Les travaux présentés traitent des cinétiques de décrochement des biofilms bactériens formés au sein des équipements communément utilisé dans les agro-industries. Deux espèces bactériennes Pseudomonas et Bacillus ayant une forte capacité à former des biofilms dont la présence quasi permanente est reportés dans les industries alimentaires (viande, lait, légumes frais...) ont servi de modèles pertinent pour ces travaux. Par ailleurs Bacillus, bactéries potentiellement pathogènes capable de former des spores dont les capacités à adhérer et résister aux environnements chimiques et thermiques défavorables (détergents, traitement de pasteurisation, stérilisation) sont reconnues pour présenter un risque sanitaire majeur pour l'agro-industrie du fait de la contamination des produits alimentaires par l'outil de fabrication lui-même. Deux type d'études ont été effectués sur le nettoyage d'équipements utilisés en industrie agroalimentaire.Une première approche cinétique a été mise en œuvre pour étudier l'élimination de ces biofilms des surfaces au cours du nettoyage. Nous avons cherchés à identifier les rôles respectifs de l'action mécanique via la contrainte pariétale générée par l'écoulement ou chimique via différentes concentrations en NaOH puis la combinaison des deux actions chimiques et mécaniques. Un modèle biphasique a été proposé pour décrire ces cinétiques de nettoyage en pertinence avec deux phases très distinctes que nous interprétons comme l'élimination de deux fractions différentes du biofilm. Un détachement plus ou moins rapide (1 à 5 min) correspondrait à l'élimination de structure tridimensionnelles composées ou non d'exopolymères suivi par un détachement lent des cellules directement en contact avec les surfaces.Dans le cas des biofilms à Bacillus, il existe une fraction du biofilm composée par des spores pouvant représenter près de 90% du biofilm. Cette fraction particulière semble s'éliminer plus rapidement dans la première phase et pas du dans la seconde phase. Les données préliminaires sur biofilms mixtes montrent une résistance accrue de l'ensemble qui se traduit par une plus grande résistance de la partie de biofilm constituée par des cellules à Pseudomonas.La seconde thématique développée traite de la possible récontamination par les sopres de Bacillus décrochées lors du processus de nettoyage.La réadhésion des bactéries à pu être prouvée par le positionnement des tubes dans le circuit de nettoyage, ainsi que par l'utilisation d'un matériel complexe (vanne bidirectionnelle) communément utilisé dans les agro-industries. Ces travaux ont permis d'identifier les conditions présidant à cette récontamination. La conception hygiénique des outils de transformation prend tout son sens ici.

Les travaux présentés traitent des cinétiques de décrochement des biofilms bactériens formés au sein des équipements communément utilisé dans les agro-industries. Deux espèces bactériennes Pseudomonas et Bacillus ayant une forte capacité à former des biofilms dont la présence quasi permanente est reportés dans les industries alimentaires (viande, lait, légumes frais…) ont servi de modèles pertinent pour ces travaux. Par ailleurs Bacillus, bactéries potentiellement pathogènes capable de former des spores dont les capacités à adhérer et résister aux environnements chimiques et thermiques défavorables (détergents, traitement de pasteurisation, stérilisation) sont reconnues pour présenter un risque sanitaire majeur pour l’agro-industrie du fait de la contamination des produits alimentaires par l’outil de fabrication lui-même. Deux type d’études ont été effectués sur le nettoyage d’équipements utilisés en industrie agroalimentaire.Une première approche cinétique a été mise en œuvre pour étudier l’élimination de ces biofilms des surfaces au cours du nettoyage. Nous avons cherchés à identifier les rôles respectifs de l’action mécanique via la contrainte pariétale générée par l’écoulement ou chimique via différentes concentrations en NaOH puis la combinaison des deux actions chimiques et mécaniques. Un modèle