Immunhistochemische Vergleichsanalyse von Primärzellaggregaten und Ursprungsgeweben unterschiedlicher Dignität zur Charakterisierung der in-vitro Anpassung Zielsetzung: Dreidimensionale Zellkulturen stellen eine Weiterentwicklung der einschichtigen Zellkultur dar, die den in-vitro Bedingungen im Organismus näherkommt. Darüber hinaus ermöglichen organoide Kulturen, die neben der vorherrschenden Tumorzelle auch Bindegewebszellen und Immunzellen enthalten, eine Analyse der Interaktion dieser Zellen bei wichtigen Aspekten der Krebserkrankung wie Metastasierung, Angiogenese oder der Tumorimmunologie. Materialien und Methoden: Operationsresektate von Schilddrüsengeweben, -adenomen und -karzinomen, Ovarialkarzinomen und Sarkomen wurden in Einzelzellsuspensionen überführt. Nach Inkubation im Schüttler wurden innerhalb von 24-48 Stunden Primärzellaggregate gezüchtet, von denen Kryostatschnitte angefertigt wurden. Mit der APAAP-Methode wurden Epithelzell-, Leukozyten-, Makrophagen- und Endothelzellmarker sowie E-Cadherin, die a2-, a4-, a5- und av Integrinkette, IGF-I und EGF Rezeptoren, cerbB2 sowie Cathepsin D immunhistochemisch untersucht. Die Färbungen der Aggregate und der Herkunftsgewebe wurden statistisch mit dem Mann-Whitney Test verglichen. Ergebnisse: Primäraggregate konnten zu 90-100% aus Operationsresektaten kultiviert werden. Epithelzellen, Leukozyten, Makrophagen und Endothelzellen waren im Primäraggregaten und den Herkunftsgeweben ungefähr gleichmäßig vorhanden. Dies gilt auch für E-Cadherin, a4-Integrin, IGF-I und EGF Rezeptoren, cerbB2 und Cathepsin D. Die a2-, a5- und av Integrinkette trat nur in den Primäraggregaten von Schilddrüsengeweben und -adenomen nicht aber in deren Herkunftsgeweben auf, was auf eine de-novo Exprimierung schließen läßt. Schlußfolgerung: Mit der verwendeten Methode ist es relativ einfach möglich, organoide Primäraggregate zu züchten, die ein geeignetes Forschungsobjekt für verschiedene Aspekte der Tumorpathologie darstellen. Die gefundenen Unterschiede der Integrinexpression zeigen eine Anpassung and die in-vitro Kultivierung und sind möglicherweise eine Reaktion zur Vermeidung der matrix-abhängigen Apoptose. / Immunohistochemical Analysis of primary cell aggregates and their origin tissue of different pathology to evaluate adaptation to in-vitro environment Objective: Three-dimensional cell cultures reflect more closely the in-vitro environment then monolayer cultures. Furthermore, organoid cultures, which contain beside the dominant tumor cell also mesenchymal cells and leucocytes are used to study the interaction of these cells in several aspects of the tumor pathology, such as metastasis, angiogenesis and tumor immunology. Materials and Methods: Specimens obtained from thyroid tissue, thyroid adenomas and carcinomas, ovarian cancer and sarcomas were dissolved to single cell suspensions. After incubation under stirring, primary cell aggregates were cultured within 24-48 hours. Cryostat sections were made and stained with markers of epithelial cells, leucocytes, macrophages, endothelial cells as well as E-cadherin, a2-, a4-, a5- und av Integrin chain, IGF-I und EGF receptor, cerbB2 and Cathepsin D using the APAAP method. The immunhistochemical results of the aggregates and their origin tissue were statistically compared using the Mann-Whitney test. Results: Primary cell aggregates could be obtained from up to 90-100% of all probes. Epithelial cells, leucocytes, macrophages and endothelial cells were found equally in aggregates and their origin tissue. Also E-Cadherin, a4-Integrin, IGF-I und EGF receptors, cerbB2 und Cathepsin D were found equally. The a2-, a5- und av integrin chain was expressed in aggregates of thyroid tissue and adenomas, but not in their origin tissue suggesting a de-novo expression. Conclusion: Primary cell aggregates were easily obtained with the used method and could be used as a model in the study of tumor pathology. The different expressions of integrins show an adaptation to the in-vitro environment and could be a reaction to avoid matrix-related apoptosis.

