Spelling suggestions: "subject:"biofunctionality"" "subject:"bifunctionality""
1 |
Anticarcinogenic and Immunomodulatory Properties of the Milk Fat Globule MembraneZanabria Eyzaguirre, Romina 10 May 2013 (has links)
The milk fat globule membrane (MFGM) obtained from bovine milk is a source of bioactive compounds. In this research, the hypothesis that the MFGM possesses anticarcinogenic capacity and immune modulatory properties was tested, along with the hypothesis that processing history of the fat globules will affect the bio-functionality of the MFGM.
Throughout all experiments, lipopolysaccharide (LPS) was minimized by extracting the milk using a catheter, working under aseptic conditions and avoiding contamination via reagents. To study the anticarcinogenic capacity, native MFGM was tested in vitro using two colon adenocarcinoma cell lines (HT-29, Caco-2). Stimulated cells showed a dose-dependent decrease in cell proliferation, starting at very low concentrations (1 μg/mL based on protein) and its efficiency was comparable or even superior to the commercial anticarcinogenic drugs melphalan and C2-ceramide. Cytotoxicity and apoptosis were found to be mechanisms responsible for this bioactivity, as shown by the lactate dehydrogenase enzyme activity and the increase in caspase-3 production.
MFGM- immune modulatory capacity was also tested by studying its effects on splenocyte proliferation, apoptosis and cytokine production. While splenocyte proliferation was not affected when the MFGM isolate was used alone, it suppressed cell division in the presence of polyclonal activators (LPS, Concanavalin A) used to simulate inflammatory conditions. Cytokine production suggests inhibition of the splenocytes’ activation process as the mechanism behind its bioactivity.
Milk heating caused a significant decrease in bioactivity, indicating that protein interactions and denaturation as well as the structural changes caused by this treatment, directly affect the MFGM bio-functionality. Partial hydrolysis (by trypsin and phospholipase-A2) caused a similar effect, suggesting that not only the phospholipids are involved in the anticarcinogenic capacity, but also, the complex mixture of proteins which form part of the MFGM complete system.
In summary, the bioactivity of the MFGM extracted from milk is not limited to its anticarcinogenic but also to its immune regulatory ability, by helping control the response of the immune system when inflammatory conditions arise. However, pre-treatment of the raw material greatly affects this bioactivity, suggesting that greater care may be needed in processing of fat globules to maintain such important characteristics of their components. / Canadian Dairy Council (CDC), Ontario Dairy Council (ODC), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).
|
2 |
Avaliação da biofuncionalidade dos implantes da liga Ti-35Nb-7Zr comparado aos implantes comerciais de Ti-Cp / Biofunctionality evaluation of a Ti-35Nb-7Zr implants compared to Ti-Cp implantsMello, Fabia Zampieri D'Antola de 24 May 2017 (has links)
A Ti-35Nb-7Zr é uma liga Ti-ß desenvolvida pelo Grupo de Biomateriais da Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, que demonstrou, em estudos anteriores, propriedades mecânicas favoráveis para ser usada como biomaterial, tais como, limite de resistência (~800 Mpa), resistência à corrosão e baixo módulo de elasticidade (33 GPa). Uma vez que o implante dentário traz melhores resultados no tocante à função mastigatória, fonação, conforto e estética, melhorando a qualidade de vida das pessoas, o presente estudo descreve a avaliação da biofuncionalidade dos implantes dentários da liga Ti-35Nb-7Zr comparados aos implantes comerciais de Ti-Cp da marca Titaniumfix. A biofuncionalidade foi avaliada por meio de testes in vitro e in vivo. A avaliação in vitro foi realizada com células mesenquimais indiferenciadas retiradas da medula óssea de fêmures de ratos, que foram cultivadas em meio de cultura osteogênico e posteriormente realizados os testes de citotoxicidade, quantificação de proteína total e avaliação da atividade da fosfatase alcalina. A avaliação in vivo compreendeu a realização de implantes de Ti-Cp Titaniumfix e da liga Ti-35Nb-7Zr em tíbias de coelhos para avaliação histológica, histomorfométrica por meio do cálculo da Fração da área óssea ocupada (BAFO) e aposição óssea, e de remoção ao torque com intuito de avaliar a osteointegração. Considerando os resultados obtidos nesta pesquisa, com relação aos testes in vitro, é possível concluir que a liga possui maior hidrofilicidade que o Ti-Cp; apresenta espraiamento celular similar ao Ti-Cp o que corrobora para o resultado de viabilidade celular classificando-a como não citotóxica. Nos testes de quantificação de proteína total e atividade da fosfatase alcalina a liga apresenta resultados similares ao Ti-Cp, favorecendo a ocorrência de diferenciação e proliferação das células osteoblásticas. Desta forma, pode-se concluir que a liga possui boa compatibilidade in vitro. Os resultados obtidos nas avaliações in vivo, por meio da fração de área óssea ocupada (BAFO), comprovam a semelhança entre a liga e o Ti-Cp pois tiveram o valor percentual de osso neoformado similar. A análise de fluorescência, após a administração dos marcadores tetraciclina e alizarina, mostra que a aposição óssea também foi semelhante entre a liga e o Ti-Cp nos períodos estudados. Com relação a força de interação avaliada pelo torque de remoção é possível afirmar que a liga apresenta osteointegração comparável aos implantes comerciais Ti-Cp. Esses resultados demonstraram que os implantes da liga Ti-35Nb-7Zr apresentaram biocompatibilidade e biofuncionalidade semelhantes ao dos implantes de Ti-Cp. Além de possuir um baixo módulo de elasticidade, a liga apresentou uma osteointegração bem similar ao Ti-Cp, reunindo características que demonstram seu potencial para ser usada como biomaterial intraósseo. / Ti-35Nb-7Zr is a Ti-ß alloy developed by the Biomaterials Group of the Lorena School of Engineering of the University of São Paulo, which demonstrated, in previous studies, favorable mechanical properties to be used as biomaterial, such as resistance (~800 Mpa), corrosion resistance and low modulus of elasticity (33 GPa). Since the dental implant brings better results regarding masticatory function, phonation, comfort and aesthetics, improving the quality of life of the people, the present study describes the evaluation of the biofunctionality of the Ti-35Nb-7Zr ally dental implants compared to the Titaniumfix implants of Ti-Cp. The biofunctionality was evaluated by means of in vitro and in vivo tests. The in vitro evaluation was perfomed with undifferentiated mesenchymal cells removed from the bone marrow of rat femurs, which were cultured in osteogenic culture medium and subsequently perfomed cytotoxicity tests, total protein quantification and evaluation of alkaline phosphatase activity. The in vivo evaluation included the implantation of Ti-Cp Titaniumfix and Ti-35Nb-7Zr alloy implants in rabbit tibiae for histological, histomorphometric evaluation by calculating the Bone Area Fractional Occupied (BAFO) and bone apposition, and torque removal in order to evaluate the osseointegration. Considering the results obtained in this