As β-galactosidases são dissacaridases capazes de realizar a reação de hidrólise das ligações β(1→4) de um galactosídeo, tendo a lactose como principal substrato natural. Essas enzimas são amplamente utilizadas na ciência e na indústria, apresentando um alto potencial biotecnológico. Além das propriedades hidrolíticas, as β-galactosidases possuem a característica de sintetizar açúcares complexos chamados galactooligossacarídeos, que são conhecidos como prebióticos. Nesse projeto, nos propusemos a estudar enzimas do tipo β-galactosidase com alto potencial biotecnológico. Foram escolhidos genes dos organismos Xanthomonas campestris pv. campestris e Bifidumbacterium bifidum, os quais possuem alta atividade β-galactosídica, conforme a literatura. Foram clonados nove genes, dos quais o produto de quatro foram purificados, cristalizados e tiveram sua estrutura cristalográfica determinada. A enzimas BbgII foi resolvida pela técnica de single anomalous diffraction. Sua estrutura revelou um trímero em forma de barril, no qual foi possível observar interações entre os resíduos do sítio ativo e a galactose. Adicionalmente, realizamos a caracterização bioquímica e cinética da enzima nativa e de mutantes pontuais. Também foram resolvidas as estruturas cristalográficas das enzimas XCC_1754, XCC_2404 e XCC_2895. A enzima XCC_1754 exibiu uma significativa alteração no loop 11 nas cadeias entre os dois monômeros da unidade assimétrica. Esse loop exibe as conformações aberta e fechada sobre o sítio de interação com os substratos e, através de ensaios de mutação, propomos que essas diferenças são mediadas pelas glicinas 294 e 302, que atuam como uma dobradiça. Apesar de apresentar menor afinidade pelo substrato, o mutante G294P exibiu uma atividade 50% maior do que a enzima nativa. Enquanto isso, o mutante G302P, apesar de exibir um ganho em sua afinidade, perdeu a capacidade de processar eficientemente o substrato. A enzima XCC_2895 também possui três domínios, porém características bioquímicas similares a XCC_1754. Apesar de haver ainda a necessidade de mais estudos para podermos comparar ambas, acreditamos que o fato da enzima XCC_2404 possuir uma estabilidade térmica mais elevada que a enzima XCC_1754, pode estar relacionado com a formação de grandes oligômeros. / The β-galactosidases are glycosyl hydrolases that act at the β(1→4) bonds from galactosides, with lactose as the main natural substrate. The use of such enzymes in both science and industry is very common, due its high biotechnological applicability. Beside its hydrolytic capacity, the β-galactosidases are also commonly used for the synthesis of galactoligossacharydes, well-known prebiotics. The focus of this project was to study β-galactosidases with high biotechnological potential. For that, genes from the organisms Xanthomonas campestris pv. campestris, e Bifidumbacterium bifidum were selected due the high β-galactosidic activity of those organisms, according previous works. Such genes were cloned, and four of them were expressed, crystalized and had its x-ray structure determined. The enzyme BbgII was solved applying the single anomalous diffraction method. Its structure shows a trimer forming a barrel, in which it was also possible to observe interactions between residues of the active site and galactose. The native and site direct mutants were biochemically characterized, revealing important features and the different roles of amino acids of active site. We also solved the structure of the enzymes XCC_1754, XCC_2404 and XCC_2895. The enzyme XCC_1754 showed a significant difference between the loop 11 of the two monomers at the asymmetric unit. This loop presented both open and closed conformations, which we believe it was caused by glycines 294 and 302, acting as a hinge. Despite the mutant G294P exhibited a decrease in enzyme affinity for the substrate, its general activity increased up to 50%. Meanwhile, the mutant G302P has gain affinity for the substrates, but it fails into process the substrate efficiently. The enzyme XCC_2895 shows three domains, but its biochemical properties are similar to the enzyme XCC_1754. Although there is still a need for further studies to be able to compare the enzymes, we believe that the higher thermal stability of XCC_2404 compared to XCC_1754 could be related to the formation of large oligomers.

