CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / BactÃrias do gÃnero Burkholderia apresentam como uma das suas aplicaÃÃes biotecnolÃgicas a capacidade de biodegradar compostos xenobiÃticos recalcitrantes. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade da Burkholderia sp. SMF 07 tolerar e utilizar o fenol como Ãnica fonte de carbono e realizar a anÃlise proteÃmica desta bactÃria, em resposta ao fenol, com a finalidade de identificar proteÃnas diferencialmente expressas que estÃo relacionadas à biodegradaÃÃo do fenol, à resposta ao estresse ou ainda, que participem das vias metabÃlicas de produÃÃo de energia para as cÃlulas. A avaliaÃÃo da capacidade da Burkholderia sp. SMF 07 utilizar o fenol como Ãnica fonte de carbono foi realizada a partir na construÃÃo da curva de crescimento em meio mineral (BH). A fim de realizar a extraÃÃo das proteÃnas totais foi realizado o crescimento bacteriano em meio de cultivo TY (Triptone-Yeast Medium), suplementado ou nÃo com 1000 mg/L de fenol, incubado a 28ÂC. A extraÃÃo das proteÃnas totais foi feita apÃs as culturas atingirem o final da fase log do crescimento bacteriano (O.D entre 0,8 e 1,0 e 0,6 e 0,8, para as condiÃÃes controle e fenol, respectivamente). As proteÃnas foram quantificadas pelo mÃtodo de Bradford (1976) e a avaliaÃÃo da pureza das amostras proteicas foi realizada por SDS-PAGE. O mapa protÃico para cada condiÃÃo testada foi determinado a partir da eletroforese bidimensional (2-D). O ajuste das imagens dos gÃis bidimensionais, a detecÃÃo de spots protÃicos e a avaliaÃÃo dos dados para determinaÃÃo de variaÃÃes quantitativas e qualitativas dos spots foi feito pelo programa ImageMasterÂ. A identificaÃÃo das proteÃnas foi feita atravÃs do ExPASy Proteomics Server, utilizando os valores de pI e MW do spot. AtravÃs dos dados obtidos foi possÃvel observar proteÃnas diferencialmente expressas entre os grupos testados. Entre as proteÃnas que apresentaram expressÃo quantitativa aumentada na presenÃa do fenol destaca-se a 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolase, uma enzima envolvida na via meta de degradaÃÃo do fenol. Entre aquelas que apresentaram expressÃo reduzida na presenÃa do fenol se destacam aquelas envolvidas na biossÃntese de nucleotÃdeos e de Ãcidos graxos, molÃculas importantes para o desenvolvimento e manutenÃÃo da estrutura microbiana. As proteÃnas que tiveram sua expressÃo inibida na presenÃa do fenol estavam envolvidas principalmente na biossÃntese de aminoÃcidos, proteÃnas, lipÃdeos, ubiquinona, purinas e pirimidinas; alÃm de participarem do processamento do RNAt, sÃntese do peptideoglicano e na resposta ao estresse. Em conclusÃo, o estudo mostrou que a Burkholderia sp. SMF 07 nÃo foi capaz de utilizar o fenol como Ãnica fonte de carbono, mas apresentou capacidade de tolerar o fenol quando cultivada em meio nutritivo nas concentraÃÃes testadas. AtravÃs da anÃlise proteÃmica concluiu-se que o poluente alterou a expressÃo de proteÃnas importantes para o metabolismo e manutenÃÃo da estrutura celular. / Bacteria of the genus Burkholderia have as one of its biotechnological applications the ability to biodegrade recalcitrant xenobiotic compounds. Thus, this study aimed to evaluate the ability of Burkholderia sp. SMF 07 tolerate and using phenol as the sole carbon source and performing proteomic analysis of this bacterium, in response to phenol, in order to identify differentially expressed proteins that are related to biodegradation of phenol, the stress response or metabolic pathways involving the production of energy for cells. The evaluation of the capacity of Burkholderia sp. SMF 07 using phenol as the sole carbon source was based on the construction of the curve of growth in mineral medium (BH). For extraction of total proteins was performed bacterial growth in culture medium TY (Triptone-Yeast Medium), supplemented or not with 1000 mg/L phenol, incubated at 28ÂC. The extraction of total proteins was done after the cultures reached the end of the log phase of bacterial growth (O.D between 0.8 and 1.0 and 0.6 and 0.8 for the control conditions and phenol, respectively). The proteins were quantified by the Bradford method (1976) and assessment of protein purity of the samples was performed by SDS-PAGE. The protein map for each tested condition was determined from two-dimensional electrophoresis (2-D). The adjustment of two-dimensional images of the gels, the detection of protein spots, and data evaluation to determine quantitative and qualitative changes of spots was made by the ImageMaster  software. The identification of proteins was performed using the ExPASy Proteomics Server, using the values of pI and MW of spot. Through the data obtained was observed differentially expressed proteins between the groups tested. Among the proteins that showed increased expression quantitative in the presence of phenol is highlight 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase, an enzyme involved in the degradation meta pathway phenol. Among those that showed decreased expression in the presence of phenol are highlights those involved in the biosynthesis of nucleotides and fatty acids, molecules important to the development and maintenance of microbial structure. Proteins which have inhibited its expression in the presence of phenol were mainly involved in the biosynthesis of amino acids, proteins, lipids, ubiquinone, purines and pyrimidines; beyond participate processing of tRNA, peptidoglycan synthesis, and in the stress response. In conclusion, the study showed that Burkholderia sp. SMF 07 not been able to utilize phenol as the sole carbon source but showed the ability to tolerate phenol when grown in nutrient medium at the concentrations tested. Through proteomic analysis was concluded that the pollutant alter the expression of proteins important for metabolism and maintenance of cellular structure.