Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O tÃxon genÃrico Burkholderia apresenta grande diversidade metabÃlica, possibilitando que estas proteobactÃrias vivam numa variedade de habitats, dentre os quais destacamos o solo, Ãgua (incluindo Ãgua do mar), plantas, fungos, animais e atà mesmo seres humanos. Uma das aplicaÃÃes biotecnolÃgicas mais marcantes à a capacidade de promover a biodegradaÃÃo de poluentes. Assim, este estudo visou a identificaÃÃo do isolado de Burkholderia SMF 090, bem como a avaliaÃÃo do potencial na utilizaÃÃo da gasolina como fonte de carbono e a identificaÃÃo de vias metabÃlicas possivelmente envolvidas na degradaÃÃo dos componentes da gasolina atravÃs da realizaÃÃo de anÃlises proteÃmicas. A identificaÃÃo do isolado SMF 090 e anÃlise da filogenia molecular foi realizada pelo sequenciamento do gene 16S rRNA. Posteriormente, foram realizadas anÃlises de filogenia molecular e reconstruÃÃo de Ãrvores filogenÃticas com outras bactÃrias do gÃnero. Para a caracterizaÃÃo do perfil de crescimento do isolado SMF 090 foram realizadas curvas de crescimento em meio nutritivo (TY), meio sem fonte de carbono (BH), BH suplementado com gasolina comercial e BH suplementado com D-glicose. O estudo das proteÃnas diferencialmente expressas ocorreu atravÃs de eletroforese bidimensional, de espectrometria de massa e anÃlises de bioinfomÃtica. AtravÃs da anÃlise do 16S rDNA, sugeriu-se que SMF 090 està relacionada à Burkholderia sabiae Br3407 e ambos descendem de um ancestral comum recente. A bactÃria estudada foi capaz de crescer em meio mineral contendo gasolina como Ãnica fonte de carbono. Foi possÃvel observar proteÃnas diferencialmente expressas entre os grupos testados, as quais podem estar associadas ao metabolismo de degradaÃÃo de hidrocarbonetos. As anÃlises dos gÃis de 2DE e os dados de espectrometria de massas permitiram a identificaÃÃo de vÃrias proteÃnas das vias de catabolismo dos hidrocarbonetos aromÃticos monocÃclios e policÃclicos. Portanto, o estudo apresentou informaÃÃes relevantes sobre o metabolismo de Burkholdeiras como potenciais biodegradadoras de gasolina. / The generic taxon Burkholderia presents a high metabolic diversity that allows these protobacteria live in a wide range of habitats, among these are the soil, water (including sea water), plants, fungi, animals and even humans. A remarkable biotechnological application is the capacity to promote the pollutants biodegradation. Thus, this study aimed the identification of Burkhoderia SMF 090 isolate, as well the evaluation of its potential on the utilization of gasoline as a carbon source and the identification of metabolic pathways possibly involved in the degradation of gasoline on its components through realization of proteomic analysis. The identification of the SMF 090 isolate and the analysis of molecular phylogeny were carried out by 16S rRNA gene sequencing. In addition, the molecular phylogeny was analyzed and phylogenetic trees were reconstructed using other bacteria from the same genus. In order to characterize the growth pattern of SMF 090, bacterial growth curves were assessed using the media TY (a nutritive media), BH (a medium without carbon), BH plus commercial gasoline and BH plus D-glucose. The study of differentially expressed proteins was performed using bidimensional electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics analysis. After the 16S rRNA analysis was suggested that SMF 090 is related to Burkholderia sabiae Br3407 and both descended from a recent common ancestral. The strain grown in mineral media containing gasoline as the unique carbon source. Differentially expressed proteins were observed between the tested groups and these proteins may be associated to the metabolic degradation of hydrocarbons. The analysis of data provided by 2DE electrophoresis and mass spectrometry allowed the identification of various proteins related to the monocyclic and polycyclic aromatic hydrocarbons catabolism pathway. Therefore, this study showed relevant results about the growth of Burkholderia as a potential gasoline biodegradant.