research, related to in vitro tests, it is possible to conclude that the alloy has a higher hydrophilicity than Ti-Cp; Show cellular spreading similar to Ti-Cp, which corroborates the result of cell viability classifying it as non-cytotoxic. In the tests of total protein quantification and alkaline phosphatase activity the alloy presents results similar to Ti-Cp, favoring the occurrence of differentiation and proliferation of osteoblastic cells. In this way, it can be concluded that the alloy has good compatiblity in vitro. The results obtained in the in vivo evaluations, through the BAFO, confirm the similarity between the alloy and Ti-Cp, since they had the percentage value similar to neoformed bone. Fluorescence analysis, after administration of the tetracycline and alisarin markers, show that bone apposition was also similar between the alloy and Ti-Cp in the periods studied. Regarding the interaction force evaluated by the removal torque, it is possible to affirm that the alloy show osseointegration comparable to commercial Ti-Cp implants. These results demonstrated that Ti-35Nb-7Zr alloy implants had similar biocompatibility and biofunctionality to Ti-Cp implants. In addition to having a low modulus of elasticity, the alloy presented an osseointegration very similar to Ti-Cp, bringing together characteristics that demonstrate its potential to be used as an intraosseous biomaterial.
|
3 |
Avaliação da biofuncionalidade dos implantes da liga Ti-35Nb-7Zr comparado aos implantes comerciais de Ti-Cp / Biofunctionality evaluation of a Ti-35Nb-7Zr implants compared to Ti-Cp implantsFabia Zampieri D'Antola de Mello 24 May 2017 (has links)
A Ti-35Nb-7Zr é uma liga Ti-ß desenvolvida pelo Grupo de Biomateriais da Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, que demonstrou, em estudos anteriores, propriedades mecânicas favoráveis para ser usada como biomaterial, tais como, limite de resistência (~800 Mpa), resistência à corrosão e baixo módulo de elasticidade (33 GPa). Uma vez que o implante dentário traz melhores resultados no tocante à função mastigatória, fonação, conforto e estética, melhorando a qualidade de vida das pessoas, o presente estudo descreve a avaliação da biofuncionalidade dos implantes dentários da liga Ti-35Nb-7Zr comparados aos implantes comerciais de Ti-Cp da marca Titaniumfix. A biofuncionalidade foi avaliada por meio de testes in vitro e in vivo. A avaliação in vitro foi realizada com células mesenquimais indiferenciadas retiradas da medula óssea de fêmures de ratos, que foram cultivadas em meio de cultura osteogênico e posteriormente realizados os testes de citotoxicidade, quantificação de proteína total e avaliação da atividade da fosfatase alcalina. A avaliação in vivo compreendeu a realização de implantes de Ti-Cp Titaniumfix e da liga Ti-35Nb-7Zr em tíbias de coelhos para avaliação histológica, histomorfométrica por meio do cálculo da Fração da área óssea ocupada (BAFO) e aposição óssea, e de remoção ao torque com intuito de avaliar a osteointegração. Considerando os resultados obtidos nesta pesquisa, com relação aos testes in vitro, é possível concluir que a liga possui maior hidrofilicidade que o Ti-Cp; apresenta espraiamento celular similar ao Ti-Cp o que corrobora para o resultado de viabilidade celular classificando-a como não citotóxica. Nos testes de quantificação de proteína total e atividade da fosfatase alcalina a liga apresenta resultados similares ao Ti-Cp, favorecendo a ocorrência de diferenciação e proliferação das células osteoblásticas. Desta forma, pode-se concluir que a liga possui boa compatibilidade in vitro. Os resultados obtidos nas avaliações in vivo, por meio da fração de área óssea ocupada (BAFO), comprovam a semelhança entre a liga e o Ti-Cp pois tiveram o valor percentual de osso neoformado similar. A análise de fluorescência, após a administração dos marcadores tetraciclina e alizarina, mostra que a aposição óssea também foi semelhante entre a liga e o Ti-Cp nos períodos estudados. Com relação a força de interação avaliada pelo torque de remoção é possível afirmar que a liga apresenta osteointegração comparável aos implantes comerciais Ti-Cp. Esses resultados demonstraram que os implantes da liga Ti-35Nb-7Zr apresentaram biocompatibilidade e biofuncionalidade semelhantes ao dos implantes de Ti-Cp. Além de possuir um baixo módulo de elasticidade, a liga apresentou uma osteointegração bem similar ao Ti-Cp, reunindo características que demonstram seu potencial para ser usada como biomaterial intraósseo. / Ti-35Nb-7Zr is a Ti-ß alloy developed by the Biomaterials Group of the Lorena School of Engineering of the University of São Paulo, which demonstrated, in previous studies, favorable mechanical properties to be used as biomaterial, such as resistance (~800 Mpa), corrosion resistance and low modulus of elasticity (33 GPa). Since the dental implant brings better results regarding masticatory function, phonation, comfort and aesthetics, improving the quality of life of the people, the present study describes the evaluation of the biofunctionality of the Ti-35Nb-7Zr ally dental implants compared to the Titaniumfix implants of Ti-Cp. The biofunctionality was evaluated by means of in vitro and in vivo tests. The in vitro evaluation was perfomed with undifferentiated mesenchymal cells removed from the bone marrow of rat femurs, which were cultured in osteogenic culture medium and subsequently perfomed cytotoxicity tests, total protein quantification and evaluation of alkaline phosphatase activity. The in vivo evaluation included the implantation of Ti-Cp Titaniumfix and Ti-35Nb-7Zr alloy implants in rabbit tibiae for histological, histomorphometric evaluation by calculating the Bone Area Fractional Occupied (BAFO) and bone apposition, and torque removal in order to evaluate the osseointegration. Considering the results obtained in this research, related to in vitro tests, it is possible to conclude that the alloy has a higher hydrophilicity than Ti-Cp; Show cellular spreading similar to Ti-Cp, which corroborates the result of cell viability classifying it as non-cytotoxic. In the tests of total protein quantification and alkaline phosphatase activity the alloy presents results similar to Ti-Cp, favoring the occurrence of differentiation and proliferation of osteoblastic cells. In this way, it can be concluded that the alloy has good compatiblity in vitro. The results obtained in the in vivo evaluations, through the BAFO, confirm the similarity between the alloy and Ti-Cp, since they had the percentage value similar to neoformed bone. Fluorescence analysis, after administration of the tetracycline and alisarin markers, show that bone apposition was also similar between the alloy and Ti-Cp in the periods studied. Regarding the interaction force evaluated by the removal torque, it is possible to affirm that the alloy show osseointegration comparable to commercial Ti-Cp implants. These results demonstrated that Ti-35Nb-7Zr alloy implants had similar biocompatibility and biofunctionality to Ti-Cp implants. In addition to having a low modulus of elasticity, the alloy presented an osseointegration very similar to Ti-Cp, bringing together characteristics that demonstrate its potential to be used as an intraosseous biomaterial.