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O tÃxon genÃrico Burkholderia apresenta grande diversidade metabÃlica, possibilitando que estas proteobactÃrias vivam numa variedade de habitats, dentre os quais destacamos o solo, Ãgua (incluindo Ãgua do mar), plantas, fungos, animais e atà mesmo seres humanos. Uma das aplicaÃÃes biotecnolÃgicas mais marcantes à a capacidade de promover a biodegradaÃÃo de poluentes. Assim, este estudo visou a identificaÃÃo do isolado de Burkholderia SMF 090, bem como a avaliaÃÃo do potencial na utilizaÃÃo da gasolina como fonte de carbono e a identificaÃÃo de vias metabÃlicas possivelmente envolvidas na degradaÃÃo dos componentes da gasolina atravÃs da realizaÃÃo de anÃlises proteÃmicas. A identificaÃÃo do isolado SMF 090 e anÃlise da filogenia molecular foi realizada pelo sequenciamento do gene 16S rRNA. Posteriormente, foram realizadas anÃlises de filogenia molecular e reconstruÃÃo de Ãrvores filogenÃticas com outras bactÃrias do gÃnero. Para a caracterizaÃÃo do perfil de crescimento do isolado SMF 090 foram realizadas curvas de crescimento em meio nutritivo (TY), meio sem fonte de carbono (BH), BH suplementado com gasolina comercial e BH suplementado com D-glicose. O estudo das proteÃnas diferencialmente expressas ocorreu atravÃs de eletroforese bidimensional, de espectrometria de massa e anÃlises de bioinfomÃtica. AtravÃs da anÃlise do 16S rDNA, sugeriu-se que SMF 090 està relacionada à Burkholderia sabiae Br3407 e ambos descendem de um ancestral comum recente. A bactÃria estudada foi capaz de crescer em meio mineral contendo gasolina como Ãnica fonte de carbono. Foi possÃvel observar proteÃnas diferencialmente expressas entre os grupos testados, as quais podem estar associadas ao metabolismo de degradaÃÃo de hidrocarbonetos. As anÃlises dos gÃis de 2DE e os dados de espectrometria de massas permitiram a identificaÃÃo de vÃrias proteÃnas das vias de catabolismo dos hidrocarbonetos aromÃticos monocÃclios e policÃclicos. Portanto, o estudo apresentou informaÃÃes relevantes sobre o metabolismo de Burkholdeiras como potenciais biodegradadoras de gasolina. / The generic taxon Burkholderia presents a high metabolic diversity that allows these protobacteria live in a wide range of habitats, among these are the soil, water (including sea water), plants, fungi, animals and even humans. A remarkable biotechnological application is the capacity to promote the pollutants biodegradation. Thus, this study aimed the identification of Burkhoderia SMF 090 isolate, as well the evaluation of its potential on the utilization of gasoline as a carbon source and the identification of metabolic pathways possibly involved in the degradation of gasoline on its components through realization of proteomic analysis. The identification of the SMF 090 isolate and the analysis of molecular phylogeny were carried out by 16S rRNA gene sequencing. In addition, the molecular phylogeny was analyzed and phylogenetic trees were reconstructed using other bacteria from the same genus. In order to characterize the growth pattern of SMF 090, bacterial growth curves were assessed using the media TY (a nutritive media), BH (a medium without carbon), BH plus commercial gasoline and BH plus D-glucose. The study of differentially expressed proteins was performed using bidimensional electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics analysis. After the 16S rRNA analysis was suggested that SMF 090 is related to Burkholderia sabiae Br3407 and both descended from a recent common ancestral. The strain grown in mineral media containing gasoline as the unique carbon source. Differentially expressed proteins were observed between the tested groups and these proteins may be associated to the metabolic degradation of hydrocarbons. The analysis of data provided by 2DE electrophoresis and mass spectrometry allowed the identification of various proteins related to the monocyclic and polycyclic aromatic hydrocarbons catabolism pathway. Therefore, this study showed relevant results about the growth of Burkholderia as a potential gasoline biodegradant.

O Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica mais prevalente na América Latina. Este trabalho teve como objetivo atenuar a forma leveduriforme do P. brasiliensis por irradiação gama para estudos posteriores na pesquisa de vacina. Atualmente não há nenhuma vacina eficaz. As culturas do P.brasiliensis (cepa Pb-18) foram irradiadas com doses entre 0,5 e 8,0kGy. Depois de cada dose os fungos foram plaqueados e após 10 dias as unidades formadoras de colônias (UFC) contadas. A viabilidade das células irradiadas foi avaliada utilizando-se os corantes verde Janus e azul de metileno. A síntese de proteína foi analisada pela incorporação 35S- Metionina. A comparação entre o perfil antigênico das leveduras controle e irradiadas foi feita através do Western blot e a atenuação da virulência foi analisada através da inoculação dessas leveduras em camundongos C57Bl/J6 and Balb/c. Mudanças morfológicas nas leveduras irradiadas foram avaliadas por microscopia eletrônica (transmissão e varredura), e a integridade do DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose. Na dose de 6,5kGy as leveduras perderam a capacidade reprodutiva. A viabilidade e a incorporação de 35S- Metionina foi similar nos controles e nas células irradiadas com 6,5kGy, mas nesta dose as leveduras secretaram 40% menos proteína. O DNA apresentou-se degradado e esse dano não foi reparado O perfil do Western blot das leveduras controle, foi idêntico aos das leveduras irradiadas com 6,5kGy. Nenhuma UFC foi recuperada dos tecidos dos camundongos infectados com a levedura radioatenuada. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou significativas alterações no núcleo das células irradiadas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que duas horas após a irradiação as células apresentavam-se colapsadas e com dobras profundas na superfície das células, entretanto esses danos foram reversíveis. Concluiu-se que para as células leveduriformes do P. brasiliensis foi possível encontrar uma dose na qual o patógeno perdeu sua capacidade reprodutiva e virulência, enquanto reteve sua viabilidade, atividade metabólica e perfil antigênico. / Paracoccidioides brasiliensis is the agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent mycosis in Latin America, and currently there is no effective vaccine. The aim of this work was to attenuate the yeast form of P. brasiliensis by gamma irradiation for further studies on vaccine research. P. brasiliensis (strain Pb-18) cultures were irradiated at doses between 0.5 and 8.0kGy. After each dose the fungal cells were plated and after 10 days the colony forming units (CFU) counted. The viability of the irradiated cells was measured using the dyes Janus green and methylene blue, and protein synthesis by incorporation of L 35S methionine. The comparison between the antigenic profile of irradiated and control yeast was made by Western blot and the virulence evaluated by the inoculation in C57Bl/J6 and Balb/c mice. Morphological changes in irradiated yeast were evaluated by electronic microscopy and DNA integrity by electrophoresis in agarose gel. At 6.5kGy the yeast lost the reproductive capacity. The viability and the incorporation of L-35S methionine were the same in control and up to 6.5kGy irradiated cells, but 6.5kGy irradiated yeast secreted 40% less proteins. The Western blot profile was clearly similar in control and 6.5kGy irradiated yeast. No CFU could be recovered from the tissues of the mice infected with the radioattenuated yeast. At the dose of 6.5kGy the DNA was degraded and this damage was not repaired. The transmission electronic microscopy showed significant alterations in the nucleus of the irradiated cells. The scanning electronic microscopy showed that two hours after the irradiation the cells were collapsed or presented deep folds in the surface, however these injury were reversible. We concluded that for P. brasiliensis yeastcells it was possible to find a dose in which the pathogen loses its reproductive ability and virulence, while retaining its viability, metabolic activity and the antigenic profile.