biphasique a été proposé pour décrire ces cinétiques de nettoyage en pertinence avec deux phases très distinctes que nous interprétons comme l’élimination de deux fractions différentes du biofilm. Un détachement plus ou moins rapide (1 à 5 min) correspondrait à l’élimination de structure tridimensionnelles composées ou non d’exopolymères suivi par un détachement lent des cellules directement en contact avec les surfaces.Dans le cas des biofilms à Bacillus, il existe une fraction du biofilm composée par des spores pouvant représenter près de 90% du biofilm. Cette fraction particulière semble s’éliminer plus rapidement dans la première phase et pas du dans la seconde phase. Les données préliminaires sur biofilms mixtes montrent une résistance accrue de l’ensemble qui se traduit par une plus grande résistance de la partie de biofilm constituée par des cellules à Pseudomonas.La seconde thématique développée traite de la possible récontamination par les sopres de Bacillus décrochées lors du processus de nettoyage.La réadhésion des bactéries à pu être prouvée par le positionnement des tubes dans le circuit de nettoyage, ainsi que par l’utilisation d’un matériel complexe (vanne bidirectionnelle) communément utilisé dans les agro-industries. Ces travaux ont permis d’identifier les conditions présidant à cette récontamination. La conception hygiénique des outils de transformation prend tout son sens ici. / This work deals with removal kinetics of bacterial biofilms potentially formed in commonly used equipment in agro-industries. Two bacterial species Pseudomonas and Bacillus with a strong ability to form biofilms in which the almost permanent presence is reported in the food industry (meat, milk, vegetables…) were chosen as relevant models for the study. Moreover Bacillus, potentially pathogenic bacteria can form spores which are known to strongly adhere to solid surfaces and for their ability to withstand adverse environments as thermal and chemical detrimental conditions (detergents, pasteurization or sterilization temperatures). Bacillus species are known to pose a major health risk for agro-industry is contamination of food by the technical equipment itself.Two main areas were considered in the field of food processing equipment cleaning.At first a kinetic approach was implemented to study the removal of biofilms from surfaces during cleaning operations. Thus respective roles of the mechanical action (wall shear stress under turbulent flow regime), the chemical action (different NaOH concentrations) and the combination of both chemical and mechanical actions were studied. A biphasique model was proposed to describe cleaning kinetics according to the observation of two very different phases which we interpreted as the elimination of two different fractions of the biofilm. A more or less fast detachment in 1 to 5 min would correspond to the three-dimensional elimination of structure with more or less exopolymeric materials followed by a slow detachment of bacteria cells directly in contact with solid surfaces. In the case of Bacillus, can represent about 90% of the total biofilm. Spores removal appeared to be a two phases phenomenon as the whole biofilm. However, the removal was essentially observed during the short first phase of the kinetics. Preliminary data on mixed biofilms with both species Bacillus and Pseudomonas had shown an increase in their resistance to cleaning comparing to the corresponded monospecies biofilm counterpart. This is really significant for Pseudomonas. The second developed theme considered as a consequence of the above one deals with possible equipment re-contamination by Bacillus spores removed during cleaning operations. Post contamination of food processing equipment during cleaning was thus observed In pipes located at different places in the cleaning loop, as well as in more complex materials as a mixproof valve commonly encountered in Dairies. This work allowed us to identify all the conditions explaining such phenomenon. Equipment hygienic design issues appeared to be here.

