[ES] Plant Molecular Farming (PMF) es la producción de proteínas de interés industrial y valor comercial en plantas. Su objetivo es proporcionar un enfoque seguro y rentable para la producción de proteínas recombinantes a gran escala. Las plantas del género Nicotiana, especialmente Nicotiana tabacum y Nicotiana benthamiana, han adquirido una importancia creciente como plataformas de producción de PMF debido a sus ventajas, como el alto rendimiento de biomasa, la facilidad de transformación y la expresión robusta de proteínas. Sin embargo, en la actualidad N. tabacum y N. benthamiana no son hospedadores ideales para el cultivo molecular. Los objetivos de mejora genética, como retrasar o suprimir la floración para aumentar la biomasa de la planta, podrían convertir a N. benthamiana en un chasis de primera para fines de cultivo molecular. En este trabajo de investigación nos centramos en este objetivo. En el primer capítulo, realizamos un análisis de todo el genoma de los genes SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), implicados en la transición de fase vegetativa y el tiempo de floración, en esta especie y en su pariente cercana N. tabacum, identificando 49 genes SPL en N. tabacum y 43 genes SPL en N. benthamiana. Los genes SPL de las dos especies se clasificaron en ocho grupos filogenéticos de acuerdo con la clasificación de SPL en Arabidopsis thaliana. La estructura génica exón-intrón y los dominios de unión al ADN se conservaron en gran medida entre homeólogos y ortólogos, y también se identificaron las dianas potenciales del microARN156, implicado en la transición de fase vegetativa. La expresión de genes SPL en hojas se analizó mediante RNA-seq en tres fases de crecimiento diferentes, revelando que los genes que no estaban bajo el control de miR156 se expresaban en general de forma constitutiva a niveles altos, mientras que los genes regulados por miR156 mostraban niveles de expresión más bajos, a menudo regulados por el desarrollo. Seleccionamos el gen SPL13_1a de N. benthamiana como diana para un experimento de knockout CRISPR/Cas9. El knock out completo de este único gen condujo a un retraso significativo en el tiempo de floración de 2-5 días y a un aumento de la ramificación. En el segundo capítulo, mostramos más ediciones de genes CRISPR/Cas9 realizadas en N. benthamiana con el objetivo de la abolición de la floración. Se eliminaron los inductores florales FLOWERING LOCUS T 4 y 5 (NbFT4 y NbFT5_1a/1b) solos y en combinación con NbSPL13_1a. En la línea más editada FT4-FT5-SPL13 40-1 el tiempo de floración se duplicó en comparación con las plantas de tipo silvestre. Sin embargo, no se logró la abolición total de la floración. El retraso de la floración tuvo consecuencias en varios aspectos del crecimiento de la planta, que cuantificamos a través de diversos parámetros: las líneas altamente editadas presentaron un aumento de la biomasa, la altura, el número de hojas y el área foliar total en comparación con las menos editadas y el tipo silvestre. Además, se evaluó el potencial de las líneas generadas para expresar proteínas heterólogas. Inesperadamente, no fueron capaces de mantener altos niveles de expresión después de la quinta semana. En el futuro, se apilarán en nuestras líneas knockouts en otros actores importantes en el inicio de la floración, como NbSPL9/15 y NbSPL3/4/5. / [CA] Plant Molecular Farming (PMF) és la producció de proteïnes d'interès industrial i valor comercial a plantes. El seu objectiu és proporcionar un enfocament segur i rendible per a la producció de proteïnes recombinants a gran escala. Les plantes del gènere Nicotiana, especialment Nicotiana tabacum i Nicotiana benthamiana, han adquirit una importància creixent com a plataformes de producció de PMF a causa dels seus avantatges, com ara l'alt rendiment de biomassa, la facilitat de transformació i l'expressió robusta de proteïnes. No obstant això, actualment la N. tabacum i la N. benthamiana no són hostes ideals per al cultiu molecular. Els objectius de millora genètica, com ara endarrerir o suprimir la floració per augmentar la biomassa de la planta, podrien convertir N. benthamiana en un xassís de primera per a fins de cultiu molecular. En aquest treball