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o principal causador da tuberculose (TB), continua a representar um grave problema de saúde pública, principalmente em países de baixa e média renda. Estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mtb, com aproximadamente oito milhões de casos novos e quase três milhões de mortes anualmente por TB. Após a infecção pelo Mtb, a resposta imune desempenha papel preponderante para impedir o inicio da doença infecciosa, a TB, bem como de seu curso. Assim, os oxidantes (espécies reativas do oxigênio/nitrogênio [EROs/ERNs]) gerados no burst oxidativo de células fagocíticas como, os neutrófilos, são essenciais para uma efetiva resposta ao patógeno. O uso indiscriminado de suplementação antioxidante, atualmente muito comum entre a população, ou o uso terapêutico durante o tratamento da TB, poderia comprometer a resposta imune frente às micobactérias, portanto, predispondo a uma maior susceptibilidade ao Mtb e/ou TB. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi investigar ex vivo a influência do antioxidante sintético da classe dos nitróxidos, o 4-Hidroxi-2,2´,6,6´-tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempol), sobre a resposta microbicida de neutrófilos contra M. tuberculosis. Neutrófilos humanos foram isolados por gradiente de densidade a partir de sangue total de voluntários saudáveis. Para avaliar o burst oxidativo na ausência ou presença do Tempol, M. tuberculosis H37Ra (ATCC 35177) foi incubado a 37 ºC com neutrófilos a multiplicidades de infecções (MOI) variando de 1 a 100. A liberação de anions superóxido (O2•-) pelos neutrófilos foi avaliada através do ensaio de redução do citocromo c. O ensaio de quimioluminescência amplificada com o Luminol foi utilizado para avaliar EROs/ERNs total e com Isoluminol para extracelular. Complementarmente, o ensaio de killing foi realizado para verificar a capacidade microbicida total dos neutrófilos tratados ou não com Tempol. Neste teste, foi adotado o protocolo "dois passos", em que, Mtb foi incubado com neutrófilos (por 10, 30 e 90 min a 37 ºC) e, através de uma centrifugação diferencial (100 x g, 5 min) e lise dos neutrófilos com H2O pH 11, as micobactérias intracelular e extracelular foram quantificadas e os resultados reportados em Unidades Formadoras de Colônia (UFC), após uma incubação das micobactérias por 21 dias a 37 ºC. Através deste protocolo, as taxas de fagocitose (Kp) e morte intracelular (Kk) do Mtb foram calculadas. Paralelamente foi avaliada a possível atividade tóxica do Tempol sobre neutrófilos, tendo sido observado que Tempol a uma concentração de 500 µM não foi citotóxico. O burst oxidativo dos neutrófilos contra Mtb foi significativamente diminuído na presença do Tempol (450 µM, p < 0,05) para todos os oxidantes avaliados. Esta concentração também foi capaz de diminuir a capacidade microbicida dos neutrófilos, em que o número de UFC de M. tuberculosis no grupo tratado com Tempol foi significativamente maior que no grupo controle (p < 0,05). Curiosamente, Tempol diminuiu o KK dos neutrófilos, mas não teve nenhum efeito sobre a seu Kp. Este estudo fornece informações sobre a influência de antioxidantes sobre a resposta imune contra o M. tuberculosis, de modo que as implicações clínicas para a prevenção e tratamento da tuberculose deve levar em conta estes achados. / Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the main cause of tuberculosis (TB), remains as a serious public health problem, chiefly in low- to middle-income countries. It is estimated that about one-third of the world's population has latent TB, with about eight million new cases and roughly three million deaths each year from TB. The innate immune response following Mtb infection plays a crucial role in preventing the onset of active TB, as well as its course. Thus, phagocytes-derived reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS) during the oxidative burst (e.g., generated by neutrophils) are essential to an effective response to the pathogen. The indiscriminate use of antioxidant supplements, currently very common among the population, or their use as adjuvant therapy during TB treatment, could compromise the immune response to Mtb accordingly potentially increasing the host's susceptibility to Mtb/TB. In this context, the aim of this study was to investigate the ex vivo effect of the cyclic nitroxide tempol (4-hydroxy-2,2,6,6-tetra-methyl-1-piperidinyloxy), an antioxidant with superoxide dismutase mimetic properties, on the microbicide response of neutrophils against M. tuberculosis. Human neutrophils were isolated from venous blood of healthy volunteers by Ficoll density gradient centrifugation. To assess the oxidative burst in the absence or presence of Tempol, M. tuberculosis H37Ra (ATCC 35177) was incubated at 37 ° C with neutrophils at multiplicity of infection (MOI) ranging from 1 to 100. ROS generation (O2•-) by neutrophils was evaluated by using the cytochrome c reduction assay. The total and extracellular ROS were determined using the luminol- and Isoluminol-amplified chemiluminescence assay. Complementarily, the killing assay was performed to check the total microbicide capacity of neutrophils treated or not with Tempol. In this test, the "two-step" protocol was adopted in which, Mtb was incubated with neutrophils (for 10, 30, and 90 min at 37 °C) and, by differential centrifugation (100 x g 5 min) and lysis of neutrophils with H2O pH 11, the intracellular and extracellular mycobacteria were incubated for 21 days at 37 ° C and, mycobacteria were quantified and results the ensuing reported as number of Colony Forming Units (CFU). Through this protocol, were calculated the phagocytosis (Kp) and intracellular killing (Kk) rates for M. tuberculosis. The possible toxic activity of Tempol was evaluated on neutrophils and, was observed that 500 µM tempol was not cytotoxic. The oxidative burst of neutrophils against Mtb was significantly decreased in the presence of 450 µM Tempol, for all evaluated oxidants (p < 0.05). Treatment of neutrophils with 450 µM Tempol decreased the total microbicidal activity against M. tuberculosis, since colony-forming units of these mycobacteria in the treated group were significantly higher than those for the untreated group (p < 0.05). Strikingly, Tempol (450 µM) decreased the kk of neutrophils, but had no effect on their kp. This study provides insights of the influence of antioxidants on the immune response to M. tuberculosis, so that clinical implications for the prevention and treatment of TB should take into account these findings. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, possui um ciclo de vida complexo, deve lidar com diversas condições do ambiente e depende dos hospedeiros para suprir suas necessidades nutricionais. Uma delas é a necessidade de captar a molécula de heme (Fe-protoporfirina IX) que será utilizada como fator de crescimento. Os mecanismos envolvendo o metabolismo de heme são cruciais para a sobrevivência do T. cruzi pois o parasito não possui várias enzimas de biossíntese dessa porfirina e o heme livre pode apresentar citotoxicidade para célula. Na tentativa de perseguir o destino final do heme no parasito, nós estudamos essa via inexplorada no T. cruzi. Nessa tese, nós demonstramos que epimastigotas cultivados com heme, produziram os compostos, &#945;-meso hidroxiheme, verdoheme e biliverdina (identificados por HPLC acoplado á espectrofotômetria). Além disso, nós observamos através de análise dos extratos de epimastigotas no espectrômetro de massas (LQT Orbitrap), espécies iônicas de m/z 583,4 e m/z 619,3. A fragmentação subsequente desses íons originaram espécies filhas típicas das moléculas de biliverdina e verdoheme, respectivamente. Nós observamos também, espécies iônicas de m/z 1397,4 e m/z 1135,4. A fragmentação dessas espécies produziram íons, sendo um deles com a mesma massa molecular de heme (m/z 616,3). Essa espécie iônica por sua vez, gerou fragmentos iônicos idênticos a uma molécula de heme, confirmando que esses intermediários são produtos da modificação da porfirina. Baseado nesses resultados, nós propomos um modelo onde o catabolismo de heme em T. cruzi, envolveria a conjugação da bis(glutationil)spermina, um derivado da tripanotiona presente em tripanossomatídeos, à porfirina (m/z 1137,4), seguido da remoção de dois resíduos de ácidos glutâmicos (m/z 1135,4). Embora o significado bioquímico e fisiológico da adição desse resíduo tiol na molécula de heme ainda é pouco compreendido, alguns trabalhos demonstram a abilidade desses compostos em ligar na porfirina, sem contar também, que esse heme conjugado poderia resultar em uma forma efetiva de prevenção de danos à membrana e a célula ocasionados pelo acúmulo de heme livre. Em conjunto, esses resultados fornecem novas abordagens do metabolismo de heme em T. cruzi, revelando possíveis alvos de intervenção quimioterápica futuros. Nossa proposta está direcionada para uma via ativa de catabolismo de heme que inclui a adição de grupos tiol (derivado da tripanotiona) à heme e a clivagem do anel porfirínico originando a molécula de biliverdina. / Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease, has a complex life cycle and they must cope with diverse environmental conditions and depends on hosts for its nutritional needs. One of the nutritional characteristic is that they need a heme compound (Fe-protoporphyrin IX) as a growth factor. The mechanisms involved in these processes are crucial for their survival mainly because of trypanosomatids lack of the complete heme biosynthetic pathway and the cytotoxic activity of free heme. Following the fate of this porphyrin in the parasite we studied this missing pathway in T. cruzi. Here, we show that epimastigotes cultivated with heme yielded the compounds, &#945;-meso hydroxyheme, verdoheme and biliverdin (as determined by HPLC with diode array detector). Furthermore, we observed ion species of m/z 583.4 and m/z 619.3 from epimastigotes extracts detected by direct infusion on LQT Orbitrap platform. A tipical biliverdin and verdoheme doughter-ion species were generated by m/z 583.4 and m/z 619.3 fragmentations, respectively. We also observed an ion species at m/z 1397.4 and m/z 1135. The subsequent fragmentation of this species produced a daughter-ions whose one with the same molecular mass as heme (m/z 616.4). This species, in turn, generated daughter species identical to an authentic heme, confirming that these intermediates were modified heme products. Based on these findings, we propose that heme catabolism in T. cruzi involves a additions of Bis(glutathionyl)spermine, a low molecular mass thiols occurring in trypanosomatids, to heme (m/z 1397.4), followed by removal of the glutamic residues (m/z 1135). Although the biochemical and physiological significance of the addition of thiol residues to heme molecule is underexplored, some works, already demonstrated their ability to bind heme and also this modified heme may resulting in the effective prevention of membrane damage and cytotoxicity by the heme accumulation. Taken together, these results offer new insights into heme metabolism in T. cruzi, revealing potential future therapeutic targets. We propose an active heme catabolism pathway that includes a trypanotione derivate additions and cleavage of the heme porphyring ring to biliverdin.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / As formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi proliferam e se diferenciam no interior de diferentes compartimentos do trato digestivo dos triatomíneos. Esses ambientes antagônicos, no que diz respeito à concentração de nutrientes, pH e status redox, constituem um desafio para o protozoário por conterem moléculas e fatores capazes de deflagrar diferentes sinalizações e respostas no parasito. Por isso, testamos a influência de produtos abundantes do metabolismo do vetor e de status redox distintos, frente aos processos de proliferação e diferenciação in vivo e in vitro. Como exemplo temos o heme e a hemozoína, subprodutos da digestão da hemoglobina, e o urato, rico na urina dos insetos. O heme é uma importante molécula em todos os seres vivos. Nosso grupo mostrou seu papel na proliferação in vitro de T. cruzi e que esse sinal é governado pela enzima redox-sensível CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Esse efeito parece depender de uma sinalização redox, onde o heme e não seus análigos induz a formação de EROs, modulando a atividade da CaMKII (Nogueira et al, 2011). Apesar de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) em formas epimastigotas, o heme não alterou a ultraestrutura desses parasitos mostrando uma adaptação a ambientes oxidantes. Além disso, a adição de FCCP inibiu a formação de EROs mitocondrial, diminuindo a proliferação dos parasitos. Em contrapartida, a AA aumentou drasticamente a produção de EROs mitocondrial levando à morte dos epimastigotas. Estes resultados confirmam a hipótese de regulação redox do crescimento de epimastigotas. A formação de &#946;- hematina (hemozoína) constitui uma elegante estratégia para minimizar o efeito tóxico do heme nos insetos hematófagos. Contudo, a &#946;-hematina não influenciou a proliferação