CORREIA, Tuana Oliveira. Quitinase de Classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata): Estudo preliminar da expressão do gene, clonagem, expressão e purificação em Escherichia coli BL21(λ)DE3 e determinação da estrutura através da modelagem por homologia. 2007. 90 f.Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-13T14:28:51Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-13T23:35:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T23:35:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) Previous issue date: 2007 / In this work we have made a preliminary study on the expression of a class I chitinase gene from cowpea (Vigna unguiculata L.Walp), cloning and expression of this gene in Escherichia coli BL21(λ)DE3 cells and, through homology modeling, we determined the three­ dimensional structure of this protein. The expression of the class I quitinase gene from cowpea was performed by RT­PCR from the total RNA, with specific primers, from seeds and pods in distinct stages of development (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 and 18 days), belonging to two contrasting genotypes regarding to infection by Callosobruchus maculatus, IT81D­1053 (resistant) e TE97­419­07F (susceptible). The gene expression in leaves, roots, epicotyls and hipocotyls from two contrasting genotypes considering the infection by the nematoid Meloidogyne incongnita, CE­31(resistant) e TE97­411­1F (susceptible). The VuChiI gene cloning was accomplished from the amplified product on RT­PCR with IT81D­1053 seeds, and the amplified product from the genomic DNA of MONTEIRO. Eleven clones were obtained, from which nine were sequenced. The cloning of R7 clone was accomplished in pET15b vector and the expression of the recombinant protein was induced in the presence of IPTG 1mM. The protein, with 30 kDa, was visualized through a SDS­PAGE. The protein purified through an affinity chromatography in Sepharose column with immobilized Nickel did not had a significative hydrolytic activity. The models generated for the clones and for the native chitinase, have indicated that mutations that occurred did not changed the molecule's active sites. Thus, the class I chitinase gene from feijão­ de­ corda seems to present constitutive expression in all parts of the plant. The recombinant chitinase obtained was inactive. The specific mutations in the resulting clones suggests the occurrence of isoforms of this protein, what should be elucidated in the future. / No presente trabalho, foi realizado um estudo preliminar sobre a expressão de um gene de quitinase de classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata L.Walp), a clonagem e expressão desse gene em células de Escherichia coli BL21(λ)DE3 e a determinação via modelagem por homologia da estrutura tridimensional dessa proteína. A expressão do gene da quitinase de classe I de feijão-de-corda foi obtida a partir de RT-PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos. Nessas reações, foram usadas amostras de RNA total de sementes e vagens em diferentes estágios de crescimento (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 e 18 dias), pertencentes a dois genótipos contrastantes quanto a infecção pelo Callosobruchus maculatus, IT81D-1053 (resistente) e TE97-419-07F (suscetível). A expressão foi avaliada também em folhas, raízes, epicótilo e hipocótilo de dois genótipos contrastantes quanto a infecção pelo nematóide das galhas Meloidogyne incongnita, CE-31 (resistente) e TE97-411-1F (suscetível). A clonagem do gene VuChiI foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes de IT81D-1053, e do produto amplificado a partir do DNA genômico de MONTEIRO. Foram obtidos 11 clones confirmados, dos quais 9 foram seqüenciados. A subclonagem do clone R7 foi realizada em pET15b e a expressão da proteína recombinante foi induzida na presença de IPTG 1mM. A proteína recombinante, com aproximadamente 30 kDa, foi visualizada através de um SDS-PAGE. A proteína purificada através de uma cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose com Níquel imobilizado não apresentou atividade quitinásica significativa. Os modelos gerados para os clones obtidos e para a quitinase nativa, indicam que as mutações ocorridas não alteram os sítios ativos das moléculas. Dessa forma, a quitinase de classe I do feijão-de-corda parece apresentar expressão constitutiva em todas as partes da planta. A quitinase recombinante obtida foi pouco ativa. As mutações pontuais nos clones obtidos sugerem a ocorrência de isoformas dessa proteína, o que ainda deve ser elucidado no futuro.