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / BactÃrias do gÃnero Burkholderia possuem a capacidade de biodegradar inÃmeros compostos considerados poluentes. Mediante o exposto, este trabalho visou a identificaÃÃo molecular do isolado SMF042 oriundo de uma coleÃÃo de espÃcies de Burkholderia, verificar sua capacidade biodegradar o herbicida Ãcido 2,4-diclorofenoxiacÃtico (2,4-D), identificar as enzimas envolvidas neste processo por eletroforese bidimensional (2D) e a analisar a expressÃo dos genes tfdA e tfdB da via TFD de biodegradaÃÃo do 2,4-D. A fim de fazer a extraÃÃo de RNA e proteÃnas foi realizado o crescimento bacteriano em dois meios de cultivo BH (meio mineral), um controle, suplementado com glicose (600 mg/L), e outro suplementado com 2,4-D (600 mg/L). A extraÃÃo de RNA foi realizada na fase logarÃtmica enquanto a extraÃÃo de proteÃnas foi feita no inicio da fase estacionÃria de crescimento bacteriano. A partir das proteÃnas extraÃdas foi determinado o mapa bidimensional de referÃncia para cada condiÃÃo. O ajuste das imagens dos gÃis bidimensionais, a detecÃÃo de spots protÃico e a avaliaÃÃo dos dados para determinar variaÃÃes quantitativas e qualitativas, massa molecular (MW) e ponto isoelÃtrico (pI) dos spots foi feito pelo programa ImageMaster e a anÃlise da expressÃo dos genes, foi realizado por qRT-PCR empregando o mÃtodo da expressÃo relativa 2-ΔΔCT. Por meio da anÃlise do gene 16S rRNA o isolado SMF042 foi identificado como Burkholderia phymatum. No tocante a abordagem proteÃmica, o nÃmero mÃdio de spots das rÃplicas dos gÃis foi de 535 (controle) e 705 (tratado). A maior abundÃncia de proteÃnas foi observado nos gÃis na faixa de MW 20 e 40 KDa e pH 5-6. Enzimas envolvidas na biodegradaÃÃo do 2,4-D foram identificadas utilizando os valores de pI e MW do spot em comparaÃÃo com o banco de dados de proteÃnas no ExPASy, foram elas: 2,4-D alfa KG-dependente dioxigenase (tfdA) e clorocatecol 1,2-dioxigenase (tfdC) pertencentes a via TFD e 2,4-D oxigenase da via cadRABK, ambas de biodegradaÃÃo do 2,4-D. ProteÃnas envolvidas na resistÃncia ao estresse quÃmico, tambÃm foram identificadas, sendo elas: proteÃna GrpE e chaperona DnaK. O nÃvel de expressÃo do gene tfdA aumentou cerca de 23 vezes em relaÃÃo ao controle. Pelo exposto, o isolado SMF042 foi capaz de crescer em um meio contendo 2,4-D como Ãnica fonte de carbono, expressou proteÃnas de vias de biodegradaÃÃo do 2,4-D, resistÃncia ao estresse quÃmico e aumentou a expressÃo gÃnico de tfdA, o que indica a importÃncia desta bactÃria na biodegradaÃÃo deste poluente. / Burkholderia bacteria it has ability to biodegrade pollutants considered numerous compounds. By the above, this study aimed to identify molecular SMF042 come from an isolated collection of Burkholderia species, verify their ability to biodegrade the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), to identify the enzymes involved in this process by electrophoresis two-dimensional (2D) and to analyze the expression of genes and TFDA tfdB track TFD biodegradation of 2,4-D. In order to make the extraction of RNA and protein bacterial growth was performed in two culture media BH (mineral medium), a control supplemented with glucose (600 mg / L) and another supplemented with 2,4-D (600 mg / L). RNA extraction was performed in the logarithmic phase while protein extraction was done at the beginning of the stationary phase of bacterial growth. The extracted proteins from two-dimensional map was determined for each reference condition. The adjustment of images of two-dimensional gels, the protein spot detection and evaluation of data to determine quantitative and qualitative changes, molecular weight (MW) and isoelectric point (pI) of the spots was made by the ImageMaster software and analysis of gene expression was qRT-PCR performed by using the method of relative expression 2-ΔΔCT. Through the analysis of the 16S rRNA isolate SMF042 was identified as Burkholderia phymatum. Regarding proteomics approach, the average number of spots of the replicas of the gels was 535 (control) and 705 (treated). The most abundant protein in the gels was observed in the range of 20 and 40 MW kDa and pH 5 and 6. Enzymes involved in the biodegradation of 2,4-D were identified using the values of pI and MW of spot against a database of proteins at ExPASy, they were: 2,4-D alpha KG-dependent dioxygenase (TFDA) and chlorocatechol 1 ,2-dioxygenase (tfdC) belonging saw PDT and 2,4-D oxygenase pathway cadRABK, both biodegradation of 2,4-D. Proteins involved in resistance to chemical stress, have also been identified, which are: protein chaperone DnaK and GrpE. The level of gene expression TFDA increased about 23 times compared to control. As shown, the isolated SMF042 was able to grow on a medium containing 2,4-D as sole carbon source expressed protein degradation pathways of 2,4-D, resistance to chemical stress and increased expression of gene TFDA, which indicates the importance of this bacterium in this pollutant biodegradation.