ou a metaciclogênese in vitro. Já o urato, e outros antioxidantes clássicos como o GSH e o NAC prejudicaram a proliferação in vitro de epimastigotas. Estes efeitos foram parcialmente revertidos quando os antioxidantes foram incubados juntamente com o heme. Durante a metaciclogênese in vitro, o NAC e o urato induziram um aumento significativo das formas tripomastigotas e levaram a diminuição da porcentagem de formas epimastigotas. Em contrapartida, o heme e a &#946;-hematina apresentaram o efeito oposto, diminuindo a porcentagem de formas tripomastigotas e aumentando a de epimastigotas. No intuito de confirmar a influencia do status redox na biologia do parasito in vivo, nós quantificamos a carga parasitária nas porções anterior e posterior e no reto do triatomíneo alimentado na presença ou na ausência de NAC e urato por qPCR. O tratamento com os antioxidantes aumentou a carga parasitária em todas as partes do intestino analisadas. Posteriormente, para diferenciar as formas evolutivas responsáveis pelo incremento da carga parasitária, foram realizadas contagens diferenciais nas mesmas porções do intestino do inseto vetor. Cinco dias após a infecção foi observado aumento significativo de formas tripomastigotas e diminuição de formas epimastigotas in vivo. Em conjunto, estes dados sugerem que, assim como a concentração de nutrientes e o pH, o status redox também pode influenciar a biologia do T. cruzi no interior do inseto vetor. Neste cenário, moléculas oxidantes agiriam a favor da proliferação, e em contraste, antioxidantes parecem favorecer a metaciclogênese. / Trypanosoma cruzi epimastigotes proliferate and differentiate inside different compartments of the triatomines gut. These environments are antagonic in terms of nutrient content, pH and redox status. All these factors represent a challenge to the protozoan due to the presence of molecules and factors which are able to induce different signals to the parasite. Thus, we tested the influence of abundant metabolism products of the vector, with distinct redox status, in the proliferation and metacyclogenesis in vitro and in vivo. These molecules are heme and hemozoin, both byproducts of hemoglobin digestion, and urate, present in the urine of insects. Heme is a ubiquitous molecule present in all living organisms. Our group studied its role in T. cruzi growth in vitro, showing that this signal is governed by the redox-sensitive enzyme CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Indeed, it seems to rely on a redox signaling pathway in which heme, but not its analogs, induces ROS formation, thus modulating CaMKII activity (Nogueira et al., 2011). Although it induces ROS in epimastigotes, the heme molecule had no deleterious effect upon the parasites ultrastructure, suggesting an adaptation to oxidative environments. In addition, FCCP inhibited mitochondrial ROS formation, then decreasing the parasite proliferation. On the other hand, AA drastically increased mitochondrial ROS production leading to cell death. These results corroborate the hypothesis of redox regulation of epimastigotes proliferation. Hemozoin (&#946;- hematin) formation is an elegant strategy to minimize the toxic effect of heme in hematophagous insects. However, &#946;-hematin had no influence upon the proliferation or metacyclogenesis in vitro. Also, urate, GSH and NAC impaired epimastigote proliferation. These effects were partially reversed when the antioxidants were incubated along with heme. During metacyclogenesis in vitro, NAC and urate induced a significant increment of trypomastigotes and decreased the percentage of epimastigotes. Heme and &#946;-hematin presented the opposite effect diminishing the percentage of trypomastigotes and increasing the percentage of epimastigotes. To confirm the influence of the redox status in the parasite biology in vivo, we quantified the parasite loads in the anterior and posterior midguts and in the rectum of the triatomine vector fed with or without NAC and urate by qPCR. The treatment with the antioxidants increased the parasite loads in all midgut sections analyzed. Afterwards, in order to distinguish the evolutive forms responsible for the increment of parasite loads, we performed differential counting of the midgut sections. Five days post infection we observed an increment of trypomastigotes and a decrease of epimastigote forms in vivo. Taken together, these data suggests that, as well as nutrient content and pH, the redox status may also influence T. cruzi biology in the vector. In this scenario, oxidants act to turn on proliferation and in contrast, antioxidants seem to switch the cycle towards metacyclogenesis.

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, possui um ciclo de vida complexo, deve lidar com diversas condições do ambiente e depende dos hospedeiros para suprir suas necessidades nutricionais. Uma delas é a necessidade de captar a molécula de heme (Fe-protoporfirina IX) que será utilizada como fator de crescimento. Os mecanismos envolvendo o metabolismo de heme são cruciais para a sobrevivência do T. cruzi pois o parasito não possui várias enzimas de biossíntese dessa porfirina e o heme livre pode apresentar citotoxicidade para célula. Na tentativa de perseguir o destino final do heme no parasito, nós estudamos essa via inexplorada no T. cruzi. Nessa tese, nós demonstramos que epimastigotas cultivados com heme, produziram os compostos, &#945;-meso hidroxiheme, verdoheme e biliverdina (identificados por HPLC acoplado á espectrofotômetria). Além disso, nós observamos através de análise dos extratos de epimastigotas no espectrômetro de massas (LQT Orbitrap), espécies iônicas de m/z 583,4 e m/z 619,3. A fragmentação subsequente desses íons originaram espécies filhas típicas das moléculas de biliverdina e verdoheme, respectivamente. Nós observamos também, espécies iônicas de m/z 1397,4 e m/z 1135,4. A fragmentação dessas espécies produziram íons, sendo um deles com a mesma massa molecular de heme (m/z 616,3). Essa espécie iônica por sua vez, gerou fragmentos iônicos idênticos a uma molécula de heme, confirmando que esses intermediários são produtos da modificação da porfirina. Baseado nesses resultados, nós propomos um modelo onde o catabolismo de heme em T. cruzi, envolveria a conjugação da bis(glutationil)spermina, um derivado da tripanotiona presente em tripanossomatídeos, à porfirina (m/z 1137,4), seguido da remoção de dois resíduos de ácidos glutâmicos (m/z 1135,4). Embora o significado bioquímico e fisiológico da adição desse resíduo tiol na molécula de heme ainda é pouco compreendido, alguns trabalhos demonstram a abilidade desses compostos em ligar na porfirina, sem contar também, que esse heme conjugado poderia resultar em uma forma efetiva de prevenção de danos à membrana e a célula ocasionados pelo acúmulo de heme