|
4 |
Biologische Verfügbarkeit des Zytokins Leukemia inhibitory factor nach kovalenter Ankopplung an Polymeroberflächen / Bioavailability of cytokine leukemia inhibitory factor covalently bound to polymer surfacesAlberti, Kristin 10 February 2011 (has links) (PDF)
Für medizinische Anwendungen sind Stammzellen aufgrund ihrer Eigenschaften (Selbsterneuerung, hohe Proliferationsrate und Differenzierungsmöglichkeit in verschiedene Zelltypen) beispielsweise in den Bereichen des regenerativen Gewebeersatzes und der Zelltherapie sehr interessant. In vivo umgibt die Stammzellen eine definierte Mikroumgebung, die sie unterstützt sich zu teilen, ihren undifferenzierten Status aufrecht zu erhalten und Tochterzellen für das Wachstum, die routinemäßige Erneuerung oder den Ersatz von Gewebe zu produzieren. Diese Mikroumgebungen werden als Stammzellnischen bezeichnet. Für die Kultivierung von Stammzellen in vitro muss die in vivo-Situation möglichst getreu nachgestaltet werden. Ziel der Forschung ist die Schaffung einer künstlichen Umgebung, die sowohl die funktionellen Eigenschaften einer Nische besitzt als auch frei von Risiken xenogener Pathogene oder Gewebeunverträglichkeiten für die Anwendung am humanen Organismus eingesetzt werden kann. Einen Ansatz dafür bietet beispielsweise die Kopplung von Faktoren, die für den Erhalt der Stammzelleigenschaften notwendig sind, an synthetische Oberflächen.
Ausgehend vom Bedarf an Kultur- oder Modellsystemen für die Expansion von (embryonalen) Stammzellen sollte in dieser Arbeit analysiert werden, ob alternierende Maleinsäureanhydrid (MA)-Copolymere ein geeignetes Trägersystem für die biofunktionelle kovalente Immobilisierung spezifischer Zytokine sind und dadurch unter anderem als künstliche Stammzellnische Anwendung finden können. MA-Copolymere eignen sich aufgrund ihrer spontanen Reaktion mit Aminogruppen für die Immobilisierung von Proteinen.
Das Zytokin LIF (Leukemia inhibitory factor) existiert in vivo auch in immobilisierter Form und ist in embryonalen Mausstammzellen (mESC) allein in der Lage, das Stammzellpotential dieser Zellen zu erhalten. Aus diesem Grund ist LIF für die Analyse der Aufgabenstellung geeignet. Nach der Charakterisierung LIF-modifizierter Oberflächen wurde die biologische Verfügbarkeit des kovalent immobilisierten Zytokins mit Hilfe von LIF-sensitiven Fibroblasten und mESC der Linie R1 überprüft. Anschließend wurde im Mausmodell in vivo der Erhalt der Pluripotenz der mESC durch immobilisiertes LIF analysiert. Dafür standen die Oberflächen Poly(ethylen-alt-maleinsäureanhydrid) (PEMA) und Poly(octadecen-alt-maleinsäureanhydrid) (POMA) jeweils ohne und mit Polyethylenglykol (PEG7)-Modifizierung zur Verfügung, an die LIF kovalent gekoppelt wurde. Zusätzlich wurde LIF physisorptiv an einer Kollagen-Fibronektin-Matrix über hydrolysiertem POMA immobilisiert.
Mit Hilfe von radioaktiv markiertem LIF konnte gezeigt werden, dass die Gesamtbeladungsmenge mit Zytokin von den Eigenschaften der MA-modifizierten Träger abhing. Auf PEMA konnten mit steigenden Immobilisierungskonzentrationen höhere Belegungsdichten an der Oberfläche erreicht werden, die im analysierten Bereich eine lineare Abhängigkeit zeigten. Aufgrund der starken Quellung in wässrigen Lösungen war eine Einlagerung von LIF-Molekülen in die Polymerschicht möglich und führte bei hohen Immobilisierungskonzentrationen auch nach 3 Tagen Inkubation mit proteinhaltigem Medium noch zur Verdrängung nicht kovalent gebundener Zytokinmoleküle aus PEMA-Oberflächen. Obwohl ein Teil des LIF in die Polymerschicht eindrang, war der Großteil der Moleküle für einen spezifischen Antikörper zugänglich. Hydrophobe Oberflächen mit POMA konnten bei hohen Immobilisierungskonzentrationen weniger LIF binden und zeigten Sättigungsverhalten der Oberflächen bei einer Belegungsdichte von 178 ng/cm^2 LIF. Eine Freisetzung von LIF nach mehr als 3 Tagen konnte nicht beobachtet werden. Gleichzeitig war hier aufgrund der hydrophoben Polymerseitenketten die Antikörperzugänglichkeit deutlich reduziert. Wegen des geringen Quellungsverhaltens von POMA in wässrigen Lösungen konnte eine Einlagerung des immobilisierten Zytokins in die Polymerschicht aber ausgeschlossen werden.