AgÃncia Nacional do PetrÃleo / Devido à futura escassez dos recursos oriundos do petrÃleo e o aumento da poluiÃÃo do ambiente, diversas universidades e empresas estÃo em busca de fontes renovÃveis de energia que possuam um baixo custo. O etanol à um bicombustÃvel renovÃvel em curto prazo e em alguns casos, para sua produÃÃo, sÃo utilizados resÃduos indÃstriais, valorizando ainda mais as qualidades do etanol produzido. Devido as inÃmeras vantagens que esse biocombustÃvel pode apresentar frente aos combustÃveis fosseis faz com que atualmente haja diversas pesquisas para encontrar novas formas baratas para sua produÃÃo, assim, a utilizaÃÃo de matÃrias primas nÃo convencionais vem como um atrativo a mais na produÃÃo de etanol. Neste trabalho utilizou-se glicerol bruto, oriundo da produÃÃo de biodiesel, como fonte de carbono com o objetivo de dar valor agregado a este resÃduo industrial. O glicerol à uma Ãtima fonte de carbono para fermentaÃÃo alcoÃlica, ele possui alto grau de reduÃÃo e um baixo custo, devido principalmente a crescente oferta no mercado mundial. O glicerol à um subproduto da reaÃÃo de transterificaÃÃo de Ãleos vegetais. A cada 10 kg de biodiesel produzidos obtÃm-se 1 kg de glicerol. A produÃÃo de biodiesel esta em constante crescimento devido a crescente demanda por combustÃvel, o que acarreta o crescimento da produÃÃo de glicerol. Para produÃÃo de etanol utilizando este glicerol, realizou-se um estudo com dois microrganismos. Os microrganismos estudados foram uma levedura e uma bactÃria, Saccharomyces sp.1201 e Klebsiella pneumonia ATCC 29665, respectivamente. Nesta dissertaÃÃo, utilizou-se diferentes concentraÃÃes de inÃculo para os cultivos utilizando Saccharomyces sp.1201 e difeentes concentraÃÃes de glicerol para os cultivos que utilizaram Klebsiella pneumonia ATCC 29665. Os resultados com a levedura nÃo foram satisfatÃrios, pois esta levedura nÃo foi capaz de produzir etanol utilizando glicerol como substrato. Jà à bactÃria estudada teve uma boa produÃÃo de etanol e foi capaz de metabolizar o glicerol do meio fermentativo, chegando a produzir cerca de 1,4 g/L de etanol. AlÃm da produÃÃo de etanol, nos ensaios usando a bactÃria Klebsiella pneumonia ATCC 29665, foram obtidos outros dois produtos de valor agregado, 1,3 propanodiol e Ãcido acÃtico. AlÃm do trabalho experiemental, foram realizadas simulaÃÃes da fermentaÃÃo utilizando K. pneumonia, para analisar o seu comportamento da fermentaÃÃo baseado nas variaÃÃes concentraÃÃo de glicerol, concentraÃÃo de inÃculo, bypass e zona morta dentro de reator real. Estas simulaÃÃes visavam analisar as condiÃÃes de operaÃÃo numa futura ampliaÃÃo de escala do processo em escala de laboratÃrio aqui estudado para implantaÃÃo de uma biorrefinaria. O modelo foi ajustado usando valores Ãtimos de volume de reator de 1.500 L e bypass de 0.1 / Due to shortage of energy sources and increasing environmental pollution, many universities and companies are in search to renewable energy. Ethanol can be a renewable biofuel in the short term. Besides the numerous advantages of ethanol over fossil fuels, it can be produced from industrial waste. In this work, it was used glycerol as carbon source in order to give value to this waste. Glycerol can be a good carbon source for fermentation, it has a high degree of reduction and a low cost. There is a large supply of glycerol in the world market, because it is a byproduct of the transterification reaction of vegetable oils, 10 kg biodiesel produced have 1 kg of glycerol. It is known that the production of biodiesel is in constant growth which results in the growth of the production of glycerol. To produce ethanol using glycerol was carried out a study of two microorganisms. The microorganisms studied were a bacterium and a yeast, Saccharomyces sp.1201 and Klebsiella pneumoniae ATCC 29,665 respectively. For this study, it was used different concentrations of inoculum for the runs using Saccharomyces sp.1201 and different concentrations of glycerol for the runs using Klebsiella pneumoniae ATCC 29,665. The results obtained with yeast have not been satisfactory, this yeast was not able to produce ethanol using glycerol as substrate, however, the bacteria studied presented good production of ethanol and was able to metabolize fermentation media with glycerol, up to produce about 1, 4 g / L of ethanol, also obtained as the reaction product of 1.3-propanediol and acetic acid. We also carried out a simulation of fermentation using Klebsiella pneumonia, and analyzed the behavior of the fermentation process based on the following changes of glycerol concentration, inoculum concentration, bypass and the dead zone inside the reactor. With the simulations it was possible to see how the dead zone and very influential on the reactor performance.