livre. Em conjunto, esses resultados fornecem novas abordagens do metabolismo de heme em T. cruzi, revelando possíveis alvos de intervenção quimioterápica futuros. Nossa proposta está direcionada para uma via ativa de catabolismo de heme que inclui a adição de grupos tiol (derivado da tripanotiona) à heme e a clivagem do anel porfirínico originando a molécula de biliverdina. / Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease, has a complex life cycle and they must cope with diverse environmental conditions and depends on hosts for its nutritional needs. One of the nutritional characteristic is that they need a heme compound (Fe-protoporphyrin IX) as a growth factor. The mechanisms involved in these processes are crucial for their survival mainly because of trypanosomatids lack of the complete heme biosynthetic pathway and the cytotoxic activity of free heme. Following the fate of this porphyrin in the parasite we studied this missing pathway in T. cruzi. Here, we show that epimastigotes cultivated with heme yielded the compounds, &#945;-meso hydroxyheme, verdoheme and biliverdin (as determined by HPLC with diode array detector). Furthermore, we observed ion species of m/z 583.4 and m/z 619.3 from epimastigotes extracts detected by direct infusion on LQT Orbitrap platform. A tipical biliverdin and verdoheme doughter-ion species were generated by m/z 583.4 and m/z 619.3 fragmentations, respectively. We also observed an ion species at m/z 1397.4 and m/z 1135. The subsequent fragmentation of this species produced a daughter-ions whose one with the same molecular mass as heme (m/z 616.4). This species, in turn, generated daughter species identical to an authentic heme, confirming that these intermediates were modified heme products. Based on these findings, we propose that heme catabolism in T. cruzi involves a additions of Bis(glutathionyl)spermine, a low molecular mass thiols occurring in trypanosomatids, to heme (m/z 1397.4), followed by removal of the glutamic residues (m/z 1135). Although the biochemical and physiological significance of the addition of thiol residues to heme molecule is underexplored, some works, already demonstrated their ability to bind heme and also this modified heme may resulting in the effective prevention of membrane damage and cytotoxicity by the heme accumulation. Taken together, these results offer new insights into heme metabolism in T. cruzi, revealing potential future therapeutic targets. We propose an active heme catabolism pathway that includes a trypanotione derivate additions and cleavage of the heme porphyring ring to biliverdin.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / As formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi proliferam e se diferenciam no interior de diferentes compartimentos do trato digestivo dos triatomíneos. Esses ambientes antagônicos, no que diz respeito à concentração de nutrientes, pH e status redox, constituem um desafio para o protozoário por conterem moléculas e fatores capazes de deflagrar diferentes sinalizações e respostas no parasito. Por isso, testamos a influência de produtos abundantes do metabolismo do vetor e de status redox distintos, frente aos processos de proliferação e diferenciação in vivo e in vitro. Como exemplo temos o heme e a hemozoína, subprodutos da digestão da hemoglobina, e o urato, rico na urina dos insetos. O heme é uma importante molécula em todos os seres vivos. Nosso grupo mostrou seu papel na proliferação in vitro de T. cruzi e que esse sinal é governado pela enzima redox-sensível CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Esse efeito parece depender de uma sinalização redox, onde o heme e não seus análigos induz a formação de EROs, modulando a atividade da CaMKII (Nogueira et al, 2011). Apesar de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) em formas epimastigotas, o heme não alterou a ultraestrutura desses parasitos mostrando uma adaptação a ambientes oxidantes. Além disso, a adição de FCCP inibiu a formação de EROs mitocondrial, diminuindo a proliferação dos parasitos. Em contrapartida, a AA aumentou drasticamente a produção de EROs mitocondrial levando à morte dos epimastigotas. Estes resultados confirmam a hipótese de regulação redox do crescimento de epimastigotas. A formação de &#946;- hematina (hemozoína) constitui uma elegante estratégia para minimizar o efeito tóxico do heme nos insetos hematófagos. Contudo, a &#946;-hematina não influenciou a proliferação ou a metaciclogênese in vitro. Já o urato, e outros antioxidantes clássicos como o GSH e o NAC prejudicaram a proliferação in vitro de epimastigotas. Estes efeitos foram parcialmente revertidos quando os antioxidantes foram incubados juntamente com o heme. Durante a metaciclogênese in vitro, o NAC e o urato induziram um aumento significativo das formas tripomastigotas e levaram a diminuição da porcentagem de formas epimastigotas. Em contrapartida, o heme e a &#946;-hematina apresentaram o efeito oposto, diminuindo a porcentagem de formas tripomastigotas e aumentando a de epimastigotas. No intuito de confirmar a influencia do status redox na biologia do parasito in vivo, nós quantificamos a carga parasitária nas porções anterior e posterior e no reto do triatomíneo alimentado na presença ou na ausência de NAC e urato por qPCR. O tratamento com os antioxidantes aumentou a carga parasitária em todas as partes do intestino analisadas. Posteriormente, para diferenciar as formas evolutivas responsáveis pelo incremento da carga parasitária, foram realizadas contagens diferenciais nas mesmas porções do intestino do inseto vetor. Cinco dias após a infecção foi observado aumento significativo de formas tripomastigotas e diminuição de formas epimastigotas in vivo. Em conjunto, estes dados sugerem que, assim como a concentração de nutrientes e o pH, o status redox também pode influenciar a biologia do T. cruzi no interior do inseto vetor. Neste cenário, moléculas oxidantes agiriam a favor da proliferação, e em contraste, antioxidantes parecem favorecer a metaciclogênese. / Trypanosoma cruzi epimastigotes proliferate and differentiate inside different compartments of the triatomines gut. These environments are antagonic in terms of nutrient content, pH and redox status. All these factors represent a challenge to the protozoan due to the presence of molecules and factors which are able to induce different signals to the parasite. Thus, we tested the influence of abundant metabolism products of the vector, with distinct redox status, in the proliferation and metacyclogenesis in vitro and in vivo. These molecules are heme and hemozoin, both byproducts of hemoglobin digestion, and urate, present in the urine of insects. Heme is a ubiquitous molecule present in all living organisms. Our group studied its role in T. cruzi growth in