de recerca ens centrem en aquest objectiu. Al primer capítol, realitzem una anàlisi de tot el genoma dels gens SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), implicats en la transició de fase vegetativa i el temps de floració, en aquesta espècie i en el seu parent proper N. tabacum, identificant 49 gens SPL a N. tabacum i 43 gens SPL a N. benthamiana. Els gens SPL de les dues espècies es van classificar en vuit grups filogenètics d'acord amb la classificació de SPL a Arabidopsis thaliana. L'estructura gènica exón-intron i els dominis d'unió a l'ADN es van conservar en gran mesura entre homeòlegs i ortòlegs, i també es van identificar les potencials dianes del microARN156, implicat en la transició de fase vegetativa. L'expressió de gens SPL en fulles es va analitzar mitjançant RNA-seq en tres fases de creixement diferents, revelant que els gens que no estaven sota el control de miR156 s'expressaven en general de forma constitutiva a nivells alts, mentre que els gens regulats per miR156 mostraven nivells més baixos d'expressió, sovint regulats pel desenvolupament. Seleccionem el gen SPL13_1a de N. benthamiana com a diana per a un experiment de knockout CRISPR/Cas9. El knock out complet d'aquest gen va conduir a un retard significatiu en el temps de floració de 2-5 dies ia un augment de la ramificació. Al segon capítol, mostrem més edicions de gens CRISPR/Cas9 realitzades a N. benthamiana amb l'objectiu de l'abolició de la floració. Es van eliminar els inductors florals FLOWERING LOCUS T 4 i 5 (NbFT4 i NbFT5_1a/1b) sols i en combinació amb NbSPL13_1a. A la línia més editada FT4-FT5-SPL13 40-1 el temps de floració es va duplicar en comparació amb les plantes de tipus silvestre. Tot i això, no es va aconseguir l'abolició total de la floració. El retard de la floració va tenir conseqüències en diversos aspectes del creixement de la planta, que vam quantificar a través de diversos paràmetres: les línies altament editades van presentar un augment de la biomassa, l'alçada, el nombre de fulles i l'àrea foliar total en comparació amb les menys editades i el tipus silvestre. A més, es va avaluar el potencial de les línies generades per expressar proteïnes heteròlogues. Inesperadament, no van ser capaços de mantenir alts nivells dexpressió després de la cinquena setmana. En el futur, s'apilaran a les nostres línies knockouts en altres actors importants a l'inici de la floració, com NbSPL9/15 i NbSPL3/4/5. / [EN] The term Plant Molecular farming (PMF) refers to the production of industrially relevant and commercially valuable recombinant products in plants. Its purpose is to provide a safe and cost-effective approach for the manufacturing of recombinant bioproducts at a large scale. Plants of the Nicotiana genus, especially Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana, have become increasingly important as production platforms for PMF due to their advantages such as high biomass yield, ease of transformation, and robust protein expression. However, at present, there is room for improvement for N. tabacum and N. benthamiana as ideal hosts for molecular farming. Breeding goals such as delaying or abolishing flowering to enhance plant biomass could convert N. benthamiana into a prime chassis for molecular farming purposes. This objective was the focus of this research. In the first chapter, a genome-wide analysis of SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL) genes was performed. These genes are involved in vegetative phase transition and flowering time, on this species and its close relative N. tabacum, identifying 49 SPL genes in N. tabacum and 43 SPL genes in N. benthamiana. The SPL genes of the two species were classified into eight phylogenetic groups according to the SPL classification in Arabidopsis thaliana. The exon-intron gene structure and the DNA-binding domains were highly conserved between homeologues and orthologues, and the potential targets of microRNA156, involved in vegetative phase transition, were also identified. The expression of SPL genes in leaves was analysed by RNA-seq at three different growth stages, revealing that genes not under miR156 control were in general constitutively expressed at high levels, whereas