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / O presente trabalho descreve os resultados da avaliaÃÃo de duas cepas de bactÃrias isoladas a partir de um efluente contaminado com Ãleo, para degradar derivados do petrÃleo e produzir biossurfactantes. AtravÃs de estudos de suas caracterÃsticas morfolÃgicas, culturais, bioquÃmicas e fisiolÃgicas, as bactÃrias selecionadas, nomeadas preliminarmente cepa 03 e cepa 04, foram identificadas como Acinetobacter spp. e Bacillus spp., respectivamente. A capacidade biodegradativa dessas bactÃrias foi avaliada cultivando-as em meio mineral mÃnimo, contendo, sempre, um dos hidrocarbonetos a serem testados, como Ãnica fonte de carbono e energia. As duas bactÃrias degradaram o glicerol, a gasolina, o querosene e o diesel e, produziram biossurfactantes. De maneira geral, as bactÃrias mostraram melhor desempenho na presenÃa de glicerol, como confirmado pelas medidas de densidade celular e atividade emulsificante, enquanto o diesel foi o pior substrato para ambas as bactÃrias. A produÃÃo de biossurfactante foi avaliada medindo-se a sua capacidade para emulsificar o querosene. AtravÃs dessa tÃcnica, encontrou-se um porcentual de 50% de emulsificaÃÃo para os biossurfactantes produzidos pelas duas bactÃrias a partir de glicerol. O Bacillus spp., praticamente, nÃo cresceu e nÃo produziu biossurfactante quando cultivado em meio com diesel, sobrevivendo, contudo, na forma de esporos. A suplementaÃÃo dessa cultura com extrato de levedura 0,04%, entretanto, promoveu a estimulaÃÃo do crescimento e da produÃÃo de biossurfactantes, atingindo um percentual de 95% de emulsificaÃÃo. Os resultados das anÃlises dos biossurfactantes extraÃdos a partir das culturas com glicerol, por espectroscopia infravermelha e anÃlises de carboidratos e proteÃnas, sugerem as classes dos lipossacarÃdios e polipeptÃdios, para os biossurfactantes produzidos pelas bactÃrias Acinetobacter spp. e Bacillus spp., respectivamente. As duas bactÃrias se mostraram suscetÃveis ao calor, sendo destruÃdas à temperatura de 46 ÂC, 1 ppm de hipoclorito de sÃdio e pH abaixo de 5,0. Por outro lado, resistiram a 5% de NaCl, uma caracterÃstica desejÃvel para utilizaÃÃo dessas cepas em situaÃÃes de biorremediaÃÃo de ambientes marinhos contaminados com Ãleo. / The present work describes the results of the evaluation of two bacteria strains isolated from the oil polluted effluent, to degrade petroleum derivatives and to produce biosurfactants. Morphologic, cultural, biochemical and physiologic studies showed that these bacteria, previously denominated strain 03 and strain 04, could be identified as Acinetobacter spp. and Bacillus spp., respectively. The biodegradation potential of these bacteria was evaluated by cultivating them in mineral broth, containing, glycerol, gasoline, kerosene or diesel as the only source of carbon and energy. Both bacteria degraded glycerol, gasoline, kerosene and diesel and produced biosurfactants. In general, the bacteria showed better performances at glycerol presence, as confirmed by the measures of cellular density and emulsificant activity, while the diesel was the worst substrate to both bacteria. The biosurfactant production was evaluated by measuring bacteria capacity for emulsificating kerosene. The results showed an emulsification of 50% for the biosurfactants produced from glycerol by the bacteria. Bacillus spp., practically, did not grow and did not produce biosurfactant when cultivated in medium with diesel, surviving, however, in the spore form. The supplementation of that culture with 0.04 % of yeast extract, however, stimulated the growth and biosurfactants production, reaching 95% of emulsification. The results of the analyses of the biosurfactants extracted from the cultures with glycerol, by infrared spectroscopy and carbohydrate and protein analyses, suggest the classes of the liposaccharides and polypeptides for the biosurfactants produced by the bacteria Acinetobacter spp. and Bacillus spp., respectively. These bacteria were shown to be susceptible to heat, being destroyed at the temperature of 46 ÂC, at 1,0 mg/L of sodium hypochloride and pH below 5.0. On the other hand, they resisted to 5% NaCl, a desirable characteristic for use in marine bioremediation programs.