As β-galactosidases são dissacaridases capazes de realizar a reação de hidrólise das ligações β(1→4) de um galactosídeo, tendo a lactose como principal substrato natural. Essas enzimas são amplamente utilizadas na ciência e na indústria, apresentando um alto potencial biotecnológico. Além das propriedades hidrolíticas, as β-galactosidases possuem a característica de sintetizar açúcares complexos chamados galactooligossacarídeos, que são conhecidos como prebióticos. Nesse projeto, nos propusemos a estudar enzimas do tipo β-galactosidase com alto potencial biotecnológico. Foram escolhidos genes dos organismos Xanthomonas campestris pv. campestris e Bifidumbacterium bifidum, os quais possuem alta atividade β-galactosídica, conforme a literatura. Foram clonados nove genes, dos quais o produto de quatro foram purificados, cristalizados e tiveram sua estrutura cristalográfica determinada. A enzimas BbgII foi resolvida pela técnica de single anomalous diffraction. Sua estrutura revelou um trímero em forma de barril, no qual foi possível observar interações entre os resíduos do sítio ativo e a galactose. Adicionalmente, realizamos a caracterização bioquímica e cinética da enzima nativa e de mutantes pontuais. Também foram resolvidas as estruturas cristalográficas das enzimas XCC_1754, XCC_2404 e XCC_2895. A enzima XCC_1754 exibiu uma significativa alteração no loop 11 nas cadeias entre os dois monômeros da unidade assimétrica. Esse loop exibe as conformações aberta e fechada sobre o sítio de interação com os substratos e, através de ensaios de mutação, propomos que essas diferenças são mediadas pelas glicinas 294 e 302, que atuam como uma dobradiça. Apesar de apresentar menor afinidade pelo substrato, o mutante G294P exibiu uma atividade 50% maior do que a enzima nativa. Enquanto isso, o mutante G302P, apesar de exibir um ganho em sua afinidade, perdeu a capacidade de processar eficientemente o substrato. A enzima XCC_2895 também possui três domínios, porém características bioquímicas similares a XCC_1754. Apesar de haver ainda a necessidade de mais estudos para podermos comparar ambas, acreditamos que o fato da enzima XCC_2404 possuir uma estabilidade térmica mais elevada que a enzima XCC_1754, pode estar relacionado com a formação de grandes oligômeros. / The β-galactosidases are glycosyl hydrolases that act at the β(1→4) bonds from galactosides, with lactose as the main natural substrate. The use of such enzymes in both science and industry is very common, due its high biotechnological applicability. Beside its hydrolytic capacity, the β-galactosidases are also commonly used for the synthesis of galactoligossacharydes, well-known prebiotics. The focus of this project was to study β-galactosidases with high biotechnological potential. For that, genes from the organisms Xanthomonas campestris pv. campestris, e Bifidumbacterium bifidum were selected due the high β-galactosidic activity of those organisms, according previous works. Such genes were cloned, and four of them were expressed, crystalized and had its x-ray structure determined. The enzyme BbgII was solved applying the single anomalous diffraction method. Its structure shows a trimer forming a barrel, in which it was also possible to observe interactions between residues of the active site and galactose. The native and site direct mutants were biochemically characterized, revealing important features and the different roles of amino acids of active site. We also solved the structure of the enzymes XCC_1754, XCC_2404 and XCC_2895. The enzyme XCC_1754 showed a significant difference between the loop 11 of the two monomers at the asymmetric unit. This loop presented both open and closed conformations, which we believe it was caused by glycines 294 and 302, acting as a hinge. Despite the mutant G294P exhibited a decrease in enzyme affinity for the substrate, its general activity increased up to 50%. Meanwhile, the mutant G302P has gain affinity for the substrates, but it fails into process the substrate efficiently. The enzyme XCC_2895 shows three domains, but its biochemical properties are similar to the enzyme XCC_1754. Although there is still a need for further studies to be able to compare the enzymes, we believe that the higher thermal stability of XCC_2404 compared to XCC_1754 could be related to the formation of large oligomers.

