O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade de cistos de Toxoplasma gondii em carnes suínas processadas por maturação úmida por 14, 21 e 28 dias a 0º (±1), assim como avaliar a distribuição dos cistos em órgãos e cortes comerciais de suínos experimentalmente infectados. Para tanto, dois experimentos foram conduzidos e em ambos, os suínos foram infectados com 3.000 oocistos do isolado TgCkBr57 (BrII). O lombo foi o corte muscular escolhido para sofrer o processo de maturação por ser o corte convencionalmente utilizado para o processo. O lombo direito de cada suíno foi submetido ao processo de maturação e o esquerdo foi mantido como controle, sem processamento. No Experimento 1 três suínos foram infectados. Dos lombos processados por maturação (n=3) e controle (n=3) realizou-se bioensaio em gatos e em camundongos e o período de maturação foi de 14 dias. Nesse ensaio também avaliou-se a distribuição de cistos teciduais pelo bioensaio em camundongos do cérebro, retina, língua, diafragma e coração e de cortes musculares: lombo (m. longissimus), copa (m. longissimus, spinalis dorsi, rhomboideus), filé mignon (m. psoas major), coxão-duro (m. biceps femoris), coxão mole (m. semimembranosus) e alcatra (m. gluteos medius). No Experimento 2 seis suínos foram infectados e foi realizado o bioensaio em camundongos dos lombos que ficaram sob maturação por 14 (n=2), 21 (n=2) e 28 (n=2) dias. Em ambos os experimentos, cistos de T. gondii presentes nos lombos permaneceram viáveis após 14 dias de maturação úmida, com confirmação pelo bioensaio em gatos e em camundongos. Nos períodos de 21 e 28 dias, pelo bioensaio observou-se que os camundongos não se infectaram, indicando que o processo inviabilizou os cistos. Quanto à distribuição dos cistos, estes foram isolados da copa, coração, diafragma e língua dos três suínos; do filé mignon, coxão duro e cérebro de dois suínos e da alcatra e lombo de um suíno. Nenhum camundongo infectou-se no bioensaio com o coxão mole e com a retina. Os resultados demonstram que a maturação em embalagem a vácuo por 14 dias em temperatura controlada (0ºC) não foi eficaz para inativação dos cistos de T. gondii, porém, o processo se mostrou eficiente quando a maturação foi feita por período igual ou superior a 21 dias. Cistos de T. gondii foram encontrados em praticamente todos os órgãos e cortes avaliados, demonstrando a ampla distribuição do parasita em suínos e a importância dessa espécie como fonte de infecção para o homem. / The objective of the present study was to evaluate the viability of Toxoplasma gondii cysts in pork processed by dry-aged for 14, 21 and 28 days at 0º (± 1), as well as to evaluate the distribution of T. gondii cysts in organs and commercial cuts of experimentally infected pigs. For that, two experiments were conducted ans in both the pigs were infected with 3.000 oocysts of the isolate TgCkBr57 (BrII). The loin was the muscle chosen to undergo the dry-aged because it is the cut conventionally used for the process. The right loin of each pig was submitted to the dry-aged and the left was kept as control, without processing. In Experiment 1, three pigs were infected. From the loins processed by dry-aged (n=3) e controle (n=3), the bioassay was performed on cats and mice and the aged period of the loins was 14 days. This study, also avaluated the distribution of T. gondii tissue cysts by bioassay in mice of brain, retina, tongue, diaphragm and hear and of the muscles: loin (m. longissimus), coppa (m. longissimus, spinalis dorsi, rhomboideus), tender loin (m. psoas major), outside flat (m. biceps femoris), topside (m. semimembranosus) and top sirloin (m. gluteos medius) was evaluated. In Experiment 2, six pigs were infected and the bioassay was performed in mice of the loins aged for 14 (n=2), 21 (n=2) and 28 (n=2) days. In both experiments, T. gondii cysts of the loins remained viable after 14 days of dry-aged, confirmed by bioassay in cats and mice. At 21 and 28 days, the bioassay showed that the mice did not become infected, indicating that the process made the cysts unfeasible. As to the distribution of the cysts, T. gondii was isolated from the coppa, heart, diaphragm and tongue of the three pigs, to the tender loin, outside flat and brain of two pigs and to the top sirloin and loin of one pig. No mice were infected in the bioassay with the topside and with the retina. The results demonstrate that the dry-aged for 14 days at controlled temperature (0ºC) was not effective for inactivation of T. gondii cysts, however, the process was efficient when the dry-aged was done for a period egual or righter than 21 days. Toxoplasma gondii cysts were found in practically all organs and cuts evaluated, demonstrating the wide distribution of the parasite in pigs and the importance of this species as a source of infection for man.