcium release-activated calcium oder CRAC-Kanäle), die eine für die T-Zellaktivierung notwendige und anhaltende Erhöhung der intrazellulären Kalzium-Konzentration hervorruft. Nach Behandlung mit TRAIL wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition des Einstroms extrazellulärer Kalzium-Ionen durch die CRAC-Kanäle beobachtet. Dies wurde mit löslichem TRAIL-Rezeptor-Fusionsprotein, einem TRAIL-Antagonisten, rückgängig gemacht. Die Blockade von Kalzium-abhängigen Aktivierungssignalen stellt damit möglicherweise einen primären immunregulatorischen Mechanismus für diese Todesliganden dar. Jedoch wurde keine Auswirkung von Atorvastatin auf die T-Zellaktivierung beobachtet, da der Einstrom von extrazellulärem Kalzium nicht beeinflußt wurde. Während Studien zum TRAIL-vermittelten Einfluß auf die T-Zell-Aktivierung und dem Zellzyklus erst in der präklinischen Phase sind, werden Statine, die ebenfalls den Zellzyklus beeinflussen, bereits in der Therapie anderer Erkrankungen angewand. Darüber hinaus werden derzeit bereits klinische Studien mit Statinen zur MS-Therapie durchgeführt. Weitere Untersuchungen zu den detaillierten Mechanismen antiproliferativer Substanzen mit potenziellem therapeutischen Effekt in der MS ermöglichen die Entwicklung von selektiveren immunomodulatorischen Therapien mit höherem therapeutischen Nutzen für MS-Patienten. / Multiple sclerosis (MS) is a heterogeneous disease of the central nervous system whose pathological mechanisms are far from completely understood. The current hypothesis is that pro-inflammatory T cells are orchestrating the pathogenesis of this condition. It is considered that a dysregulation in T cell control to be involved, with an imbalance in apoptosis-regulating molecules possibly playing a role. In fact, therapeutic strategies aim to reduce T cell activation, proliferation and cytokine production or to promote T cell elimination. The focus of this thesis was to identify the role of regulatory molecules for T cell survival in the immune pathogenesis of MS, and to investigate antiproliferative or apoptosis-promoting effects on T cells by potential therapeutic molecules. A limitation in the apoptotic regulation of autoreactive T cells in the periphery and in the CNS may contribute to the pathophysiology of MS. As key regulators of apoptosis, members of the Bcl-2 family were investigated in both MS patients and controls. These factors were examined in relation to the susceptibility of T cells, from both groups, towards activation-induced cell death (AICD). To mimic the in vivo elimination of antigen-reactive T cells, an in vitro model of AICD involving repetitive T cell receptor mediated stimulation was utilized. In fact, polyclonal T cells from MS patients showed a decreased susceptibility to undergo AICD as shown by both caspase activity (p=0.013) and DNA fragmentation (p=0.0071) assays. Furthermore, Bcl-XL protein levels, as measured by immunoblotting, were increased in the peripheral immune cells of MS patients (p=0.014). An inverse correlation observed between Bcl-XL levels and susceptibility of T cells to undergo AICD is in line with previous data on the significance of this anti-apoptotic protein in T cell resistance. Since this molecule has already been shown to aggravate the outcome of experimental autoimmune encephalitis, the animal model for MS, the observation of elevated Bcl-XL levels in patients offers perspectives towards therapeutic manipulation in MS. Apart from promoting apoptotic elimination, current therapeutic strategies aim at inhibiting activation and further proliferation of potentially harmful T cells. Based on clinical experience with rather non-selective therapies that promote T cell elimination, a therapeutic goal is to identify newer immunomodulatory substances with better selectivity in order to maximize the therapy's benefit to risk ratio. Thus, two different substances, both interfering with cell cycle regulation, were investigated. The first candidate was the recently discovered member of the TNF/NGF family of death ligands, TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) since it has been reported to have immunoregulatory functions and since human antigen-specific T cells were shown to be resistant towards apoptosis induction by this ligand. The second candidate drug with potential in MS therapy is atorvastatin, a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme (HMG-CoA) reductase inhibitor and lipid-lowering drug, already indicated for anomalies in lipid metabolism. In order to prove the hypothesis that these substances interfere with T cell receptor signaling, human antigen-specific T cell lines from both MS patients and controls, characterized with regards to T helper differentiation and peptide specificity, were employed. Exogenous treatment of TRAIL resulted in an inhibition in proliferation, albeit to varying degrees (6.2% - 63.8% inhibition). Atorvastatin also inhibited proliferation of antigen-specific T cell lines in a dose-dependent manner. Both compounds induced hypoproliferation independently of antigen presentation, as shown by their ability to block T cell proliferation in response to direct T cell receptor engagement, thus indicating a direct influence on T cell function. The growth inhibition by TRAIL was associated with a downregulation of the cell cycle regulator