Orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingos_DanielaFerreira_M.pdf: 1627311 bytes, checksum: ba7a6545a75d72a741bfe8d1cda234f4 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O número de animais de companhia tem crescido substancialmente na sociedade atual, com estimativas de 48 milhões de cães e gatos no Brasil. A relação entre animais de companhia e os humanos mudou radicalmente nos últimos anos, esses estão em contato mais próximo com humanos. Como consequência dessas mudanças, agentes antimicrobianos, incluindo antibióticos usados no tratamento de infecções humanas, tem sido utilizados em cães. O objetivo deste trabalho foi investigar fenotipicamente a ocorrência de ß-lactamase de espectro estendido (ESBL) em amostras de Escherichia coli isoladas de cães e identificar os genes de resistência nestas amostras. A presença e variedade de integrons nas amostras de E. coli foi analisada. A classificação das amostras nos grupos filogenéticos A, B1, B2 e D também foram investigadas. Dentre 158 amostras de E. coli isoladas de cães sendo 51 de ITU (infecção do trato urinário), 52 de piometra e 55 de fezes de cães sadios, foram selecionadas 67 amostras que apresentavam pelo menos uma marca de resistência aos ß-lactâmicos. As amostras selecionadas: 41 isoladas de ITU, 20 isoladas de piometra e seis isoladas de fezes de animais sadios, foram submetidas a testes de sensibilidade microbiana pelo método de difusão de disco. A produção de ESBL foi verificada pelo método de aproximação de disco. A identificação dos genes das ß-lactamases foi realizada em ensaios de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) com primers específicos para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaGES-1, blaOXA-10, ampC e cmy. A classificação filogenética (chuA, yjaA, TspE4.C2), bem como a detecção de integrons das classes 1 e 2 (intI1 e intI2) também foram realizadas por PCR. Os resultados dos antibiogramas mostraram elevada resistência aos ß-lactâmicos de 1ª geração, ampicilina (82,0%) e cefalexina (62,7%) entre as amostras selecionadas. Resistência aos antimicrobianos ß-lactâmicos de 3ª e 4ª geração e ao monobactam foi observada em 7,5% das amostras. As amostras também apresentaram resistência aos antimicrobianos tetraciclina (82,0%), trimetoprim-sulfametoxazol (62,7%), enrofloxacina (35,8%), florfenicol (34,3%) e ciprofloxacina (32,3%). A expressão fenotípica de ESBL foi observada em duas amostras (3,3%), ambas isoladas de animais sadios. Na análise genotípica, foram identificados os genes blaTEM, (98,5%), ampC (95,5%), blaCTX-M (35,8%), blaSHV (6%) e cmy (2,9%) destacando que os genes blaCTX-M, blaSHV e cmy apresentaram-se associados ao blaTEM e ao ampC. Pelo sequenciamento foi possível identificar as ß-lactamases do tipo TEM-1 e CTX-M-2. Na classificação filogenética as amostras foram agrupadas nos grupos B2 (59,7%), B1 (25,4%) e A (14,9%). Dentre as 67 amostras com marcas de resistência aos ß-lactâmicos, o gene int foi detectado em 26,9% , das quais 71,4% da classe 1 e 28,6% da classe 2. Por outro lado, dentre as 91 amostras sem marcas de resistência a à ß-lactâmicos, somente 3,3% apresentaram integrons, sendo todos da classe 1. As amostras com integrons foram mais comumente alocadas nos grupos filogenéticos A e B1. A presença de ESBL, de genes de resistência e integrons em E. coli isoladas de cães é um achado importante, uma vez que o contato íntimo entre humanos e cães oferece condições para a transmissão das amostras e ainda, que estes animais podem servir de reservatórios de genes de resistência. Esses resultados reforçam a necessidade de controle no uso de antimicrobianos em animais de companhia e bem como o papel dos animais domésticos como reservatório de genes de resistência bacteriana, precisa ser melhor investigado / Abstract: The number of cats and dogs has substantially increased in modern society, with an estimated population of above 48 million in Brazil. The relationship between companion animals and humans has radically changed throughout the years, and animals have become in closer contact with humans. As a consequence of these changes, antimicrobial agents, including antimicrobial preparations licensed for human use, are frequently used in dogs. The aim of this study was to investigate, in Escherichia coli strains isolated from dogs, the occurrence of ß-extended-spectrum ß-lactamase (ESBL) phenotype and to identify resistance genes in these samples. The presence and diversity of integrons in strains of E. coli was analyzed. The classification of microorganisms in the phylogenetic groups A, B1, B2 and D was also determined. Among 158 E.coli strains isolated from dogs (51 from UTI [urinary tract infection], 52 from piometra and 55 from faeces of healthy dogs) 67 strains were selected that had at least one sign of resistance to ß-lactams. The strains selected: 41 isolated from UTI, 20 isolated from piometra and six isolated from the faeces of healthy dogs, were tested for antibiotic sensitivity by the disk diffusion method. ESBL production was screened by the double-disk synergy method. The identification of ß-lactamases was performed by PCR (Polymerase Chain Reaction) using specific primers for blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaGES-1, blaOXA-10, ampC and cmy and, subsequently, sequencing of the PCR product of strains showing the ESBL phenotype was performed. The phylogenetic classification (chuA, yjaA, TspE4.C2), as