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade de cistos de Toxoplasma gondii em carnes suínas processadas por maturação úmida por 14, 21 e 28 dias a 0º (±1), assim como avaliar a distribuição dos cistos em órgãos e cortes comerciais de suínos experimentalmente infectados. Para tanto, dois experimentos foram conduzidos e em ambos, os suínos foram infectados com 3.000 oocistos do isolado TgCkBr57 (BrII). O lombo foi o corte muscular escolhido para sofrer o processo de maturação por ser o corte convencionalmente utilizado para o processo. O lombo direito de cada suíno foi submetido ao processo de maturação e o esquerdo foi mantido como controle, sem processamento. No Experimento 1 três suínos foram infectados. Dos lombos processados por maturação (n=3) e controle (n=3) realizou-se bioensaio em gatos e em camundongos e o período de maturação foi de 14 dias. Nesse ensaio também avaliou-se a distribuição de cistos teciduais pelo bioensaio em camundongos do cérebro, retina, língua, diafragma e coração e de cortes musculares: lombo (m. longissimus), copa (m. longissimus, spinalis dorsi, rhomboideus), filé mignon (m. psoas major), coxão-duro (m. biceps femoris), coxão mole (m. semimembranosus) e alcatra (m. gluteos medius). No Experimento 2 seis suínos foram infectados e foi realizado o bioensaio em camundongos dos lombos que ficaram sob maturação por 14 (n=2), 21 (n=2) e 28 (n=2) dias. Em ambos os experimentos, cistos de T. gondii presentes nos lombos permaneceram viáveis após 14 dias de maturação úmida, com confirmação pelo bioensaio em gatos e em camundongos. Nos períodos de 21 e 28 dias, pelo bioensaio observou-se que os camundongos não se infectaram, indicando que o processo inviabilizou os cistos. Quanto à distribuição dos cistos, estes foram isolados da copa, coração, diafragma e língua dos três suínos; do filé mignon, coxão duro e cérebro de dois suínos e da alcatra e lombo de um suíno. Nenhum camundongo infectou-se no bioensaio com o coxão mole e com a retina. Os resultados demonstram que a maturação em embalagem a vácuo por 14 dias em temperatura controlada (0ºC) não foi eficaz para inativação dos cistos de T. gondii, porém, o processo se mostrou eficiente quando a maturação foi feita por período igual ou superior a 21 dias. Cistos de T. gondii foram encontrados em praticamente todos os órgãos e cortes avaliados, demonstrando a ampla distribuição do parasita em suínos e a importância dessa espécie como fonte de infecção para o homem. / The objective of the present study was to evaluate the viability of Toxoplasma gondii cysts in pork processed by dry-aged for 14, 21 and 28 days at 0º (± 1), as well as to evaluate the distribution of T. gondii cysts in organs and commercial cuts of experimentally infected pigs. For that, two experiments were conducted ans in both the pigs were infected with 3.000 oocysts of the isolate TgCkBr57 (BrII). The loin was the muscle chosen to undergo the dry-aged because it is the cut conventionally used for the process. The right loin of each pig was submitted to the dry-aged and the left was kept as control, without processing. In Experiment 1, three pigs were infected. From the loins processed by dry-aged (n=3) e controle (n=3), the bioassay was performed on cats and mice and the aged period of the loins was 14 days. This study, also avaluated the distribution of T. gondii tissue cysts by bioassay in mice of brain, retina, tongue, diaphragm and hear and of the muscles: loin (m. longissimus), coppa (m. longissimus, spinalis dorsi, rhomboideus), tender loin (m. psoas major), outside flat (m. biceps femoris), topside (m. semimembranosus) and top sirloin (m. gluteos medius) was evaluated. In Experiment 2, six pigs were infected and the bioassay was performed in mice of the loins aged for 14 (n=2), 21 (n=2) and 28 (n=2) days. In both experiments, T. gondii cysts of the loins remained viable after 14 days of dry-aged, confirmed