Ce travail décrit certains aspects du réseau d’assainissement en tant que réacteur bio-physico-chimique. Les objectifs principaux sont : d’identifier et de quantifier les sources des eaux circulant dans les collecteurs en se basant sur les signatures isotopiques des eaux et des sulfates dissous; de déterminer la nature minéralogique des phases porteuses des métaux lourds et d’étudier leur cycle géochimique par MET et MEB couplés à la EDXS ; de mettre en évidence la présence d’échange de matière entre les eaux usées et les biofilms par CLSM et MET et d’étudier les conditions hydrodynamiques impliquées dans cet échange dans un réacteur pilote (Couette-Poiseuille). On montre que les données isotopiques permettent d’évaluer la présence des évolutions de concentration des éléments transportés dans le réseau. Le rôle du réseau en tant que réacteur apparaît dans l’évolution de la nature minéralogique des phases phosphatées vers l’aval du réseau et dans la précipitation des métaux lourds dans les compartiments anaérobiques sous forme de phases sulfurées néoformées. Les dépôts des regards de façade et les biofilms sont les lieux de cette néoformation. A l’échelle de la matière organique, l’auto-épuration est révélée par les échanges entre les biofilms et les matières en suspension (MES) suite à la présence des fibres de cellulose dans la structure des biofilms et de morceaux de biofilms au sein de la MES. La majeure partie de ces évolutions se situe en amont du réseau où les contrastes physicochimiques sont les plus importants. Finalement, les expériences modèles au sein du réacteur ont montré l’implication de l’hydrodynamisme dans le détachement des biofilms / This work describes the sewer system as an integrated part of the wastewater treatment system. The main objectives of this study were: identification and quantification of water sources collected in sewer system, referring to isotopic signatures of water and dissolved sulfates; identification of the mineralogical nature of trace element carriers and determination of their geochemical evolution within the sewer by TEM and SEM coupled with EDSX ; Evidencing exchanges between sewage and biofilms, using CLSM and TEM, and investigating hydrodynamic conditions controlling this exchange in an experimental set-up (Couette-Poiseuille reactor). The results indicate that isotopic data may be used to study the tightness of sewer lines and to evaluate the evolution of element concentrations along sewer. Implication of the sewer system as a true biophysicochemical reactor is evidenced in our study by the evolution of the mineralogical nature of phosphate phases downstream of the sewer and by heavy metal precipitations in anaerobic conditions as neoformed sulfide phases. Sump pit deposits and biofilms represent the earlier stage of this neoformation. Organic matter biodegradation was revealed by TEM examination of SM whereas the exchange between biofilms and SM was shown by CLSM. Cellulose fibers from SM were found embedded in exopolymer biofilm matrices and detached fragments from biofilms were identified in sewage. The majority of these evolutions are located upstream of sewer system in which the contrast in physicochemical properties are the most significant. Finally, biofilm model investigations and image processing showed that hydrodynamic conditions are largely implicated in biofilm detachment

L’émergence et la multiplication des infections impliquant des bactéries résistantes et multi-résistantes aux traitements par voie antibiotique sont actuellement un défi majeur dans le domaine de la santé. En effet, la résistance des microorganismes aux molécules antibiotiques est devenue un phénomène de plus en plus préoccupant notamment en milieu hospitalier d’où la nécessité de faire appel à de nouvelles thérapies et à de nouveaux agents antimicrobiens plus efficaces. De nombreux agents antibiotiques classiques ont été développés ces dernières années, mais beaucoup d’entre eux présentent encore des risques d'effets secondaires plus ou moins toxiques sur les cellules eucaryotes, et en dépit de leur efficacité importante contre des microorganismes multi-résistants. Ainsi, les peptides antimicrobiens sont considéré comme de bons candidats dans la lutte contre multi-résistantes microorganismes, principalement en raison de leur faible toxicité sur les cellules eucaryotes et de leurs différents modes d'action par rapport aux antibiotiques classiques. En effet, ces derniers sont généralement non spécifiques et sont moins susceptibles de mener aux phénomènes de résistance observés pour les antibiotiques classiques. L'objectif des travaux menés dans ce mémoire était d'étudier les modes d'action des deux agents antimicrobiens différents; i) la colistine, un polypeptide cyclique déjà utilisé pour traiter les infections causées par des bactéries multi-résistantes et ii) la catestatine bovine (CAT), un peptide linéaire récemment découvert faisant partie de la famille des HDP (Host Defense Peptides), c’est-à-dire produite par le système endocrinien et immunitaire des mammifères. Cette étude a été réalisée principalement à l’aide de différentes méthodes de caractérisation physico-chimique telles que la microscopie à force atomique (AFM) et la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier en réflexion totale atténuée (ATR-FTIR). L'activité de la colistine sur des membranes phospholipidiques pures et mixtes (à base de DPPC, DOPC et DPPE) a été suivie en temps réel et in-situ par ces deux techniques. Les modifications de l'empreinte biochimique des membranes, en particulier au niveau de la bande Amide