Die kovalente LIF-Immobilisierung über PEG7-Spacer führte im Vergleich zu den nicht PEG-modifizierten Oberflächen PEMA und POMA zu jeweils geringeren Belegungsdichten, ohne dabei den Charakter der Abhängigkeit von der Immobilisierungskonzentration zu verändern (linear für PEMA+PEG7, Sättigung für POMA+PEG7). Die schlechte Antikörperzugänglichkeit von immobilisiertem LIF auf POMA konnte durch die Einführung des PEG7-Spacers deutlich verbessert werden und erreichte einen Wert ähnlich dem der hydrophilen PEMA-Oberflächen. Kovalent immobilisiertes LIF zeigte auf den vier MA-Oberflächen homogene und definiert einstellbare Belegungsdichten auf den einzelnen Proben.
Die physisorptive Immobilisierung von LIF an extrazelluläre Matrixkomponenten auf hydrolysiertem POMA führte zu inhomogenen und bereits bei geringen Immobilisierungskonzentrationen instabilen Belegungsdichten. Die Einstellung definierter Belegungsdichten und die homogene Verfügbarkeit des Zytokins sind für die spätere Anwendung bei der Kultivierung wichtig, da so allen Zellen die gleiche definierte Zytokindosis unabhängig von der Oberflächencharakteristik präsentiert wird und Populationsunterschiede vermieden werden.
LIF-sensitive Mausfibroblasten der Linie NIH3T3 reagierten auf immobilisiertes LIF mit der Aktivierung des Signalwegproteins STAT3. Durch den direkten Vergleich von STAT3-Aktivierungsprofilen nach Stimulation mit gelöstem oder immobilisiertem LIF konnte gezeigt werden, dass durch beide Präsentationsformen innerhalb der ersten 15 Minuten nach Stimulationsbeginn eine starke Aktivierung von STAT3 erfolgt, die anschließend wieder abklingt. Die Profile beider Präsentationsformen unterschieden sich in ihren Intensitäten nur bei der starken STAT3-Aktivierung. Dabei ergaben sich bei gelöstem LIF aufgrund der größeren Kontaktfläche mit Zytokin (gesamte Zelloberfläche) etwas stärkere Aktivierungen. Durch die sehr ähnlichen Aktivierungsprofile konnte nachgewiesen werden, dass das Zytokin LIF für Zellen zugänglich an MA-Copolymere mit und ohne Spacer-Modifizierung immobilisiert werden kann. Dabei lag ein Teil der Moleküle in einer Konformation und Orientierung gebunden vor, die die Funktionalität des Zytokins erhalten konnten. Zwischen den Oberflächen mit kovalenter LIF-Immobilisierung konnten keine wesentlichen Unterschiede in der STAT3-Aktivierung festgestellt werden. LIF war an all diesen Oberflächen für die LIF-sensitiven NIH3T3 Mausfibroblasten biologisch verfügbar.
LIF-abhängige embryonale Mausstammzellen (mESC) reagierten nach 72 Stunden LIF-Stimulation mit der Aktivierung von STAT3. Bei Belegungsdichten ab 8 ng/cm^2 kovalent immobilisiertem LIF auf POMA mit und ohne PEG7-Spacer konnten ähnliche Aktivierungen wie durch die Stimulation mit gelöstem LIF festgestellt werden. Dies bestätigte die biofunktionelle LIF-Immobilisierung. Zwischen den POMA-Oberflächen mit und ohne PEG7 war dabei kein deutlicher Unterschied erkennbar. Eine reduzierte Zugänglichkeit des Antikörpers auf POMA beeinflusste demnach die biologische Verfügbarkeit des Zytokins für die mESC nicht. Der Erhalt des Stammzellpotentials durch kovalent an POMA gebundenes LIF konnte in vitro durch die Präsenz von Oct4 im Zellkern der mESC nachgewiesen werden. Durch die instabile Immobilisierung bei physisorptiver Assoziation des Zytokins an Matrixkomponenten über hydrolysiertem POMA reduzierte sich der Erhalt des Stammzellpotentials auf diesen Oberflächen stark. Kovalent immobilisiertes LIF dagegen konnte auch während der Kultur über mehrere Passagen hinweg die Pluripotenz der murinen ESC erhalten. Nach der Fusion mit Blastozysten beteiligten sich diese kultivierten Zellen in vivo erfolgreich an der Bildung von Chimären. Dabei konnten keine Unterschiede der Chimärenhäufigkeit zwischen der Kultivierung der mESC mit gelöstem oder kovalent an POMA immobilisiertem LIF festgestellt werden. Kovalent an MA-Copolymere immobilisiertes LIF ist demnach in der Lage, gelöstes LIF vollständig zu ersetzen und über mehrere Passagen hinweg allein das Stammzellpotential von mESC zu erhalten.