by bioassay in cats and mice. At 21 and 28 days, the bioassay showed that the mice did not become infected, indicating that the process made the cysts unfeasible. As to the distribution of the cysts, T. gondii was isolated from the coppa, heart, diaphragm and tongue of the three pigs, to the tender loin, outside flat and brain of two pigs and to the top sirloin and loin of one pig. No mice were infected in the bioassay with the topside and with the retina. The results demonstrate that the dry-aged for 14 days at controlled temperature (0ºC) was not effective for inactivation of T. gondii cysts, however, the process was efficient when the dry-aged was done for a period egual or righter than 21 days. Toxoplasma gondii cysts were found in practically all organs and cuts evaluated, demonstrating the wide distribution of the parasite in pigs and the importance of this species as a source of infection for man.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Erythropoietin is a sialoglycoprotein which promotes the increase of erythropoiesis. Clinically is used for the treatment of anaemia associated to chronic renal failure. Identification and separation of isoforms of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in biopharmaceuticals of different origins, was carried out by isoelectric focusing (IEF) western blotting and, also by lectin binding with Triticum vulgaris, showing 4-7 isoforms distributed in the isoeletric range of 4.4 to 5.2. N-acetylneuraminic acid content was quantified by reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection giving values higher than 108.74 ηg/μg. Biological activity was evaluated by the normocythaemic mice bioassay, and investigating the TF-1 cell line in vitro. The correlation of the results of both of the methods were significant, as calculated by the Pearson s coefficient (r = 0.9967). In addition, the content/potency of the biopharmaceutical products was assessed by validated reversed phase and size exclusion liquid chromatography methods, showing mean values 2.11% and 1.21% lower, respectively, related to the in vivo bioassay. Sample was degraded under UV light to generate deamidate/sulphoxide forms and treatment at 65ºC for 12 hours to produce dimeric and aggregated forms. The potencies were evaluated by the normocythaemic mice assay and the TF-1 cell culture assay giving mean reduction of 14.05% and 32.87%, respectively, related to the intact molecule. The alternative in vitro assay investigated in the context of the reduction or replacement of the animals, and the evaluation of the correlations between physicochemical and biological methods, represent improvements which can be applied to the production steps and for the quality control of rhEPO, contributing to ensure the batch-to-batch consistency of bulk and finished biological products. / A eritropoietina é uma sialoglicoproteína que promove o aumento da eritropoiese. Clinicamente é usada para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente realizou-se identificação e separação das isoformas de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos biofarmacêuticos de diferentes origens, por focalização isoelétrica (IEF), seguida de imunodetecção, e também por ligação à lectina Triticum vulgaris, demonstrando a presença de 4 a 7 isoformas, distribuídas na faixa de ponto isoelétrico de 4,4 a 5,2. Quantificou-se o conteúdo de ácido N-acetilneuramínico por cromatografia líquida por fase-reversa e detecção por fluorescência obtendo teores acima de 108,74 ηg/μg. Avaliou-se a atividade biológica pelo bioensaio em camundongos normocitêmicos e pesquisou-se o ensaio alternativo baseado na cultura da linhagem celular TF-1 in vitro. Os resultados dos bioensaios apresentaram correlação significativa, conforme calculado pelo coeficiente de correlação de Pearson (r = 0,9967). Paralelamente, determinou-se o teor/potência dos produtos pelas metodologias validadas por cromatografia líquida por fase reversa e por exclusão molecular, que forneceram média de resultados 2,11% e 1,21% menores, respectivamente, em relação ao bioensaio in vivo. Submeteu-se amostra à degradação por luz UV para obter as formas desamidadas/oxidadas e tratamento a 65°C por 12 horas para as diméricas e agregadas. Efetuou-se a avaliação pelo bioensaio in vivo e in vitro, que apresentaram redução média de 14,05% e 32,87% respectivamente, em