Trotz der breiten Anwendung zielgerichteter Therapien und Immuncheckpoint-Inhibitoren, liegt die 5-Jahres-Überlebensrate beim metastasierten klarzelligen Nierenkarzinom (ccRCC) unter 15%. Um den Therapieerfolg für Patienten zu verbessern, werden neue Modelle benötigt, die die Tumorheterogenität rekapitulieren und eine personalisierte Therapieentwicklung ermöglichen. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit habe ich Organoidkulturen direkt aus Patiententumoren und sortierten Krebsstammzellen (CSCs) etabliert und diese Organoide im Detail charakterisiert. Die Rolle von WNT und NOTCH, die zuvor in ccRCC CSCs bestimmt wurde, wurde in Organoiden bestätigt und konnte mit Hilfe von molekularen Inhibitoren als therapeutische Schwachstelle ausgenutzt werden. Diese Ergebnisse heben das Potenzial von Patienten-abgeleiteten Organoiden (PDOs) für die personalisierte Medizin und das Potenzial von WNT und NOTCH Inhibierung in der ccRCC Behandlung hervor. PDOs stellen Werkzeuge für die personalisierte Medizin dar, geben jedoch wenig Einblick in die frühen Stufen der Tumorentstehung. Deshalb habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation VHL, PBRM1 und SETD2 – die drei am häufigsten mutierten Gene in ccRCC – mit einer induzierbaren CRISPR-Cas9 Strategie in induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten Nierenorganoiden targetiert. Ich differenzierte iPSCs in nierenspezifische Zelltypen aus sowohl metanephrischem Mesenchym als auch Ureterknospen-Epithelium. Knockout von VHL, PBRM1 und SETD2 führte zur Hochregulation von Hypoxie-induzierbaren Genen in Organoiden und Knockout Effekte konnten durch längere Kultivierungszeiten und Zellselektion via FACS verstärkt werden. Obwohl ccRCC-spezifische Signalwege aktiviert wurden, wurde kein Wachstumsvorteil der transformierten Zellen beobachtet. Dennoch stellen diese Organoide ein einzigartiges Modell dar, das auf andere Nephropathien angewendet werden könnte, um die Nieren- und Nierenkrebsforschung weiter voranzutreiben. / Despite the widespread application of targeted therapies and immune checkpoint inhibitors, the five-year survival rate for metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is below 15%, as unpredictable progression, therapy resistance, and tumor relapse occur. In order to improve patient outcome, novel models are needed that recapitulate tumor heterogeneity and allow for a more personalized therapy development. In the first part of my PhD thesis, I established organoid cultures directly from patient tumors and sorted cancer stem cells (CSCs) and I characterized these organoids thoroughly. The roles of WNT and NOTCH, which were previously determined in ccRCC CSCs, were confirmed in organoid cultures and could be exploited as a therapeutic weakness via small molecule inhibition. These results highlight the potential of patient-derived organoids (PDOs) for personalized therapy and further the potential of WNT and NOTCH inhibition for ccRCC treatment. PDOs present suitable tools for personalized medicine, but provide little insight into early stages of tumorigenesis. Therefore, in the second part of my thesis, I targeted VHL, PBRM1, and SETD2 – the three most frequently mutated genes in ccRCC – using an inducible CRISPR-Cas9 genome editing strategy in induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived kidney organoids. I used a previously published protocol to differentiate iPSCs into kidney-specific cells originating from both metanephric mesenchyme and ureteric bud epithelium. Knockout of VHL, PBRM1, and SETD2 led to the upregulation of hypoxia-inducible genes in organoids and knockout effects could be enhanced by longer cultivation times and cell selection through FACS. Although ccRCC-specific signaling pathways were activated, a growth advantage of transformed cells was not observed. Nevertheless, these organoids present a unique model that could be applied to other nephropathies to further advance kidney and kidney cancer research.

