SOUSA, Paulo Cesar Pereira de. Estudos das alterações renais e vasculares induzidos pelo veneno e frações isoladas de abelha Apis mellifera.2012. 176 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-Graduação de Biotecnologia, Fortaleza-CE, 2012 / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-27T14:44:54Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_pcpsousa.pdf: 7871361 bytes, checksum: c08e421b0e8f5a30a3d35df159ea6a7d (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-27T14:49:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_pcpsousa.pdf: 7871361 bytes, checksum: c08e421b0e8f5a30a3d35df159ea6a7d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T14:49:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_pcpsousa.pdf: 7871361 bytes, checksum: c08e421b0e8f5a30a3d35df159ea6a7d (MD5) Previous issue date: 2012 / The increase in accidents involving Africanized bees in Brazil and throughout Latin America in recent decades has become the object of surveillance by the health authorities, because of accidents with hundreds of bees to be associated with frames of poisoning. The venom of the honeybee Apis mellifera is a mixture of toxic peptides with various local and systemic actions. The objective of this study was to evaluate the renal and vascular changes promoted by the whole venom of the bee A. mellifera and its fractions PLA2 and melittin. Male Wistar rats (250-300g) whose kidneys were isolated and perfused with Krebs-Henseleit solution containing modified 6g% bovine albumin previously dialyzed. The evaluation of the vascular effects of the venom of Apis mellifera in pots was carried out using conductance tests ring of isolated rat aorta. The results showed that the whole venom of A. mellifera and the complexed fraction (PLA2+melittin) promoted significant changes in all renal parameters studied, producing an increase in renal perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), urinary flow (FU) and the glomerular filtration rate (GFR), all these changes were seen at concentrations of 3μg/mL and 10μg/mL. However, the lower concentration (1μg/mL) had no effect on the evaluated parameters. It was observed a significant reduction in the percentage of tubular transport of sodium (Na+), potassium (K+) and chloride (Cl-), suggesting that the whole venom and the fraction complexed (PLA2+melittin) engaged on the renal tubular injury. Were also observed in protein deposition in the renal tubules histological focal regions with necrosis/apoptosis, and was found reduced the viability of the MDCK cells and an increased of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH), whose concentration dependent cytotoxic effect with a value IC50 47.84μg/mL. In this sense, the results suggest that the renal lesions were necrosis in the tested conditions. It had been shown in the protocol of aortic ring an increase in contractility. In conclusion, the whole venom and the fraction complexed (PLA2+melittin) of bee Apis mellifera caused nephrotoxicity, suggesting a direct action on cell death in renal tubule cells by necrosis. The contractile effect of bee venom involves the opening of calcium channels operated by voltage and suggest a role of alpha adrenergic receptors via activation of phospholipase C. This finding confirms the results found in the isolated rat kidney and there was an increase in pressure due to renal perfussão possible vasoconstriction of the vessels supplying the kidney. Studies of the venom and its fractions in different systems provide a greater understanding of the pathophysiology and an elucidation of the mechanisms observed. Thus, it can lead to the discovery of pharmacological tools and bioprospecting in the components present in the venom. / O aumento dos acidentes envolvendo abelhas africanizadas no Brasil e em toda a América, nas últimas décadas, passou a ser objeto de vigilância das autoridades sanitárias, devido ao fato dos acidentes com centenas de abelhas estarem associadas a quadros de envenenamento. O veneno da abelha Apis mellifera é uma mistura de peptídeos tóxicos com diversas ações locais e sistêmicas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar as alterações renais e vasculares promovidas pelo veneno total da abelha A. mellifera e de suas frações PLA2 e melitina. Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300g), cujos rins foram isolados e perfundidos com solução de Krebs-Henseleit modificado contendo 6g% de albumina bovina previamente dialisada. A avaliação dos efeitos vasculares do veneno de Apis mellifera em vasos de condutância foi realizada através dos ensaios em anel de aorta isolado de rato. Os resultados encontrados demonstraram que o veneno total de A. mellifera e da fração complexada (PLA2 + melitina) promoveram alterações significativas em todos os parâmetros renais estudados, produzindo um aumento na pressão de perfusão renal (PP), na resistência vascular renal (RVR), no fluxo urinário (FU) e no ritmo de filtração glomerular (RFG), todas essas alterações foram verificadas nas concentrações de 3µg/mL e 10µg/mL. Porém, a menor concentração (1µg/mL) não apresentou efeito nos parâmetros avaliados. Foi verificada uma redução significativa no percentual de transporte tubular de sódio (Na+), potássio (K+) e cloreto (Cl-), sugerindo que o veneno total e a fração complexada (PLA2 + melitina) exerçam injúria sobre os túbulos renais. Também foram observadas depósito de proteínas nos túbulos renais nas análises histológicas com regiões focais de necrose/apoptose, bem como foi constatada redução da viabilidade das células MDCK e do aumento da enzima lactato desidrogenase (LDH), cujo efeito citotóxico dependente de concentração com um valor de IC50 47.84µg/mL. Nesse sentido, os resultados sugerem que as lesões renais foram por necrose nas condições testadas. Foi demonstrado no protocolo de anel de aorta um aumento na contratilidade. Em conclusão, o veneno total e a fração complexada (PLA2 + melitina) da abelha Apis mellifera causaram nefrotoxicidade, sugestivo de uma ação direta com morte celular em células do túbulo renal por necrose. O efeito contrátil do veneno de abelha envolve a abertura de canais de cálcio operados por voltagem e sugerem a participação dos receptores alfa adrenérgicos via ativação da enzima fosfolipase C. Esse achado corrobora com os resultados encontrados em rim isolado de rato, verificando-se um aumento da pressão de perfusão renal devido a uma possível vasoconstricção dos vasos que irrigam o rim. Os estudos do veneno e suas frações em diferentes sistemas propiciam um maior conhecimento da fisiopatologia e uma elucidação dos mecanismos observados. Desta forma, pode levar à descoberta e bioprospecção de ferramentas farmacológicas em componentes presentes no veneno.

O estudo de venenos de artrópodes é de grande interesse para melhorar os tratamentos contra envenenamentos e oferece uma ótima ferramenta para melhor compreensão dos sistemas nervoso e imunológico, coagulação sanguínea e respostas inflamatórias. As abelhas são um dos animais venenosos mais estudados e a elucidação do seu proteoma é de interesse na elucidação de reações tóxicas e alérgicas a ferroadas. O número de acidentes envolvendo estes insetos é crescente, tendo ultrapassado 20.000 notificações entre 2001 e 2006 em todo o país e, apesar disso, não há um tratamento específico para estas vítimas, nem mesmo uma identificação completa dos antígenos presentes nesse veneno. O perfil protéico descrito até então apresenta cerca de 40 proteínas. O objetivo deste trabalho foi identificar o perfil protéico do veneno de abelhas utilizando a união da abordagem proteômica e da cromatografia de afinidade. Identificar também as proteínas alergênicas deste veneno e algumas modificações pós-traducionais como fosforilação e glicosilação. Além disso, um soro antiveneno específico foi produzido e sua ação neutralizadora testada. O veneno de abelhas foi separado por cromatografia de afinidade utilizando o soro antiveneno imobilizado em coluna de Sepharose 4B. Para identificação das proteínas foram utilizadas técnicas de 2D-SDS-PAGE, MALDI TOF/TOF e nanoESI-LC/MS-MS. Ensaios de Western Blotting foram realizados para identificar as proteínas alergênicas e fosforiladas. A utilização da cromatografia de afinidade permitiu a identificação 2 de proteínas pouco abundantes. Foram identificadas 54 proteínas, dentre as quais 9 nunca haviam sido descritas neste veneno, como MRJP-2, alfaglicosidase, transferinas, proteases, quinases e um inibidor de protease. Após a identificação destas proteínas foi possível propor um provável mecanismo de ação deste veneno. Dentre as proteínas identificadas como alergênicas, a MRJP-8 foi identificada pela primeira vez, juntamente com fatores relacionados ao PDGF e VEGF. Os resultados dos ensaios de neutralização de atividades citotóxicas, hemolíticas e miotóxicas mostraram a eficiência do soro