Die Experimente zeigten, dass sich MA-Copolymere für die funktionelle kovalente Immobilisierung von Signalmolekülen eignen. Dabei konnten keine starken Unterschiede bei der Reaktion der Zellen auf die Oberflächen PEMA oder POMA festgestellt werden. Auch die Einführung eines zusätzlichen Spacers war für die Signaltransduktion nach Stimulation mit kovalent immobilisiertem LIF nicht notwendig. Für künftige Arbeiten zur kovalenten Immobilisierung von LIF an MA-Copolymeren ist deshalb aus Stabilitäts- und Effizienzgründen die Oberfläche POMA zu bevorzugen. Diese Favorisierung kann jedoch aufgrund der unterschiedlichen Tertiärstruktur anderer Proteine und ihrer verschiedenen Steifigkeiten sowie bei der Verwendung anderer Zelltypen nicht automatisch für ein anderes Modellsystem übernommen werden. Die Verwendung hydrophiler Oberflächen oder die Kopplung über Spacer sollte demnach in Abhängigkeit vom zu immobilisierenden Protein und den auszusiedelnden Zellen geprüft werden. Die vorgestellte Kopplungsmethode umgeht die Modifikation des Proteins sowie Behandlungen zur Vernetzung des Zytokins. Die Immobilisierungsreaktion ist bei Raumtemperatur und Umgebungsdruck sowie unter sterilen Bedingungen durchführbar. Immobilisierte Zytokine werden homogen kovalent an der Oberfläche gebunden und sind dort für die Zellen zugänglich. Außerdem ermöglicht die Einstellung definierter Belegungsdichten die gezielte Applikation von Zytokindosen. MA-Copolymere sind somit nicht nur für die Kultivierung von Stammzellen unter Erhaltung des Stammzellstatus einsetzbar, sondern eignen sich auch für Differenzierungsstudien.
Teilergebnisse dieser Arbeit wurden publiziert unter
K. Alberti, R.E. Davey, K. Onishi, S. George, K. Salchert, F.P. Seib, M. Bornhäuser, T. Pompe, A. Nagy, C.Werner, and P.W. Zandstra. Functional immobilization of signaling proteins enables control of stem cell fate. Nat Methods, 5(7):645–650, Jul 2008 und
T. Pompe, K. Salchert, K. Alberti, P.W. Zandstra, and C. Werner. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protocols, 5(6):1042–1050, Jun 2010. / In vitro cultivation of (embryonic) stem cells requires a defined environment. Together different properties as cytokine supplement, extracellular matrix composition or topographic design can mimic this stem cell niche in an artificial system. For mouse embryonic stem cells the cytokine leukemia inhibitory factor (LIF) is able to keep those cells in undifferentiated state and to enhance self renewal without the supplement of other factors. In vivo LIF exists in both diffusible and extracellular matrix immobilized form. This work investigates whether LIF can be immobilized covalently to alternating maleic anhydride (MA)-copolymers in a functional manner. When bioavailable, covalently immobilized LIF should be able to interact with specific cytokine receptor subunits and provide information to keep murine embryonic stem cells in a pluripotent state.
In aqueous solution with neutral pH (such as phosphate buffered saline, PBS) and ambient temperature and pressure MA-copolymers react spontaneously with aminogroups and therefore represent a useful support for covalent protein immobilization. Depending on the choice of co-monomer, properties of copolymer vary: ethylene results in hydrophilic poly-(ethylene-alt-maleic anhydride) (PEMA), octadecene in more hydrophobic poly-(octadecene-alt-maleic anhydride) (POMA). LIF can be covalently immobilized onto the MA-copolymers as shown by radiolabeling experiments. The amount of cytokine coupled to PEMA increased linear whereas on POMA saturation could be observed for higher concentrations. A subsequent coupling of a polyethylene glycol spacer (PEG7) further modified the properties and led to more hydrophilic surfaces. The amount of LIF per area decreased in comparison to MA-copolymers without the spacer but the graph characteristics remained unaltered (linear for PEMA+PEG7, saturation for POMA+PEG7). During the first three days in buffer solution supplemented with bovine serum albumin, unbound LIF was displaced and the amount of immobilized cytokine remained stable. This Stability after preincubation allowed to immobilize required amounts of LIF per area. Although hydrophilic surfaces with PEMA showed swelling behavior resulting in increased layer thickness after incubation in PBS, accessibility to LIF for an antibody was not impaired. The amounts per area detected by radiolabeling method and using the antibody were similar and indicated that LIF was not covered by copolymers. For cell culture addition of diffusible as well as immobilized growth factors or cytokines requires dosage control. Frequently it is necessary to provide homogeneous distribution of the factor of interest. In the present study analysis by fluorescence microscopy confirmed homogeneity for surfaces with covalently immobilized LIF (iLIF) but not for LIF physisorbed to extracellular matrix components collagen type I and fibronectin.
LIF transduces signals via the JAK/STAT pathway. Preliminary experiments with LIF-sensitive fibroblasts showed similar activation of STAT3 after stimulation with immobilized or diffusible LIF. The results of STAT3 activation revealed an activation profile with high intensities within the first 15 minutes for both immobilized and diffusible LIF followed by decrease. STAT3 activation profiles were similar on different surfaces and independent of LIF presentation mode. These results revealed that fibroblasts could recognize covalently immobilized LIF onto MA-copolymers and were able to activate STAT3. In the absence of LIF mESC start to differentiate within 24 to 36 hours and loose their pluripotency. To confirm the functional immobilization of LIF mouse embryonic stem cells (mESC) were cultivated on iLIF-modified POMA or POMA+PEG7 surfaces for 72 hours and stained for activated STAT3. Results showed a dose-dependent activation increasing with the iLIF amount per area. Higher amounts (8 and 75 ng/cm^2) of iLIF activated STAT3 similar to 10 ng/ml diffusible LIF. Introduction of PEG7 spacer did not further increased STAT3 activation. Both, the amount of ESC marker Oct4 and the percentage of Oct4-positive cells increased with higher amounts of iLIF and showed similar results as obtained with 10 ng/ml diffusible LIF. Murine ESC cultivated on LIF physisorbed to matrix components expressed similar amounts of transcription factor Oct4 compared to unstimulated cells. STAT3 activation and Oct4 expression in the absence of diffusible cytokine indicated a functional covalent immobilization of LIF. To confirm the pluripotency, mESC were stimulated for 6 to 8 subcultures only with iLIF, cell aggregates were fused with mouse embryos and implanted in pseudopregnant surrogate mothers. Three weeks after birth the contribution of mESC aggregates to chimera was evaluated. ESC stimulated with iLIF only contributed to chimera formation with around the same frequency as mESC cultivated with 10 ng/ml diffusible LIF. Thus, iLIF maintained pluripotency of mESC during in vitro expansion and could replace diffusible LIF.