Die Arbeit beschreibt das phänotypische Verhalten von kultivierten Langerhanszellen, antigenpräsentierenden Zellen der Epidermis, sowie die Art und Weise ihrer Elimination. Hierfür wurden Zellkulturen von Langerhanszellen durch Migration aus normaler menschlicher Haut gewonnen. Die Langerhanszellen durchlaufen dabei die gleiche funktionelle Entwicklung, wie nach Antigenpräsentation in situ. Ziel der Untersuchung war es, die funktionellen und zellulären Eigenschaften und die Elimination von Langerhanszellen in der Zellkultur zu ermitteln. Die Anzahl viabler Zellen wurde mittels Trypanblauausschluß zu verschiedenen Zeitpunkten der Kultur ermittelt. Außerdem wurden die Zellen mittels Elektronenmikroskopie und Immuncytochemie untersucht. Die Befunde zeigen, daß die Zellen in der Kultur eine Veränderung ihres Phänotyps sowie funktionelle Änderungen im Sinne einer Ausreifung zu antigenpräsentierenden, T-Zell stimulierenden Zellen erfahren. Das in-vitro-Verhalten entspricht dem von Langerhanszellen in vivo nach Kontaktsensibilisierung. Mit Hilfe von eines für Apoptose spezifischen ELISA (= Enzyme-linked immunosorbent assay: eine Nachweisreaktion für Antigene bzw. Antikörper mithilfe von Enzymen) und Elektronenmikroskopie wurde nachgewiesen, daß die Zellen in unseren Kulturen durch Apoptose starben. Es gibt keinen Anhaltspunkt dafür, daß sich die Zellen nicht auch in vivo apoptotisch eliminieren. Die Verlauf der Funktionsmarker weist darauf hin, daß vorwiegend die maturierten Zellen von Apoptose betroffen waren, und die Apoptose über das CD 95/CD 95 L- System gesteuert wurde. Die Versuche zeigten insgesamt, daß Langerhanszellen durch Apoptose aus der Kultur eliminiert werden. Da sich die Zellen nach Migration in vitro wie Langerhanszellen nach Antigenpräsentation in vivo verhalten, scheint die Apoptose ein biologisches Regulativ für die Elimination von funktionell ausgereiften Langerhanszellen darzustellen. / This work describes the phenotypic behavior of cultivated Langerhans-cells, epidermal cells presenting antigenes and how they are eliminated . Therefore cultures of Langerhans-cells won by migration from normal human skin were used. The migrated Langerhans-cells have the same phenotypic features as Langerhans-cells after presentation of antigenes in situ. The aim of this work was to show the functional and cellular features of Langerhans-cells in culture and the way of their elimination. The cells still alive were count at distinct times using the Trypan-blue-exclusion-method. Additionally the cells were examined by electron microscopy and immuncytochemical methods. The findings show, that the cells in culture have the same characteristics of the phenotype and change of their function in the direction of developing to antigen-presenting, T-cell-stimulating cells. The in vitro behaviour is the same as of Langerhans-cells in vivo after contact-sensitization. With the help of an elisa (=Enzyme-linked immunosorbent assay) specific for apoptosis ( Cell Death Detection Elisa = CDDE) and with electron microscopy was shown, that the cultivated cells died by apoptosis. There is no reference point, that the cells do not do the same in vivo. The process of the functional markers shows, that predominantly the matured cells die by apoptosis and that it was controled by the CD 95/CD 95-L -system The investigations showed, that the Langerhans-cells were eliminated by apoptosis of the culture. The cells after migration in vitro behave in the same manner as after presentation of antigen in vivo. This indicates apoptosis to be the biologic regulation for the elimination of functional matured Langerhans-cells.