well as the detection of class 1 and class 2 integrons, were also determined by PCR. The results of susceptibility tests showed high resistance to 1st generation ß lactams, ampicillin (82.0%) and cephalexin (62.7%), among the selected strains. Resistance to 3rd and 4th generation ß-lactam antibiotics and monobactam was observed in 7.5% of isolates. The strains also showed resistance to antimicrobial tetracycline (82%), trimethoprim-sulfamethoxazole (62.7%), enrofloxacin (35.8%), florfenicol (34.3%) and ciprofloxacin (32.3%). Phenotypic expression of ESBL was observed in 2 samples (3.3%), both isolated from healthy animals. In the genotypic analysis, were identified the genes, blaTEM, (98.5%), ampC (95.5%), blaCTX-M (35.8%), blaSHV (6%) and cmy (2.9%); the genes blaCTX-M, blaSHV and cmy were shown to be associated with blaTEM and ampC. By sequencing, it was possible to identify the TEM-1 and CTX-M-2 ß-lactamases. In the phylogenetic classification, strains were classified B2 (59.7%), B1 (25.4%) and A (14.9%) groups. Among the 67 strains with resistance markers to ß-lactams, the int gene was detected in 26.9% of the strains (71.4% of class 1 and 28.6% of Class 2). Moreover, among the 91 samples without a trace of resistance to ß-lactams, only 3.3% had integrons, all of class 1. Strains with integrons were more commonly housed in the phylogenetic groups A and B1. The presence of ESBL, resistance genes and integrons in E. coli isolated from dogs is an important finding, due to close contact between humans and dogs provides conditions for the transmission of microorganisms and these animals may also serve as reservoirs of isolates harboring resistance genes. These results emphasize the need to control the use of antimicrobials in companion animals and the role of livestock as a reservoir for genes of resistance should be further investigated / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-08-15Bitstream added on 2014-06-13T18:48:56Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_lo_me_arafcf.pdf: 364674 bytes, checksum: 25ad80987f7d2eb4d8bf537154a09922 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) em membros da família Enterobacteriaceae pode conferir resistência a cefalosporinas de amploespectro, aztreonam e penicilinas. Devido a esse fenômeno, a detecção exata dos produtores de ESBL é essencial para a seleção apropriada da antibioticoterapia. Para detectar a produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) em bacilos Gram-negativos, foi usado um teste de triagem com os discos de aztreonam (ATM), ceftazidima (CAZ), cefotaxima (CTX) e ceftriaxona (CRO) sobre 300 cepas, das quais trinta e cinco eram suspeitas da presença de ESBL. A produção de ESBL foi demonstrada por três métodos fenotípicos confirmatórios de fácil utilização. Os três testes fenotípicos para confirmar a produção de ESBL incluíram o teste do sinergismo (double disk), E-test? ESBL e disco combinado. Os discos utilizados no teste do sinergismo e do disco combinado foram: aztreonam (30?g-ATM), cefotaxima (30?g-CTX), ceftazidima (30?g-CAZ), cefpodoxima (10?g-CPD) ceftriaxone (30?g-CRO) e amoxicilina+ácido clavulânico(30?g-AMC), cefotaxima+ácido clavulânico (30?g-10?g), ceftazidima+ácido clavulânico (30?g- 10?g), cefpodoxima+ácido clavulânico (10?g-1? g). Para E-test foram utilizadas fitas contendo as cefalosporinas: ceftazidima versus ceftazidima/ácido clavulânico; cefotaxima versus cefotaxima/ácido clavulânico. Os testes fenotípicos confirmaram a presença de ESBL em cinco cepas de enterobactérias (1,66%). Todos os métodos são de fácil execução, contudo o método do Etest requer experiência para interpretar os resultados. Os três testes oferecem uma solução viável para confirmar a produção de ESBL no laboratório clínico. / The production of extended spectrum beta-lactamase (ESBL) in the members of the family Enterobacteriaceae can check resistance to cephalosporins of extended-spectrum, aztreonam and penicilins. Due to this phenomenon, the exact detection of the producers of ESBL are essential for the appropriate selection of antimicrobial therapy. To detect the production of extended spectrum beta-lactamase (ESBL) in Gram-negative bacilli, a test of screening was used with the discs of aztreonam (ATM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX) e ceftriaxone (CRO) in 300 strains, of which thirty-five were suspicious of the presence of ESBL. The production of ESBL was demonstrated by three phenotypic methods confirmed of easy utilization. The three phenotypic tests to confirm the production of ESBL included the test of sinergy (double disk), E-test? ESBL and combination disk. The disks used on the test sinergy and the combination disk were: aztreonam (30?g-ATM), cefotaxime (30?g-CTX), ceftazidime (30?g-CAZ), cefpodoxime (10?g-CPD) ceftriaxone (30?g- CRO) e amoxicillin+clavulanic acid (30?g-AMC), cefotaxime+clavulanic acid (30?g- 10? g), ceftazidime+clavulanic acid (30?g-10? g), cefpodoxime+clavulanic acid (10?g- 1? g). For E-test, were utilized strips containing the cephalosporins: ceftazidime and ceftazidime/clavulanic acid; cefotaxime and cefotaxime/clavulanic acid. The phenotypic tests confirmed the presence of ESBL in five strains Enterobacteriaceae (1,66%). All of the methods are of easy execution; however, the method of Etest requires experiment to interpret the results. The three tests offer a viable solution to confirm the production of ESBL on a clinic laboratory.