vitro, showing that this signal is governed by the redox-sensitive enzyme CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Indeed, it seems to rely on a redox signaling pathway in which heme, but not its analogs, induces ROS formation, thus modulating CaMKII activity (Nogueira et al., 2011). Although it induces ROS in epimastigotes, the heme molecule had no deleterious effect upon the parasites ultrastructure, suggesting an adaptation to oxidative environments. In addition, FCCP inhibited mitochondrial ROS formation, then decreasing the parasite proliferation. On the other hand, AA drastically increased mitochondrial ROS production leading to cell death. These results corroborate the hypothesis of redox regulation of epimastigotes proliferation. Hemozoin (&#946;- hematin) formation is an elegant strategy to minimize the toxic effect of heme in hematophagous insects. However, &#946;-hematin had no influence upon the proliferation or metacyclogenesis in vitro. Also, urate, GSH and NAC impaired epimastigote proliferation. These effects were partially reversed when the antioxidants were incubated along with heme. During metacyclogenesis in vitro, NAC and urate induced a significant increment of trypomastigotes and decreased the percentage of epimastigotes. Heme and &#946;-hematin presented the opposite effect diminishing the percentage of trypomastigotes and increasing the percentage of epimastigotes. To confirm the influence of the redox status in the parasite biology in vivo, we quantified the parasite loads in the anterior and posterior midguts and in the rectum of the triatomine vector fed with or without NAC and urate by qPCR. The treatment with the antioxidants increased the parasite loads in all midgut sections analyzed. Afterwards, in order to distinguish the evolutive forms responsible for the increment of parasite loads, we performed differential counting of the midgut sections. Five days post infection we observed an increment of trypomastigotes and a decrease of epimastigote forms in vivo. Taken together, these data suggests that, as well as nutrient content and pH, the redox status may also influence T. cruzi biology in the vector. In this scenario, oxidants act to turn on proliferation and in contrast, antioxidants seem to switch the cycle towards metacyclogenesis.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A Esporotricose é uma infecção subaguda ou crônica causada pelo fungo Sporothrix schenckii. A transmissão zoonótica pode ocorrer depois de arranhões ou mordidas de animais, principalmente gatos, roedores e tatus. Até o momento, nenhuma vacina esta em uso para esporotricose ou para qualquer infecção fúngica de importância médica, indicando a necessidade de ampliar a investigação neste campo e explorar novas alternativas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da radiação gama em leveduras de S. schenckii, visando a sua atenuação, para aplicação posterior de leveduras radioatenuadas no desenvolvimento de uma vacina destinada a imunização de gatos e cães. As leveduras S. schenckii foram cultivadas em meio sólido BHI (Infuso Cérebro e Coração) suplementados com tiamina e na temperatura de 36oC. As culturas foram irradiadas com doses variando de 1,0 a 9,0 kGy. Após cada dose foram avaliados a capacidade reprodutiva, a viabilidade, e o metabolismo de síntese de proteínas. A avaliação da virulência foi realizada pela inoculação das leveduras irradiadas em camundongos Balb/c imunossuprimidos e posterior recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs). A integridade do DNA, a ocorrência de apoptose e de alterações ultraestruturais também foram analisada nas leveduras radioatenuadas. Os resultados mostraram uma redução de 6 ciclos log10 no número de UFCs recuperadas na dose de 6,0 kGy e a partir de 8,0 kGy não foram recuperadas UFCs. A análise de viabilidade indicou que as leveduras permaneceram viáveis até a dose de 9,0 kGy, a maior dose testada. As leveduras irradiadas mantiveram a capacidade de síntese de proteínas, porém esta foi reduzida significarivamente na dose de 9,0 kGy, quando avaliada 24 horas após a irradiação. Os ensaios de virulência utilizando leveduras irradiadas com as doses de 7,0 e 9,0 kGy mostraram que não houve recuperação de UFCs dos órgãos dos camundongos imunossuprimidos, indicando que as células estavam atenuadas. O ensaio de integridade do DNA mostrou que com 7,0 kGy o DNA das leveduras estava fragmentado. Nesta mesma dose foi verificada uma diferença discreta, mas significativa, na ocorrência de apoptose entre as células irradiadas e controles 24 horas após a irradiação. Através da microscopia eletrônica de transmissão foram verificadas alterações ultra-estruturais nas leveduras irradiadas com 7,0 kGy. Duas horas após a irradiação as principais alterações verificadas foram a vacuolização e a perda de homogeneidade do citoplasma. Após 24 horas, além destas alterações o citoplasma se mostrou retraído e freqüentemente se descolando da parede celular. Nossos resultados indicaram que para as leveduras do S. schenckii, foi possível encontrar uma dose absorvida em que o agente tem comprometida sua capacidade reprodutiva e perde a virulência, mantendo a sua viabilidade, uma condição desejável para o desenvolvimento de uma vacina radioatenuada. / Sporotrichosis is a subacute or chronic infection caused by the fungus Sporothrix schenckii. Zoonotic transmission can occur after scratches or bites of animals, mainly cats, rodents, and armadillos. Up to the moment, no approved vaccine was reported for S. schenckii or to any important pathogenic fungi infection in humans, indicating the need to expand the research in this field and to explore new alternatives. The aim of this study was to evaluate the effects of gamma radiation on the viability, metabolic activity and reproductive ability of S. schenckii yeast cells for further studies on the development of a vaccine for immunization of cats and dogs. The culture of S. schenckii, in solid medium, was irradiated at doses ranging from 1.0 to 9.0 kGy. After each dose the reproductive capacity, viability and protein synthesis were estimated. The results showed that a reduction of 6 log10 cycles in the number of colonies was achieved at 6.0 kGy and after 8.0 kGy no colonies could be recovered. The viability analysis indicated that yeast cells remained viable up to 9.0 kGy. The results of protein synthesis analysis showed that the yeast cells, irradiated up to 9.0 kGy, were able to synthesize proteins. But this ability was significantly reduced with 9.0 kGy, 24 h after irradiation. The virulence assays using yeast irradiated with doses of 7.0 and 9.0 kGy showed no CFUs recovery from tissues of immunosuppressed mice, indicating that the cells were attenuated. The DNA integrity test showed that the DNA of 7.0 kGy irradiated yeast cells was fragmented. At the same dose was verified a discrete but significant increase in the apoptose occurrence in relation to controls 24 hours after the irradiation. By transmission electron microscopy were observed ultrastructural changes in yeast irradiated with 7.0 kGy. Two hours after irradiation the major changes were the vacuolization and the loss of homogeneity of the cytoplasm. After 24 hours, apart from these changes, the cytoplasm was often retracted and sometimes taking off from the cell wall. Our results indicated that for the yeast cells of S. schenckii, it was possible to find an absorbed dose in which the fungus loses the virulence, while maintaining the viability, a desirable condition for the development of a radioattenuated yeast vaccine.