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / No presente trabalho, foi realizado um estudo preliminar sobre a expressÃo de um gene de quitinase de classe I de feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata L.Walp), a clonagem e expressÃo desse gene em cÃlulas de Escherichia coli BL21(λ)DE3 e a determinaÃÃo via modelagem por homologia da estrutura tridimensional dessa proteÃna. A expressÃo do gene da quitinase de classe I de feijÃo-de-corda foi obtida a partir de RT-PCR com oligonucleotÃdeos iniciadores especÃficos. Nessas reaÃÃes, foram usadas amostras de RNA total de sementes e vagens em diferentes estÃgios de crescimento (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 e 18 dias), pertencentes a dois genÃtipos contrastantes quanto a infecÃÃo pelo Callosobruchus maculatus, IT81D-1053 (resistente) e TE97-419-07F (suscetÃvel). A expressÃo foi avaliada tambÃm em folhas, raÃzes, epicÃtilo e hipocÃtilo de dois genÃtipos contrastantes quanto a infecÃÃo pelo nematÃide das galhas Meloidogyne incongnita, CE-31 (resistente) e TE97-411-1F (suscetÃvel). A clonagem do gene VuChiI foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes de IT81D-1053, e do produto amplificado a partir do DNA genÃmico de MONTEIRO. Foram obtidos 11 clones confirmados, dos quais 9 foram seqÃenciados. A subclonagem do clone R7 foi realizada em pET15b e a expressÃo da proteÃna recombinante foi induzida na presenÃa de IPTG 1mM. A proteÃna recombinante, com aproximadamente 30 kDa, foi visualizada atravÃs de um SDS-PAGE. A proteÃna purificada atravÃs de uma cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose com NÃquel imobilizado nÃo apresentou atividade quitinÃsica significativa. Os modelos gerados para os clones obtidos e para a quitinase nativa, indicam que as mutaÃÃes ocorridas nÃo alteram os sÃtios ativos das molÃculas. Dessa forma, a quitinase de classe I do feijÃo-de-corda parece apresentar expressÃo constitutiva em todas as partes da planta. A quitinase recombinante obtida foi pouco ativa. As mutaÃÃes pontuais nos clones obtidos sugerem a ocorrÃncia de isoformas dessa proteÃna, o que ainda deve ser elucidado no futuro / In this work we have made a preliminary study on the expression of a class I chitinase gene from cowpea (Vigna unguiculata L.Walp), cloning and expression of this gene in Escherichia coli BL21(λ)DE3 cells and, through homology modeling, we determined the three dimensional structure of this protein. The expression of the class I quitinase gene from cowpea was performed by RTÂPCR from the total RNA, with specific primers, from seeds and pods in distinct stages of development (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 and 18 days), belonging to two contrasting genotypes regarding to infection by Callosobruchus maculatus, IT81DÂ1053 (resistant) e TE97Â419Â07F (susceptible). The gene expression in leaves, roots, epicotyls and hipocotyls from two contrasting genotypes considering the infection by the nematoid Meloidogyne incongnita, CEÂ31(resistant) e TE97Â411Â1F (susceptible). The VuChiI gene cloning was accomplished from the amplified product on RTÂPCR with IT81DÂ1053 seeds, and the amplified product from the genomic DNA of MONTEIRO. Eleven clones were obtained, from which nine were sequenced. The cloning of R7 clone was accomplished in pET15b vector and the expression of the recombinant protein was induced in the presence of IPTG 1mM. The protein, with 30 kDa, was visualized through a SDSÂPAGE. The protein purified through an affinity chromatography in Sepharose column with immobilized Nickel did not had a significative hydrolytic activity. The models generated for the clones and for the native chitinase, have indicated that mutations that occurred did not changed the molecule's active sites. Thus, the class I chitinase gene from feijÃo de corda seems to present constitutive expression in all parts of the plant. The recombinant chitinase obtained was inactive. The specific mutations in the resulting clones suggests the occurrence of isoforms of this protein, what should be elucidated in the future.