As shown by the experiments, MA-copolymers provide a support to covalently immobilize cell signaling molecules in a functional manner. This method of coupling does not need any protein modification or cross-linking treatment after protein incubation. Reaction can be carried out under sterile conditions at ambient temperature and pressure. The immobilized ligand is distributed equally on the supporting copolymer and the adjustment of required ligand amounts is possible. These properties characterize MA-copolymers as a suitable support to immobilize cell signaling molecules not only for keeping the stem cell fate but also for differentiation studies.
Parts of this work were published:
K. Alberti, R.E. Davey, K. Onishi, S. George, K. Salchert, F.P. Seib, M. Bornhäuser, T. Pompe, A. Nagy, C.Werner, and P.W. Zandstra. Functional immobilization of signaling proteins enables control of stem cell fate. Nat Methods, 5(7):645–650, Jul 2008.
T. Pompe, K. Salchert, K. Alberti, P.W. Zandstra, and C. Werner. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protocols, 5(6):1042–1050, Jun 2010.
|
5 |
Biologische Verfügbarkeit des Zytokins Leukemia inhibitory factor nach kovalenter Ankopplung an PolymeroberflächenAlberti, Kristin 07 January 2011 (has links)
Für medizinische Anwendungen sind Stammzellen aufgrund ihrer Eigenschaften (Selbsterneuerung, hohe Proliferationsrate und Differenzierungsmöglichkeit in verschiedene Zelltypen) beispielsweise in den Bereichen des regenerativen Gewebeersatzes und der Zelltherapie sehr interessant. In vivo umgibt die Stammzellen eine definierte Mikroumgebung, die sie unterstützt sich zu teilen, ihren undifferenzierten Status aufrecht zu erhalten und Tochterzellen für das Wachstum, die routinemäßige Erneuerung oder den Ersatz von Gewebe zu produzieren. Diese Mikroumgebungen werden als Stammzellnischen bezeichnet. Für die Kultivierung von Stammzellen in vitro muss die in vivo-Situation möglichst getreu nachgestaltet werden. Ziel der Forschung ist die Schaffung einer künstlichen Umgebung, die sowohl die funktionellen Eigenschaften einer Nische besitzt als auch frei von Risiken xenogener Pathogene oder Gewebeunverträglichkeiten für die Anwendung am humanen Organismus eingesetzt werden kann. Einen Ansatz dafür bietet beispielsweise die Kopplung von Faktoren, die für den Erhalt der Stammzelleigenschaften notwendig sind, an synthetische Oberflächen.
Ausgehend vom Bedarf an Kultur- oder Modellsystemen für die Expansion von (embryonalen) Stammzellen sollte in dieser Arbeit analysiert werden, ob alternierende Maleinsäureanhydrid (MA)-Copolymere ein geeignetes Trägersystem für die biofunktionelle kovalente Immobilisierung spezifischer Zytokine sind und dadurch unter anderem als künstliche Stammzellnische Anwendung finden können. MA-Copolymere eignen sich aufgrund ihrer spontanen Reaktion mit Aminogruppen für die Immobilisierung von Proteinen.
Das Zytokin LIF (Leukemia inhibitory factor) existiert in vivo auch in immobilisierter Form und ist in embryonalen Mausstammzellen (mESC) allein in der Lage, das Stammzellpotential dieser Zellen zu erhalten. Aus diesem Grund ist LIF für die Analyse der Aufgabenstellung geeignet. Nach der Charakterisierung LIF-modifizierter Oberflächen wurde die biologische Verfügbarkeit des kovalent immobilisierten Zytokins mit Hilfe von LIF-sensitiven Fibroblasten und mESC der Linie R1 überprüft. Anschließend wurde im Mausmodell in vivo der Erhalt der Pluripotenz der mESC durch immobilisiertes LIF analysiert. Dafür standen die Oberflächen Poly(ethylen-alt-maleinsäureanhydrid) (PEMA) und Poly(octadecen-alt-maleinsäureanhydrid) (POMA) jeweils ohne und mit Polyethylenglykol (PEG7)-Modifizierung zur Verfügung, an die LIF kovalent gekoppelt wurde. Zusätzlich wurde LIF physisorptiv an einer Kollagen-Fibronektin-Matrix über hydrolysiertem POMA immobilisiert.
Mit Hilfe von radioaktiv markiertem LIF konnte gezeigt werden, dass die Gesamtbeladungsmenge mit Zytokin von den Eigenschaften der MA-modifizierten Träger abhing. Auf PEMA konnten mit steigenden Immobilisierungskonzentrationen höhere Belegungsdichten an der Oberfläche erreicht werden, die im analysierten Bereich eine lineare Abhängigkeit zeigten. Aufgrund der starken Quellung in wässrigen Lösungen war eine Einlagerung von LIF-Molekülen in die Polymerschicht möglich und führte bei hohen Immobilisierungskonzentrationen auch nach 3 Tagen Inkubation mit proteinhaltigem Medium noch zur Verdrängung nicht kovalent gebundener Zytokinmoleküle aus PEMA-Oberflächen. Obwohl ein Teil des LIF in die Polymerschicht eindrang, war der Großteil der Moleküle für einen spezifischen Antikörper zugänglich. Hydrophobe Oberflächen mit POMA konnten bei hohen Immobilisierungskonzentrationen weniger LIF binden und zeigten Sättigungsverhalten der Oberflächen bei einer Belegungsdichte von 178 ng/cm^2 LIF. Eine Freisetzung von LIF nach mehr als 3 Tagen konnte nicht beobachtet werden. Gleichzeitig war hier aufgrund der hydrophoben Polymerseitenketten die Antikörperzugänglichkeit deutlich reduziert. Wegen des geringen Quellungsverhaltens von POMA in wässrigen Lösungen konnte eine Einlagerung des immobilisierten Zytokins in die Polymerschicht aber ausgeschlossen werden.
Die kovalente LIF-Immobilisierung über PEG7-Spacer führte im Vergleich zu den nicht PEG-modifizierten Oberflächen PEMA und POMA zu jeweils geringeren Belegungsdichten, ohne dabei den Charakter der Abhängigkeit von der Immobilisierungskonzentration zu verändern (linear für PEMA+PEG7, Sättigung für POMA+PEG7). Die schlechte Antikörperzugänglichkeit von immobilisiertem LIF auf POMA konnte durch die Einführung des PEG7-Spacers deutlich verbessert werden und erreichte einen Wert ähnlich dem der hydrophilen PEMA-Oberflächen. Kovalent immobilisiertes LIF zeigte auf den vier MA-Oberflächen homogene und definiert einstellbare Belegungsdichten auf den einzelnen Proben.
