Ce travail de thèse a pour objectif le développement et l'optimisation d'une nouvelle configuration de bioréacteur à membranes (BRM) pour l'hydroxylation efficace et sûre du méthane par la bactérie Methylosinus trichosporium OB3b. Ce BRM couple un bioréacteur à deux contacteurs membranaires gaz/liquide macroporeux qui alimentent en continu chaque substrat gazeux (méthane et air) sans générer de bulle dans la suspension bactérienne, évitant ainsi la formation d'un mélange gazeux méthane/air explosif. Dans un premier temps, la faisabilité et la reproductibilité de ce nouveau bioprocédé de conversion du méthane en méthanol ont été démontrées. D'une part, la productivité moyenne obtenue dans ce BRM (75 ± 25 mg méthanol.(g cellules sèches)-1.h-1) est près de deux fois meilleure que celle obtenue dans un réacteur fermé conduit dans les mêmes conditions que le BRM, traduisant un transfert de masse gaz-liquide accru dans le BRM. D'autre part, la productivité obtenue dans ce nouveau BRM est similaire aux meilleures productivités reportées dans la littérature pour des réacteurs alimentés avec un distributeur de gaz à bulles et près de 35 fois meilleure que celle reportée pour le seul autre BRM (à membranes denses) présent dans la littérature. Dans un second temps, le suivi cinétique de l'activité intrinsèque hydroxylante du biocatalyseur a permis de vérifier que l'arrêt de production du méthanol qui est observé après 14 h de réaction correspond à une perte quasi-totale de l'activité du biocatalyseur. Plusieurs essais ont été réalisés pour appréhender les facteurs pouvant avoir une influence sur l'activité hydroxylante de la bactérie, en vue de trouver le moyen d'augmenter le temps de production. Ces essais ont mis en évidence que l'arrêt de production est dû à la fin de vie du biocatalyseur. En parallèle à ces études, dans l'objectif de régénérer le cofacteur NAD nécessaire à la réaction d'hydroxylation de manière économique et in situ, des essais ont été conduits avec un système bio-électrochimique innovant (biocathode) visant à remplacer les électrons d'un donneur d'électrons (formiate) par ceux d'un métal faiblement polarisé. Ces essais ont montré l'incapacité de ces bactéries à utiliser les électrons d'une électrode dans les conditions de la réaction. / This work aimed to develop and optimize a new configuration of membrane bioreactor (MBR) for an efficient and safe methane hydroxylation by the Methylosinus trichosporium OB3b bacterium. This BRM couples a bioreactor with two gas/liquid macroporous membrane contactors supplying continuously each gaseous substrate (methane and air) without generating any bubble in the bacterial suspension, avoiding thus the formation of an explosive methane/air gas mixture. In the first step, the feasibility and the reproducibility of this new bioprocess for the conversion of methane into methanol was demonstrated. In the one hand, the average productivity achieved in the MBR (75 ± 25 mg methanol.(g dry cell)-1.h-1) is twice higher than that obtained in a batch reactor operated with the same conditions, highlighting an increased mass transfer in the MBR. In the other hand, productivity obtained in this MBR is similar to the best productivities reported in the literature for reactors (either fed-batch or continuous) using gas bubble spargers and about 35-times better than the one reported for the only other MBR (with dense membranes) present in the literature. Secondly, a kinetic monitoring of the intrinsic hydroxylating activity of the biocatalyst confirmed that the methanol production stop observed after 14 hours of reaction matched a quasi-total loss of the biocatalyst activity. Several trials were conducted to understand the factors which may influence the bacterial hydroxylating activity, in order to find a way to increase the production time. These trials put in evidence that the production stop is caused by the end of life of the biocatalyst. In parallel to these studies, aiming to regenerate the NAD cofactor required for the reaction by a cheap and in situ way, several tests were conducted with an innovative bio-electrochemical device (biocathode) to replace the electrons from an electron donor (formate) by those from a weakly polarized metal. These trials showed the inability of this bacterium strain to use electrons from an electrode in the conditions of the reaction.