miR156-regulated genes showed lower expression levels, often developmentally regulated. The N. benthamiana SPL13_1a gene was selected as target for a CRISPR/Cas9 knockout experiment. The full knock out of this single gene lead to a significant delay in flowering time of 2-5 days and increased branching. In the second chapter, more CRISPR/Cas9 gene editions are performed in N. benthamiana with the objective of flowering abolition. Floral inducers FLOWERING LOCUS T 4 and 5 (NbFT4 and NbFT5_1a/1b) were knocked out alone and in combination with NbSPL13_1a. In the most edited line FT4-FT5-SPL13 40-1 flowering time was doubled compared to wild type plants. However, total abolition of flowering was not achieved. The delayed flowering had consequences on various aspects of plant growth, that were quantified through various parameters: highly edited lines had increased biomass, height, number of leaves and total leaves area compared to the less edited ones and wild type. Moreover, the generated lines were evaluated for their potential to express heterologous proteins. Unexpectedly, they were not able to maintain high expression levels after week five. In the future, knockouts in other important players in flowering initiation, such as NbSPL9/15 and NbSPL3/4/5, will be stacked in our lines. / Paola, CD. (2024). Enhancing Nicotiana benthamiana as chassis for Molecular Farming: targeting flowering time for increased biomass and recombinant protein production [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204803

[ES] Las plantas son plataformas versátiles para la síntesis de compuestos valiosos para el ser humano a través de la ingeniería metabólica y la biología sintética. Estas "biofactorías" pueden producir sustancias de alto valor para fines industriales, médicos y agrícolas, incluyendo feromonas sexuales de insectos, que ofrecen una alternativa sostenible a los pesticidas en la protección de cultivos. Sin embargo, estas feromonas se producen típicamente mediante síntesis química, una estrategia no muy ecológica, lo cual subraya la necesidad de métodos de producción más sostenibles. Las rutas biosintéticas de las feromonas sexuales de polillas están actualmente bien descritas, y se han identificado muchos de los genes responsables de su síntesis. Nuestro grupo desarrolló recientemente plantas transgénicas estables de Nicotiana benthamiana, denominadas 'SexyPlant', que producen y emiten feromonas volátiles biológicamente activas como Z11-16OH, Z11-16OAc y Z11-16Ald. Esto se logró integrando rutas biosintéticas de varias especies de polillas en N. benthamiana, utilizando genes tanto de polillas como de plantas y aprovechando el metabolismo endógeno de ácidos grasos de la planta. Sin embargo, este enfoque provocó problemas de toxicidad debido a la acumulación de compuestos y a las interrupciones en la ruta metabólica de ácidos grasos de la planta. En el primer capítulo, abordamos estos problemas de toxicidad en 'SexyPlant' explorando acetiltransferasas alternativas para mejorar la eficiencia de conversión de Z11-16OH a Z11-16OAc. También investigamos la activación de esta ruta biosintética utilizando reguladores transcripcionales basados en CRISPR combinados con promotores sintéticos, creando líneas transgénicas estables ('GuidedPathway' y 'NonGuidedPathway') con dos configuraciones génicas diferentes que acumulan biomasa y no producen ni emiten feromonas sexuales de polilla hasta ser específicamente activadas por elementos genéticos ortogonales apropiados. Aunque el rendimiento de producción es menor que en las plantas 'SexyPlant' constitutivas, en este capítulo demostramos el potencial para activar la ruta biosintética y exploramos los cuellos de botella en el sistema. El segundo capítulo se centra en la producción heteróloga de monoterpenoides irregulares, una familia de compuestos que incluyen feromonas sexuales de la superfamilia Coccoidea (por ejemplo, los insectos escama). A pesar de que la ruta biosintética de estas moléculas es desconocida, expresamos genes derivados de plantas con actividades similares. Introdujimos genes que codifican para la sintasa de crisantenil difosfato (CPPS) de Tanacetum cinerariifolium y la sintasa de lavandulil difosfato (LPPS) de Lavandula x intermedia en tabaco y N. benthamiana para lograr una expresión transitoria y estable, resultando en líneas transgénicas. Caracterizamos la producción y emisión de estos compuestos volátiles en diferentes tejidos y etapas de desarrollo foliar, identificando las hojas juveniles como el tejido más productivo. Además, buscamos producir feromonas sexuales de Coccoidea coexpresando LiLPPS con LiAAT4, logrando la producción de acetato de lavandulil, un componente de la mezcla de feromonas de la cochinilla Dysmicoccus grassii, la feromona de agregación de Frankliniella occidentalis, y un larvicida conocido para mosquitos. Estos 'biodispensadores' emitieron hasta 0,63 mg de acetato de lavandulil por día, sugiriendo que se necesitarían entre 200 y 500 plantas por hectárea para igualar la eficacia de los dispositivos comerciales de liberación de feromonas. En resumen, esta tesis ofrece diferentes estrategias para abordar la producción de feromonas sexuales de insectos y compuestos volátiles asociados en biofábricas de plantas, explorando las limitaciones de esta biosíntesis. / [CA] Plants are versatile platforms for synthesizing valuable compounds through metabolic engineering and synthetic biology. These "biofactories" can produce high-value substances for industrial, medical, and agricultural purposes, including insect sex pheromones, which offer a sustainable alternative to pesticides in crop protection. However, these pheromones are typically produced via chemical synthesis, which is not environmentally friendly, highlighting the need for more sustainable production methods. The biosynthetic pathways of moth sex pheromones are currently well-described, with many of the genes responsible for their synthesis identified. Our group recently developed stable transgenic Nicotiana benthamiana plants, termed 'SexyPlant,' that produce and emit volatile, biologically active pheromones like Z11-16OH, Z11-16OAc, and Z11-16Ald. This was achieved by integrating biosynthetic pathways from multiple moth species into N. benthamiana, using genes from both moths and plants while leveraging the plant's endogenous fatty acid metabolism. However, this approach led to toxicity issues due to compound accumulation and disruptions in the plant's fatty acid metabolic pathway. In the first chapter, we address these toxicity issues in 'SexyPlant' by exploring alternative acetyltransferases to enhance the conversion efficiency of Z11-16OH to Z11-16OAc. We also investigate the activation of this biosynthetic pathway using CRISPR-based transcriptional regulators combined with synthetic promoters, creating stable transgenic lines ('GuidedPathway' and 'NonGuidedPathway'), with two different gene configurations that accumulate biomass and do not produce or emit moth sex pheromones until specifically activated by appropriate orthogonal genetic elements. Although the production yield is lower than in constitutive 'SexyPlant' plants, in this chapter, we demonstrate the potential for activating the biosynthetic pathway and explore the bottlenecks in the system. The second chapter focuses on the heterologous production of irregular monoterpenoids, a family of compounds that include sex pheromones of the Coccoidea superfamily (e.g., scale insects). Despite the biosynthetic pathway for these molecules being unknown, we expressed plant-derived genes with similar activities. We introduced genes encoding chrysanthemyl diphosphate synthase (CPPS) from Tanacetum cinerariifolium and lavandulyl diphosphate synthase (LPPS) from Lavandula x intermedia into tobacco and N. benthamiana to achieve transient and stable expression, resulting in transgenic lines. We characterized the production and emission of these volatile compounds in different tissues and leaf development stages, identifying juvenile leaves as the most productive. Additionally, we aimed to produce Coccoidea sex pheromones by co-expressing LiLPPS with LiAAT4, achieving production of lavandulyl acetate, a component of the mealybug Dysmicoccus grassii pheromone blend, the aggregation pheromone of Frankliniella occidentalis, and a known mosquito larvicide. These 'biodispensers' emitted up to 0.63 mg of lavandulyl acetate per