Die physisorptive Immobilisierung von LIF an extrazelluläre Matrixkomponenten auf hydrolysiertem POMA führte zu inhomogenen und bereits bei geringen Immobilisierungskonzentrationen instabilen Belegungsdichten. Die Einstellung definierter Belegungsdichten und die homogene Verfügbarkeit des Zytokins sind für die spätere Anwendung bei der Kultivierung wichtig, da so allen Zellen die gleiche definierte Zytokindosis unabhängig von der Oberflächencharakteristik präsentiert wird und Populationsunterschiede vermieden werden.
LIF-sensitive Mausfibroblasten der Linie NIH3T3 reagierten auf immobilisiertes LIF mit der Aktivierung des Signalwegproteins STAT3. Durch den direkten Vergleich von STAT3-Aktivierungsprofilen nach Stimulation mit gelöstem oder immobilisiertem LIF konnte gezeigt werden, dass durch beide Präsentationsformen innerhalb der ersten 15 Minuten nach Stimulationsbeginn eine starke Aktivierung von STAT3 erfolgt, die anschließend wieder abklingt. Die Profile beider Präsentationsformen unterschieden sich in ihren Intensitäten nur bei der starken STAT3-Aktivierung. Dabei ergaben sich bei gelöstem LIF aufgrund der größeren Kontaktfläche mit Zytokin (gesamte Zelloberfläche) etwas stärkere Aktivierungen. Durch die sehr ähnlichen Aktivierungsprofile konnte nachgewiesen werden, dass das Zytokin LIF für Zellen zugänglich an MA-Copolymere mit und ohne Spacer-Modifizierung immobilisiert werden kann. Dabei lag ein Teil der Moleküle in einer Konformation und Orientierung gebunden vor, die die Funktionalität des Zytokins erhalten konnten. Zwischen den Oberflächen mit kovalenter LIF-Immobilisierung konnten keine wesentlichen Unterschiede in der STAT3-Aktivierung festgestellt werden. LIF war an all diesen Oberflächen für die LIF-sensitiven NIH3T3 Mausfibroblasten biologisch verfügbar.
LIF-abhängige embryonale Mausstammzellen (mESC) reagierten nach 72 Stunden LIF-Stimulation mit der Aktivierung von STAT3. Bei Belegungsdichten ab 8 ng/cm^2 kovalent immobilisiertem LIF auf POMA mit und ohne PEG7-Spacer konnten ähnliche Aktivierungen wie durch die Stimulation mit gelöstem LIF festgestellt werden. Dies bestätigte die biofunktionelle LIF-Immobilisierung. Zwischen den POMA-Oberflächen mit und ohne PEG7 war dabei kein deutlicher Unterschied erkennbar. Eine reduzierte Zugänglichkeit des Antikörpers auf POMA beeinflusste demnach die biologische Verfügbarkeit des Zytokins für die mESC nicht. Der Erhalt des Stammzellpotentials durch kovalent an POMA gebundenes LIF konnte in vitro durch die Präsenz von Oct4 im Zellkern der mESC nachgewiesen werden. Durch die instabile Immobilisierung bei physisorptiver Assoziation des Zytokins an Matrixkomponenten über hydrolysiertem POMA reduzierte sich der Erhalt des Stammzellpotentials auf diesen Oberflächen stark. Kovalent immobilisiertes LIF dagegen konnte auch während der Kultur über mehrere Passagen hinweg die Pluripotenz der murinen ESC erhalten. Nach der Fusion mit Blastozysten beteiligten sich diese kultivierten Zellen in vivo erfolgreich an der Bildung von Chimären. Dabei konnten keine Unterschiede der Chimärenhäufigkeit zwischen der Kultivierung der mESC mit gelöstem oder kovalent an POMA immobilisiertem LIF festgestellt werden. Kovalent an MA-Copolymere immobilisiertes LIF ist demnach in der Lage, gelöstes LIF vollständig zu ersetzen und über mehrere Passagen hinweg allein das Stammzellpotential von mESC zu erhalten.
Die Experimente zeigten, dass sich MA-Copolymere für die funktionelle kovalente Immobilisierung von Signalmolekülen eignen. Dabei konnten keine starken Unterschiede bei der Reaktion der Zellen auf die Oberflächen PEMA oder POMA festgestellt werden. Auch die Einführung eines zusätzlichen Spacers war für die Signaltransduktion nach Stimulation mit kovalent immobilisiertem LIF nicht notwendig. Für künftige Arbeiten zur kovalenten Immobilisierung von LIF an MA-Copolymeren ist deshalb aus Stabilitäts- und Effizienzgründen die Oberfläche POMA zu bevorzugen. Diese Favorisierung kann jedoch aufgrund der unterschiedlichen Tertiärstruktur anderer Proteine und ihrer verschiedenen Steifigkeiten sowie bei der Verwendung anderer Zelltypen nicht automatisch für ein anderes Modellsystem übernommen werden. Die Verwendung hydrophiler Oberflächen oder die Kopplung über Spacer sollte demnach in Abhängigkeit vom zu immobilisierenden Protein und den auszusiedelnden Zellen geprüft werden. Die vorgestellte Kopplungsmethode umgeht die Modifikation des Proteins sowie Behandlungen zur Vernetzung des Zytokins. Die Immobilisierungsreaktion ist bei Raumtemperatur und Umgebungsdruck sowie unter sterilen Bedingungen durchführbar. Immobilisierte Zytokine werden homogen kovalent an der Oberfläche gebunden und sind dort für die Zellen zugänglich. Außerdem ermöglicht die Einstellung definierter Belegungsdichten die gezielte Applikation von Zytokindosen. MA-Copolymere sind somit nicht nur für die Kultivierung von Stammzellen unter Erhaltung des Stammzellstatus einsetzbar, sondern eignen sich auch für Differenzierungsstudien.