antiveneno produzido. Chegou-se a um volume de 5,7 mL de soro antiveneno necessários para neutralizar a ação tóxica provocada por 100 ferroadas de abelhas. Este valor está na mesma faixa de eficiência dos melhores antivenenos (ofídicos, aracnídicos e escorpionídicos) produzidos no Brasil e no mundo. O lote de soro antiveneno produzido mostrou resultados satisfatórios para ser utilizado nos testes clínicos / The aim of this work was to identify the protein profile of honeybee venom, and detect allergenic proteins and post-translational modifications. Furthermore specific antivenom was produced and potency tests were performed in order to check its power of neutralization of toxic activities of venom. They were identified 54 proteins, 9 that have never been reported before in this venom. After identification of these proteins it was possible to outline a feasible mechanism of action of venom. For the first time MRJP-8, transferrin, PDGF and VEGF factors were identified as allergenic. Results of neutralization of citotoxic, hemolytic and myotoxic activities showed the efficacy of antivenom that had satisfactory results to be tested in clinical assay

O estudo de venenos de artrópodes é de grande interesse para melhorar os tratamentos contra envenenamentos e oferece uma ótima ferramenta para melhor compreensão dos sistemas nervoso e imunológico, coagulação sanguínea e respostas inflamatórias. As abelhas são um dos animais venenosos mais estudados e a elucidação do seu proteoma é de interesse na elucidação de reações tóxicas e alérgicas a ferroadas. O número de acidentes envolvendo estes insetos é crescente, tendo ultrapassado 20.000 notificações entre 2001 e 2006 em todo o país e, apesar disso, não há um tratamento específico para estas vítimas, nem mesmo uma identificação completa dos antígenos presentes nesse veneno. O perfil protéico descrito até então apresenta cerca de 40 proteínas. O objetivo deste trabalho foi identificar o perfil protéico do veneno de abelhas utilizando a união da abordagem proteômica e da cromatografia de afinidade. Identificar também as proteínas alergênicas deste veneno e algumas modificações pós-traducionais como fosforilação e glicosilação. Além disso, um soro antiveneno específico foi produzido e sua ação neutralizadora testada. O veneno de abelhas foi separado por cromatografia de afinidade utilizando o soro antiveneno imobilizado em coluna de Sepharose 4B. Para identificação das proteínas foram utilizadas técnicas de 2D-SDS-PAGE, MALDI TOF/TOF e nanoESI-LC/MS-MS. Ensaios de Western Blotting foram realizados para identificar as proteínas alergênicas e fosforiladas. A utilização da cromatografia de afinidade permitiu a identificação 2 de proteínas pouco abundantes. Foram identificadas 54 proteínas, dentre as quais 9 nunca haviam sido descritas neste veneno, como MRJP-2, alfaglicosidase, transferinas, proteases, quinases e um inibidor de protease. Após a identificação destas proteínas foi possível propor um provável mecanismo de ação deste veneno. Dentre as proteínas identificadas como alergênicas, a MRJP-8 foi identificada pela primeira vez, juntamente com fatores relacionados ao PDGF e VEGF. Os resultados dos ensaios de neutralização de atividades citotóxicas, hemolíticas e miotóxicas mostraram a eficiência do soro antiveneno produzido. Chegou-se a um volume de 5,7 mL de soro antiveneno necessários para neutralizar a ação tóxica provocada por 100 ferroadas de abelhas. Este valor está na mesma faixa de eficiência dos melhores antivenenos (ofídicos, aracnídicos e escorpionídicos) produzidos no Brasil e no mundo. O lote de soro antiveneno produzido mostrou resultados satisfatórios para ser utilizado nos testes clínicos / The aim of this work was to identify the protein profile of honeybee venom, and detect allergenic proteins and post-translational modifications. Furthermore specific antivenom was produced and potency tests were performed in order to check its power of neutralization of toxic activities of venom. They were identified 54 proteins, 9 that have never been reported before in this venom. After identification of these proteins it was possible to outline a feasible mechanism of action of venom. For the first time MRJP-8, transferrin, PDGF and VEGF factors were identified as allergenic. Results of neutralization of citotoxic, hemolytic and myotoxic activities showed the efficacy of antivenom that had satisfactory results to be tested in clinical assay