relação à molécula intacta. Desse modo, o ensaio biológico alternativo in vitro, pesquisado no contexto da redução ou substituição do uso de animais, e as avaliações de correlação entre métodos físico-químicos e biológicos, representam aprimoramentos aplicáveis para as etapas do processo de produção e para o controle de qualidade de rhEPO, contribuindo para garantir a consistência lote-a-lote da solução concentrada e dos produto biológicos acabados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Erythropoietin is a hematopoietic hormone and the main physiological function is the induction of erythropoiesis. Recombinant DNA technology enabled cloning and expression of rhEPO gene to produce recombinant human erythropoietin (rhEPO). It is a sialoglycoprotein composed of 165 amino acids chain and about 40% of the molecule consists of carbohydrates, important for biological activity due to the presence of sialic acid residues at the termini of chains affecting its half-life. In the present study an alternative in vitro cell culture-based assay using TF-1 cell line was validated, to be used in conjunction with a reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection (F-RP-LC) validated to determine the content of sialic acids. The values obtained for the sialic acids were higher than 126.83 ng/μg, and the biotechnology-derived products were subjected to the cell culture bioassay giving potencies 2.91% ± 0.85 lower related to the bioassay in normocythaemic mice, with significant correlation calculated by the Pearson coefficient (r = 0.9947). In parallel, it was determined the content/potency of the products by the validated reversed-phase and size-exclusion liquid chromatography methods that showed mean results 3.14% higher and 2.87% lower, respectively, compared to the in vitro bioassay. It was demonstrated that in vitro cell culture bioassay represent a valid alternative to the in vivo bioassay for the potency assessment of rhEPO, in the context of the reduction and/or replacement of animals. Likewise, correlation of the results obtained with the physicochemical methods, represents advances for the characterization of the biomolecule, which can be applied to the production steps and for the quality control, contributing to assure the batch-to-batch consistency of the bulk and the finished biological products of rhEPO. / A eritropoietina é um hormônio hematopoiético cuja principal função fisiológica é a indução da eritropoiese. Através da tecnologia do DNA recombinante foi possível a clonagem e expressão do gene para produzir a eritropoietina humana recombinante (rhEPO). É uma sialoglicoproteína composta por cadeia de 165 aminoácidos e, aproximadamente, 40% da molécula é constituída de carboidratos, importantes para a atividade biológica devido à presença de resíduos de ácidos siálicos nas extremidades das cadeias, que influenciam na meia-vida da biomolécula. No presente estudo foi validado ensaio alternativo baseado na cultura da linhagem de células TF-1 in vitro, e método por cromatografia líquida por fase reversa com detecção por fluorescência para determinação de ácidos siálicos, para avaliação em conjunto da potência de rhEPO. Determinaram-se teores de ácidos siálicos acima de 126,83 ng/μg e os produtos biotecnológicos foram submetidos ao bioensaio por cultura de células fornecendo potências 2,91% ± 0,85 menores em relação ao ensaio biológico em camundongos normocitêmicos, com correlação significativa calculada pelo coeficiente de correlação de Pearson (r = 0,9947). Paralelamente, determinou-se o teor/potência dos produtos pelas metodologias validadas por cromatografia líquida por fase reversa e por exclusão molecular, que forneceram média de resultados 3,14% maior e 2,87% menor, respectivamente, em relação ao bioensaio in vitro. Demonstrou-se que o bioensaio por cultura de células in vitro, constitui-se em alternativa ao ensaio biológico in vivo para a avaliação de potência de rhEPO, no contexto da redução e/ou substituição do uso de animais. Do mesmo modo, a correlação com os resultados fornecidos pelos métodos físico-químicos, representa avanços para caracterização da biomolécula, que podem ser aplicados nas etapas do processo de produção e para o controle de qualidade, contribuindo para garantir a consistência lote-a-lote da solução concentrada e dos produtos biológicos acabados de rhEPO.