As glicosidases são enzimas que apresentam uma grande variedade de enovelamentos, assim como uma alta especificidade frente a diferentes substratos. Estas enzimas têm em comum a presença de dois resíduos catalíticos, responsáveis pela clivagem das ligações glicosídicas. O uso de glicosidases nas indústrias têxtil e alimentícia, no processamento de polpa de papel e na síntese de oligossacarídeos tem incentivado a engenharia destas proteínas no sentido de melhorar suas propriedades catalíticas e estabilidade. Estudos estruturais das glicosidases têm aumentado nosso entendimento de seus mecanismos de ação catalitica, assim como dos processos de interação proteína-carboidrato. Neste trabalho apresentamos os estudos cristalográficos de duas glicosidases de fungos, sendo elas a beta-galactosidase de Penicillium sp. e a Exo-inulinase de Aspergillis awamori, assim como estudos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) da beta-xylosidase de Trichoderma reesei. As estruturas cristalográficas da beta-galactosidase e de seu complexo com galactose foram determinadas pela técnica de substituição isomórfa simples com espalhamento anômalo (SIRAS) até 1.9 A angstron de resolução para a estrutura sem substrato e 2.0 angstron de resolução para o complexo. A estrutura do complexo com galactose foi usada para identificar os resíduos catalíticos, sendo o resíduo Glu 200 identificado como doador de próton e o resíduo Glu 299 como o nucleófílo. As estruturas cristalográficas da Exo-inulinase de Aspergillus awamori e de seu complexo com frutose foram também determinadas pela técnica de substituição isomórfa simples com espalhamento anômalo (SIRAS) até 1.55 angstron e 1.8 angstron de resolução, respectivamente. A partir da estrutura do complexo foi possível identificar os resíduos Asp41 e Glu241 como o nucleófilo e o doador de próton, respectivamente. Além disto, foi possível verificar que o Asp189, o qual faz parte do motivo conservado Arg-Asp-Pro (RDP), é importante no reconhecimento do substrato através de duas pontes de hidrogênio. Com o intuito de obter informações estruturais sobre a P-xylosidase seu envelope foi determinado a partir dos dados do espalhamento de raios-X a baixos ângulos. O envelope da p-xylosidase em solução foi calculado a 20 A de resolução, sendo o raio de giro e a dimensão máxima 36.9 angstron e 90 angstron, respectivamente. Usando algoritmos de reconhecimento de possíveis domínios foi determinado que esta proteína apresenta, além dos dois domínios característicos da família GHF3, um barril TIM e um domínio alfa/beta, um terceiro domínio. A predição da estrutura secundária e os dados de dicroísmo circular indicam que este terceiro domínio apresentaria um enovelamento tipo beta. / Glycosidases belong to a group of enzymes displaying a great variety of protein folds and substrate specificities. Two critically located acidic residues make up the catalytic machinery of these enzymes, responsible for the cleavage of glycosidic bonds. The applications of glycosidases in textile, food, and pulp processing, as well as in catalysts and oligosaccharide synthesis have encouraged the engineering of these proteins in order to obtain improved catalytic properties and stability. Furthermore, structural studies extend our understanding of the catalytic mechanism and the role of glycosidases in the recognition processes of their different substrates. In this work, we describe crystallographic studies of two fungi glycosidases, beta-galactosidase from Penicillium sp and Exo-inulinase from Aspergillis awamori, and the small-angle x-ray scattering (SAXS) studies of another glycosidase, beta-xylosidase (from Trichoderma reesei). The crystallographic structures of j3-galactosidase its complex with galactose were solved by single isomorphous replacement with anomalous scattering (SIRAS) using the quick cryo-soaking technique, at 1.90 angstron and 2.10 angstron resolution, respectively . The X-ray structure of the enzyme-galactose complex was useful in identifying the residue Glu 200 as the proton donor and residue Glu 299 as the nucleophile involved in catalysis. The x-ray structure of exo-inulinase and its complex with fructose were also solved by SIRAS using the quick cryo-soaking technique at 1.55 angstron and 1.8 angstron resolutions, respectively. The solved structure of the enzyme-fructose complex revealed two catalytically important residues, Asp41 and Glu241, as nucleophile and proton donor, respectively. It was also possible to see that residue Asp189, which belongs to the Arg-Asp-Pro motif, provides hydrogen bonds important for substrate recognition. In order to gain structurai insights about the beta-Xylosidase from Trichoderma reesei, we calculated their SAXS envelope. The low resolution shape of this enzyme in solution was obtained fiom synchrotron x-ray scattering data at 20 angstron resolution. The radii of gyration and the maximum dimension of the beta-Xylosidase were calculated to be 36.9 angstron and 90 angstron, respectively. In contrast to the fold of the only structurally characterized member of GHF-3, the beta-D-glucan exohydrolase, which has two distinct domains, the shape of the beta-xylosidase indicates the presence of three domains located in the same plane. Domain recognition algorithms were used to show that the C-terminal part of the mino acid sequence of the protein forms the third domain. Circular dichroism spectroscopy and secondary structure prediction programs show that this additional domain adopts predominantly the B-conformation.