CDK4, indicative of an inhibition of cell cycle progression at the G1/S transition. Incubating T cells with atorvastatin also induced a downregulation of CDK4 expression, which was accompanied by an upregulation of p27Kip1 expression. The atorvastatin-mediated inhibition in proliferation and cell cycle progression could be reversed by mevalonate, an intermediate product of the HMG-CoA reductase pathway, suggesting a direct involvement of atorvastatin in this pathway, necessary for the isoprenylation of small GTPase proteins of the Rho family. Utilizing a thapsigargin model of calcium influx to activate the same calcium-release activated calcium (CRAC) channels as T cell receptor-stimulation by antigen, an inhibition in calcium influx could be observed on pre-incubating T cells with TRAIL. Co-incubating with human recombinant TRAIL receptor 2 fusion protein, a competitive antagonist for TRAIL, reversed this inhibition. A direct influence on calcium influx is indicative of an influence of TRAIL on the activation status of human T cells. Therefore, TRAIL directly inhibits activation of these cells via blockade of calcium influx. However, no impact of atorvastatin on early T cell activation was observed, since calcium influx was unaffected. While TRAIL-mediated interference with T cell activation and further cell cycle progression is still in the pre-clinical phase, statins, which have also been shown here to interfere with the T cell cycle, are already employed in the clinic for other ailments. In fact, clinical trials are currently being undertaken with this group of drugs for MS. Further studies on detailed mechanisms of antiproliferative substances effective in MS will allow the development of highly selective immunomodulatory agents with increased beneficial profile as MS therapy.

Breast cancer is the second leading cause of death due to cancer in women. A number of effective therapeutic strategies have been implemented in clinics to cope with the disease yet recurrent disease and toxicity reduce their effectiveness. Hence, there is a need to identify and develop more effective therapies with reduced toxic side effects to improve overall survival rates. This dissertation investigates the mechanisms of action of two natural forms of vitamin E and a cholesterol lowering drug, simvastatin, as a therapeutic strategy in human breast cancer cells. Vitamin E in nature consists of eight distinct forms which are fat soluble small lipids. Until recently, vitamin E was known as a potent antioxidant but emerging work suggests they may be resourceful agents in managing a number of chronic diseases including cancer. Anticancer properties of vitamin E have been identified to be limited to the γ- and δ- forms of both tocopherols and tocotrienols. Gamma-tocopherol ([gamma]T) and gamma-tocotrienol ([gamma]T3) have both already been identified to induce death receptor 5 (DR5) mediated apoptosis in breast cancer cells. Studies here show that similar to [gamma]T3, [gamma]T induced DR5 activation is mediated by c-Jun N-terminal kinase/C/EBP homologous protein (JNK/CHOP) proapoptotic axis which in part contributed to [gamma]T mediated dowregulation of c-FLIP, Bcl-2 and Survivin. Also, both agents activate de novo ceramide synthesis pathway which induces JNK/CHOP/DR5 proapoptotic axis and downregulates antiapoptotic factors FLICE inhibitory protein (c-FLIP), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) and Survivin leading to apoptosis. Simvastatin (SVA) has been identified to display pleiotropic effects including anticancer effects but mechanisms responsible for these actions have yet to be fully understood. In this dissertation, it was observed that simvastatin induced apoptosis in human breast cancer cells via activation of JNK/CHOP/DR5 proapoptotic axis and down regulation of antiapoptotic factors c-FLIP and Survivin which are in part dependent on JNK/CHOP/DR5 axis. The anticancer effects mediated by simvastatin can be reversed by exogenously added mevalonate and geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), implicating the blockage of mevalonate as a key event. Furthermore, work has been done to understand the factors responsible for drug resistance and identify therapeutic strategies to counteract the same. It was observed that development of drug resistance was associated with an increase in the percentage of tumor initiating cells (TICs) in both tamoxifen and Adriamycin resistant cells compared to their parental counterparts which was accompanied by an increase in phosphorylated form of Signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) proteins as well as its downstream mediators c-Myc, cyclin D1, Bcl-xL and Survivin. Inhibition of Stat3 demonstrated that Stat3 and its downstream mediators play an important role in regulation of TICs in drug resistant breast cancer. Moreover, SVA, [gamma]T3 and combination of SVA+[gamma]T3 has been observed to target TICs in drug resistant human breast cancer cells and downregulate Stat3 as well as its downstream mediators making it an attractive agent to overcome drug resistance. From the data presented here, the mechanisms responsible for the anticancer actions of [gamma]T, [gamma]T3 and SVA have been better understood, providing the necessary rationale to test these agents by themselves or in combination in pre-clinical models. / text