II et du rapport d'intensité intégré Amide II/C=O nous a permis de renforcer l'hypothèse selon laquelle l'activité du peptide était plus intense sur les membranes mixtes que sur les membranes purs. Des modifications similaires dans l'empreinte biochimique de ces membranes ont été observées quand elles avaient été exposées à la catestatine. En outre, la spectroscopie infrarouge a également mis en évidence des changements conformationnels dans la structure de la catestatine, notamment par le passage d’une structure en pelote dite « random coil » à une structure en hélice alpha, et ce uniquement au contact avec la membrane. De tels changements conformationnels pourraient être impliqués dans l'activité antimicrobienne et le mode d'action de ce peptide. En outre, nous nous sommes également intéressé à l’action des deux peptides sur des membranes phospholipidiques plus complexes puisque constituées principalement d’extraits naturels de lipopolysaccharides bactériens (lipide A, LPS-s et le LPS-re). Nos résultats ont mis en évidence que les deux agents antimicrobiens étaient à l’origine d’une réorganisation de la structure des membranes et dans certains cas, le peptide était à l’origine de la formation des pores de différentes tailles. L'influence de l'élasticité de la membrane a également été étudiée à l’aide de la spectroscopie de force (AFM). Cette étude a mis en évidence un impact considérable des peptides sur les propriétés mécaniques des membranes et en particulier sur leur élasticité. Afin de se rapprocher des conditions réelles d'un traitement antimicrobien, nous avons exposé des biofilms bactériens de E. coli différentes de doses de deux peptides antimicrobiens. [...] / The emergence and multiplication of infections involving resistant and multi-resistant antibiotic-resistant bacteria is currently a major challenge in the field of health. Indeed, the resistance of microorganisms to antibiotic molecules has become an increasingly worrying phenomenon, particularly in hospitals, hence the need for new therapies and new antimicrobial agents that are more effective. Many conventional antibiotic agents have been developed in recent years, but many of them still present risks of more or less toxic side effects on eukaryotic cells, and despite their high effectiveness against multi-resistant microorganisms. Thus, antimicrobial peptides are considered good candidates in the fight against multi-resistant microorganisms, mainly because of their low toxicity to eukaryotic cells and their different modes of action compared to conventional antibiotics. Indeed, the latter are generally non-specific and are less likely to lead to the observed resistance phenomena for conventional antibiotics.The aim of the work carried out in this thesis was to study the modes of action of the two different antimicrobial agents; (I) colistin, a cyclic polypeptide already used to treat infections caused by multi-resistant bacteria; and (ii) bovine catestatin (CAT), a recently discovered linear peptide belonging to the Host Defense Peptides Ie produced by the endocrine and immune system of mammals. This study was carried out mainly using different physico-chemical characterization methods such as Atomic Force Microscopy (AFM) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR). The activity of colistin on pure and mixed phospholipid membranes (based on DPPC, DOPC and DPPE) was monitored in real time and in situ by these two techniques. The changes in the biochemical fingerprint of the membranes, in particular in the Amide II band and in the Amide II / C = O integrated intensity ratio allowed us to reinforce the hypothesis that the activity of the peptide was more intense On mixed membranes than on pure membranes. Similar changes in the biochemical footprint of these membranes were observed when they were exposed to catestatin. In addition, infrared spectroscopy has also demonstrated conformational changes in the structure of catestatin, in particular by the passage from a so-called random coil structure to an alpha-helix structure, and only in contact with the structure membrane. Such conformational changes could be implicated in the antimicrobial activity and mode of action of this peptide. In addition, we have also been interested in the action of the two peptides on more complex phospholipid membranes since they consist mainly of natural extracts of bacterial lipopolysaccharides (lipid A, LPS-s and LPS-re). Our results showed that the two antimicrobial agents were responsible for a reorganization of the structure of the membranes and in some cases the peptide was at the origin of the formation of the pores of different sizes. The influence of the elasticity of the membrane has also been studied using force spectroscopy (AFM). This study revealed a considerable impact of the peptides on the mechanical properties of the membranes and in particular on their elasticity. In order to approximate the actual conditions of antimicrobial treatment, we exhibited different bacterial E. coli biofilms from doses of two antimicrobial peptides. This latter study was carried out in real time and in situ using infrared spectroscopy and atomic force microscopy. Infrared spectroscopy allowed us to follow the modifications of the biochemical fingerprint of the biofilm on the course of the treatment. Also provided information on possible changes in bacterial metabolism. In parallel with these measurements, the AFM allowed us to observe the changes in the morphology and mechanical properties of the bacterial biofilm as a function of the antimicrobial treatment applied. [...]