As glicosidases são enzimas que apresentam uma grande variedade de enovelamentos, assim como uma alta especificidade frente a diferentes substratos. Estas enzimas têm em comum a presença de dois resíduos catalíticos, responsáveis pela clivagem das ligações glicosídicas. O uso de glicosidases nas indústrias têxtil e alimentícia, no processamento de polpa de papel e na síntese de oligossacarídeos tem incentivado a engenharia destas proteínas no sentido de melhorar suas propriedades catalíticas e estabilidade. Estudos estruturais das glicosidases têm aumentado nosso entendimento de seus mecanismos de ação catalitica, assim como dos processos de interação proteína-carboidrato. Neste trabalho apresentamos os estudos cristalográficos de duas glicosidases de fungos, sendo elas a beta-galactosidase de Penicillium sp. e a Exo-inulinase de Aspergillis awamori, assim como estudos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) da beta-xylosidase de Trichoderma reesei. As estruturas cristalográficas da beta-galactosidase e de seu complexo com galactose foram determinadas pela técnica de substituição isomórfa simples com espalhamento anômalo (SIRAS) até 1.9 A angstron de resolução para a estrutura sem substrato e 2.0 angstron de resolução para o complexo. A estrutura do complexo com galactose foi usada para identificar os resíduos catalíticos, sendo o resíduo Glu 200 identificado como doador de próton e o resíduo Glu 299 como o nucleófílo. As estruturas cristalográficas da Exo-inulinase de Aspergillus awamori e de seu complexo com frutose foram também determinadas pela técnica de substituição isomórfa simples com espalhamento anômalo (SIRAS) até 1.55 angstron e 1.8 angstron de resolução, respectivamente. A partir da estrutura do complexo foi possível identificar os resíduos Asp41 e Glu241 como o nucleófilo e o doador de próton, respectivamente. Além disto, foi possível verificar que o Asp189, o qual faz parte do motivo conservado Arg-Asp-Pro (RDP), é importante no reconhecimento do substrato através de duas pontes de hidrogênio. Com o intuito de obter informações estruturais sobre a P-xylosidase seu envelope foi determinado a partir dos dados do espalhamento de raios-X a baixos ângulos. O envelope da p-xylosidase em solução foi calculado a 20 A de resolução, sendo o raio de giro e a dimensão máxima 36.9 angstron e 90 angstron, respectivamente. Usando algoritmos de reconhecimento de possíveis domínios foi determinado que esta proteína apresenta, além dos dois domínios característicos da família GHF3, um barril TIM e um domínio alfa/beta, um terceiro domínio. A predição da estrutura secundária e os dados de dicroísmo circular indicam que este terceiro domínio apresentaria um enovelamento tipo beta. / Glycosidases belong to a group of enzymes displaying a great variety of protein folds and substrate specificities. Two critically located acidic residues make up the catalytic machinery of these enzymes, responsible for the cleavage of glycosidic bonds. The applications of glycosidases in textile, food, and pulp processing, as well as in catalysts and oligosaccharide synthesis have encouraged the engineering of these proteins in order to obtain improved catalytic properties and stability. Furthermore, structural studies extend our understanding of the catalytic mechanism and the role of glycosidases in the recognition processes of their different substrates. In this work, we describe crystallographic studies of two fungi glycosidases, beta-galactosidase from Penicillium sp and Exo-inulinase from Aspergillis awamori, and the small-angle x-ray scattering (SAXS) studies of another glycosidase, beta-xylosidase (from Trichoderma reesei). The crystallographic structures of j3-galactosidase its complex with galactose were solved by single isomorphous replacement with anomalous scattering (SIRAS) using the quick cryo-soaking technique, at 1.90 angstron and 2.10 angstron resolution, respectively . The X-ray structure of the enzyme-galactose complex was useful in identifying the residue Glu 200 as the proton donor and residue Glu 299 as the nucleophile involved in catalysis. The x-ray structure of exo-inulinase and its complex with fructose were also solved by SIRAS using the quick cryo-soaking technique at 1.55 angstron and 1.8 angstron resolutions, respectively. The solved structure of the enzyme-fructose complex revealed two catalytically important residues, Asp41 and Glu241, as nucleophile and proton donor, respectively. It was also possible to see that residue Asp189, which belongs to the Arg-Asp-Pro motif, provides hydrogen bonds important for substrate recognition. In order to gain structurai insights about the beta-Xylosidase from Trichoderma reesei, we calculated their SAXS envelope. The low resolution shape of this enzyme in solution was obtained fiom synchrotron x-ray scattering data at 20 angstron resolution. The radii of gyration and the maximum dimension of the beta-Xylosidase were calculated to be 36.9 angstron and 90 angstron, respectively. In contrast to the fold of the only structurally characterized member of GHF-3, the beta-D-glucan exohydrolase, which has two distinct domains, the shape of the beta-xylosidase indicates the presence of three domains located in the same plane. Domain recognition algorithms were used to show that the C-terminal part of the mino acid sequence of the protein forms the third domain. Circular dichroism spectroscopy and secondary structure prediction programs show that this additional domain adopts predominantly the B-conformation.