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_patricia_diaz.pdf: 1952378 bytes, checksum: 86bdafa069ecf1310cdf6aee4e0d1849 (MD5) Previous issue date: 2008-05-20 / The knowledge on the biopolymers properties are important to predict his future industrial applications because reflects his chemical primary structure. Besides, the physical and chemical characteristics of the biopolymers are a consequence of the process used in his synthesis. The aim of this work was the study of the hydrodynamic properties of solution of biopolymers xanthan synthesized by Xanthomonas arboricola pv pruni, strains 06 and 82, and clairana FL, synthesized by Beijerinckia sp. strain 7070, in 7L fermentation volume. The results from rheological analysis, acetyl and piruvate content, ion content and thermal stability were compared with the ones obtained for commercial xanthan. The commercial xanthan is more efficient in the rheological properties due to divalent ion in their composition. The results for acetyl and piruvate content were in accordance with the literature. Thermal analysis showed presence of protein in the pv pruni xanthan´s and in clairana, but not in commercial xanthan. Hydrodynamic properties behavior of xanthan (Xc06), clairana and tara gum, in various concentrations, was examined using dynamic light scattering. Concentration regimes were determined by critical concentrations c* and c**, applying two methods. The first method was based on diffusional coefficient behavior of a range of biopolymers concentrations. A theoretical curve was proposed for results evaluation. With this method, c* and c** were determined for xanthan and tara gum , but nor for clairana due to its non-regular behavior. Distribution curves of relaxation times (DTR) were the second method applied. Distribution curves for xanthan and tara gum presented different number of relaxation modes. The concentrations where the number of modes did change corresponds to the c* and c**, determined using the first method. So, the distribution curves of relaxation times were obtained for clairana and the critical concentrations determined. Size distribution, hydrodynamic radii and polydispersity index for different concentrations were obtained from the respective correlation curves. The parameters showed dependence with solution concentration. The size distribution changed from monomodal to bimodal and to trimodal due to the increase in solution concentration. This behavior was attributed to the slow motion in diffusion due to particle aggregation formation. This aggregation causes hydrodynamic radii variation because their radii are higher than the particle radius in dilute solution. The polydispersity index increases with concentration increment, due to the appearing new peaks, while the width of the peaks of size distribution decreases. / O conhecimento sobre as propriedades dos biopolímeros é importante para predizer futuras aplicações industriais, pois reflete sua estrutura química primária. Além disso, as características físicas e químicas dos biopolímeros microbianos são conseqüência do processo utilizado em sua síntese. O presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterização das propriedades dinâmicas de soluções dos biopolímeros xantana, sintetizada pela bactéria Xanthomonas arboricola pv pruni, e clairana, sintetizada pela bactéria Beijerinckia sp., em volume de 7L. As análises reológicas, o conteúdo dos grupos acetila e piruvato, o conteúdo de íons e a estabilidade térmica foram comparados com os resultados obtidos para uma amostra de xantana comercial. A amostra comercial apresentou propriedades reológicas superiores aos demais biopolímeros, devido a presença de íons divalentes em sua composição. Os resultados obtidos para o conteúdo de acetila e piruvato apresentaram-se compatíveis com os resultados apresentados na literatura. A análise térmica mostrou a presença de proteínas nas amostras de xantana do pv pruni e na clairana, o que não ocorreu na amostra comercial. O comportamento das propriedades hidrodinâmicas dos biopolímeros xantana (Xc06), clairana e tara, em função da concentração das soluções, foi analisado utilizando a técnica de espalhamento de luz dinâmico. Os regimes de concentração das soluções foram definidos através da determinação das concentrações críticas c* e c**, aplicando-se duas metodologias. A primeira metodologia foi baseada no comportamento do coeficiente de difusão em função da concentração das soluções, propondo-se uma curva teórica para avaliar os resultados. Aplicando esta metodologia, foi possível determinar c* e c** para a xantana e a tara, mas não para a clairana, que apresentou curva irregular. Na segunda metodologia foram analisadas as curvas de distribuição dos tempos de relaxação (DTR) para as soluções de xantana e tara. Estas curvas apresentaram diferente número de modos de relaxação, sendo observado que as concentrações nas quais o número de modos sofreu modificação corresponderam às concentrações c* e c**, determinadas utilizando a metodologia anterior. Foram então obtidas as curvas de DTR para a clairana, sendo possível determinar as concentrações críticas, bem como os regimes de concentração. Através das curvas do coeficiente de correlação foram obtidas as distribuições de tamanho, os raios hidrodinâmicos e o índice de polidispersão. Os parâmetros analisados apresentaram dependência com relação à concentração das soluções. Conforme a concentração das soluções aquosas aumentou, a distribuição de tamanhos por intensidade passou de um comportamento monomodal para bimodal e trimodal. Este comportamento foi atribuído a presença de modos lentos de difusão translacional ocasionados pela formação de aglomerados de partículas. Estes aglomerados causaram variação nos valores do raio hidrodinâmico por apresentarem raio hidrodinâmico superior ao raio das partículas em solução diluída. O índice de polidispersão aumentou com o aumento da concentração das soluções, devido ao surgimento de novos picos, enquanto a largura dos picos de distribuição de tamanho diminuiu.