day, suggesting that 200-500 plants per hectare would be needed to match the efficacy of commercial pheromone release devices. In summary, this thesis provides different strategies for addressing the production of insect sex pheromones and associated volatile compounds in plant biofactories, exploring the limitations of this biosynthesis. / [EN] Les plantes són plataformes versàtils per a la síntesi de compostos valuosos per a l'ésser humà a través de l'enginyeria metabòlica i la biologia sintètica. Estes "biofactories" poden produir substàncies d'alt valor per a fins industrials, mèdics i agrícoles, incloent feromones sexuals d'insectes, que ofereixen una alternativa sostenible als pesticides en la protecció de cultius. No obstant això, estes feromones es produïxen típicament mitjançant síntesi química, una estratègia no molt ecològica, la qual cosa subratlla la necessitat de mètodes de producció més sostenibles. Les rutes biosintètiques de les feromones sexuals de les arnes estan actualment ben descrites, i s'han identificat molts dels gens responsables de la seua síntesi. El nostre grup va desenvolupar recentment plantes transgèniques estables de Nicotiana benthamiana, denominades 'SexyPlant', que produïxen i emeten feromones volàtils biològicament actives com Z11-16OH, Z11-16OAc i Z11-16Ald. Açò es va aconseguir integrant rutes biosintètiques de diverses espècies d'arnes en N. benthamiana, utilitzant gens tant d'arnes com de plantes i aprofitant el metabolisme endogen d'àcids grassos de la planta. No obstant això, este enfocament va provocar problemes de toxicitat degut a l'acumulació de compostos i a les interrupcions en la ruta metabòlica d'àcids grassos de la planta. En el primer capítol, abordem estos problemes de toxicitat en 'SexyPlant' explorant acetiltransferases alternatives per a millorar l'eficiència de conversió de Z11-16OH a Z11-16OAc. També investiguem l'activació d'esta ruta biosintètica utilitzant reguladors transcripcionals basats en CRISPR combinats amb promotors sintètics, creant línies transgèniques estables ('GuidedPathway' i 'NonGuidedPathway') amb dos configuracions gèniques diferents que acumulen biomassa i no produïxen ni emeten feromones sexuals d'arna fins a ser específicament activades per elements genètics ortogonals apropiats. Encara que el rendiment de producció és menor que en les plantes 'SexyPlant' constitutives, en este capítol demostrem el potencial per a activar la ruta biosintètica i explorem els colls de botella en el sistema. El segon capítol se centra en la producció heteròloga de monoterpenoides irregulars, una família de compostos que inclou feromones sexuals de la superfamília Coccoidea (per exemple, els insectes escama). Malgrat que la ruta biosintètica d'estes molècules és desconeguda, expressem gens derivats de plantes amb activitats similars. Introduïm gens que codifiquen per a la sintasa de crisantenil difosfat (CPPS) de Tanacetum cinerariifolium i la sintasa de lavandulil difosfat (LPPS) de Lavandula x intermedia en tabac i N. benthamiana per a aconseguir una expressió transitòria i estable, resultant en línies transgèniques. Caracteritzem la producció i emissió d'estos compostos volàtils en diferents teixits i etapes de desenvolupament foliar, identificant les fulles juvenils com el teixit més productiu. A més, busquem produir feromones sexuals de Coccoidea coexpressant LiLPPS amb LiAAT4, aconseguint la producció d'acetat de lavandulil, un component de la mescla de feromones de la cotxinilla Dysmicoccus grassii, la feromona d'agregació de Frankliniella occidentalis, i un larvicida conegut per a mosquits. Estos 'biodispensadors' emeteren fins a 0,63 mg d'acetat de lavandulil per dia, suggerint que es necessitarien entre 200 i 500 plantes per hectàrea per a igualar l'eficàcia dels dispositius comercials de lliurament de feromones. En resum, esta tesi oferix diferents estratègies per a abordar la producció de feromones sexuals d'insectes i compostos volàtils associats en biofàbriques de plantes, explorant les limitacions d'esta biosíntesi. / Mateos Fernández, R. (2024). Bioproduction of Insect Sex Pheromones and Related Volatile Compounds in Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/211184