La plupart des bactéries vivent en communautés organisées, appelées biofilms, augmentant leur résistance aux traitements antibiotiques. Ainsi, la formation de biofilms sur les organes et matériels médicaux est considérée comme la cause de la majorité des infections bactériennes. Il est alors important de trouver des traitements pour empêcher ou perturber la formation de ces biofilms. Il a été proposé que les porines de P. Stuartii, Omp-Pst1 et Omp-Pst2, peuvent s’auto-assembler via un steric-zipper, étape responsable du développement initial du biofilm. Ainsi, notre objectif est de synthétiser des inhibiteurs d’interactions entre porines pour limiter ce contact intercellulaire. Nous avons développé des molécules peptidomimétiques basées sur la séquence LGNYR, active dans les deux porines. Pour cela, des réactions de chimie click sur phase solide ont été mises en oeuvre afin de synthétiser des analogues de cette séquence, comme la CuAAC pour introduire un motif triazole, dans une position variable au sein du peptide. Nous avons ainsi développé une méthode rapide et efficace afin de réaliser cette réaction par l’utilisation d’un catalyseur cuivre(I)-N-hétérocyclique carbène stable à l’air. Similairement, de nouvelles conditions ont aussi été mises au point en phase solide afin d’obtenir régiosélectivement des peptides comportant un motif isoxazole 3,4- ou 3,5-disubstitué, par la réaction entre un alcyne et un oxyde de nitrile. Ces cycloadditions 1,3-dipolaires nous ont ainsi permis d’obtenir une première librairie de peptidotriazoles et de peptidoisoxazoles. Il sera enfin possible d’étudier les biofilms grâce à la synthèse de sondes fluorescentes basées sur les inhibiteurs montrant de fortes affinités avec la cible, couplées à un fluorophore dérivé de coumarine. / In the environment, most of bacteria live as organized communities, known as biofilms, enhancing their resistance to antibiotic treatments. Thus the formation of biofilms on organ and indwelling medical devices is considered to cause the majority of bacterial infections in the human body. Thus, to enhance antibiotics efficacy, there is a high need to find treatments to prevent or disrupt biofilm formation. It has been proposed that P. stuartii porins, Omp-Pst1 and Omp-Pst2, can self-associate through a steric zipper, being responsible for the initial development of biofilms. Thus, our objective is to synthesize porin’s self-matching interactions (PSMI) inhibitors to counterfeit this intercellular contact. We developed peptidomimetic molecules based on the LGNYR sequence, that have shown to be active in both porins. Then we used click chemistry to synthesize on solid phase analogues of this sequence, as the solid phase Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) to introduce a triazole moiety into the peptide chain at different positions. We thus developed a fast and efficient method to perform this reaction using a stable copper(I)-N-heterocyclic carbene catalyst. Similarly, new conditions were developed on solid phase to synthesize regioselectively peptides containing a 3,4- or 3,5-disubstituted isoxazole moiety, through the reaction between an alkyne and a nitrile oxide. These 1,3-dipolar cycloadditions allowed us to developed a first library of peptidotriazoles and peptidoisoxazoles. We also obtained fluorescent probes based on the inhibitors showing higher affinity for the target as tools to study biofilm formation.