Teilergebnisse dieser Arbeit wurden publiziert unter
K. Alberti, R.E. Davey, K. Onishi, S. George, K. Salchert, F.P. Seib, M. Bornhäuser, T. Pompe, A. Nagy, C.Werner, and P.W. Zandstra. Functional immobilization of signaling proteins enables control of stem cell fate. Nat Methods, 5(7):645–650, Jul 2008 und
T. Pompe, K. Salchert, K. Alberti, P.W. Zandstra, and C. Werner. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protocols, 5(6):1042–1050, Jun 2010. / In vitro cultivation of (embryonic) stem cells requires a defined environment. Together different properties as cytokine supplement, extracellular matrix composition or topographic design can mimic this stem cell niche in an artificial system. For mouse embryonic stem cells the cytokine leukemia inhibitory factor (LIF) is able to keep those cells in undifferentiated state and to enhance self renewal without the supplement of other factors. In vivo LIF exists in both diffusible and extracellular matrix immobilized form. This work investigates whether LIF can be immobilized covalently to alternating maleic anhydride (MA)-copolymers in a functional manner. When bioavailable, covalently immobilized LIF should be able to interact with specific cytokine receptor subunits and provide information to keep murine embryonic stem cells in a pluripotent state.
In aqueous solution with neutral pH (such as phosphate buffered saline, PBS) and ambient temperature and pressure MA-copolymers react spontaneously with aminogroups and therefore represent a useful support for covalent protein immobilization. Depending on the choice of co-monomer, properties of copolymer vary: ethylene results in hydrophilic poly-(ethylene-alt-maleic anhydride) (PEMA), octadecene in more hydrophobic poly-(octadecene-alt-maleic anhydride) (POMA). LIF can be covalently immobilized onto the MA-copolymers as shown by radiolabeling experiments. The amount of cytokine coupled to PEMA increased linear whereas on POMA saturation could be observed for higher concentrations. A subsequent coupling of a polyethylene glycol spacer (PEG7) further modified the properties and led to more hydrophilic surfaces. The amount of LIF per area decreased in comparison to MA-copolymers without the spacer but the graph characteristics remained unaltered (linear for PEMA+PEG7, saturation for POMA+PEG7). During the first three days in buffer solution supplemented with bovine serum albumin, unbound LIF was displaced and the amount of immobilized cytokine remained stable. This Stability after preincubation allowed to immobilize required amounts of LIF per area. Although hydrophilic surfaces with PEMA showed swelling behavior resulting in increased layer thickness after incubation in PBS, accessibility to LIF for an antibody was not impaired. The amounts per area detected by radiolabeling method and using the antibody were similar and indicated that LIF was not covered by copolymers. For cell culture addition of diffusible as well as immobilized growth factors or cytokines requires dosage control. Frequently it is necessary to provide homogeneous distribution of the factor of interest. In the present study analysis by fluorescence microscopy confirmed homogeneity for surfaces with covalently immobilized LIF (iLIF) but not for LIF physisorbed to extracellular matrix components collagen type I and fibronectin.
LIF transduces signals via the JAK/STAT pathway. Preliminary experiments with LIF-sensitive fibroblasts showed similar activation of STAT3 after stimulation with immobilized or diffusible LIF. The results of STAT3 activation revealed an activation profile with high intensities within the first 15 minutes for both immobilized and diffusible LIF followed by decrease. STAT3 activation profiles were similar on different surfaces and independent of LIF presentation mode. These results revealed that fibroblasts could recognize covalently immobilized LIF onto MA-copolymers and were able to activate STAT3. In the absence of LIF mESC start to differentiate within 24 to 36 hours and loose their pluripotency. To confirm the functional immobilization of LIF mouse embryonic stem cells (mESC) were cultivated on iLIF-modified POMA or POMA+PEG7 surfaces for 72 hours and stained for activated STAT3. Results showed a dose-dependent activation increasing with the iLIF amount per area. Higher amounts (8 and 75 ng/cm^2) of iLIF activated STAT3 similar to 10 ng/ml diffusible LIF. Introduction of PEG7 spacer did not further increased STAT3 activation. Both, the amount of ESC marker Oct4 and the percentage of Oct4-positive cells increased with higher amounts of iLIF and showed similar results as obtained with 10 ng/ml diffusible LIF. Murine ESC cultivated on LIF physisorbed to matrix components expressed similar amounts of transcription factor Oct4 compared to unstimulated cells. STAT3 activation and Oct4 expression in the absence of diffusible cytokine indicated a functional covalent immobilization of LIF. To confirm the pluripotency, mESC were stimulated for 6 to 8 subcultures only with iLIF, cell aggregates were fused with mouse embryos and implanted in pseudopregnant surrogate mothers. Three weeks after birth the contribution of mESC aggregates to chimera was evaluated. ESC stimulated with iLIF only contributed to chimera formation with around the same frequency as mESC cultivated with 10 ng/ml diffusible LIF. Thus, iLIF maintained pluripotency of mESC during in vitro expansion and could replace diffusible LIF.
As shown by the experiments, MA-copolymers provide a support to covalently immobilize cell signaling molecules in a functional manner. This method of coupling does not need any protein modification or cross-linking treatment after protein incubation. Reaction can be carried out under sterile conditions at ambient temperature and pressure. The immobilized ligand is distributed equally on the supporting copolymer and the adjustment of required ligand amounts is possible. These properties characterize MA-copolymers as a suitable support to immobilize cell signaling molecules not only for keeping the stem cell fate but also for differentiation studies.
Parts of this work were published:
K. Alberti, R.E. Davey, K. Onishi, S. George, K. Salchert, F.P. Seib, M. Bornhäuser, T. Pompe, A. Nagy, C.Werner, and P.W. Zandstra. Functional immobilization of signaling proteins enables control of stem cell fate. Nat Methods, 5(7):645–650, Jul 2008.
T. Pompe, K. Salchert, K. Alberti, P.W. Zandstra, and C. Werner. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protocols, 5(6):1042–1050, Jun 2010.
|
Page generated in 0.1007 seconds