Submitted by ADRIANO BRESSANE null (adrianobressane@ymail.com) on 2017-04-06T11:45:45Z No. of bitstreams: 1 3.pdf: 38954890 bytes, checksum: acc45aa06079de5294c6da5f275e4318 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-12T18:48:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bressane_a_dr_soro.pdf: 38954890 bytes, checksum: acc45aa06079de5294c6da5f275e4318 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T18:48:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bressane_a_dr_soro.pdf: 38954890 bytes, checksum: acc45aa06079de5294c6da5f275e4318 (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Embora fundamental para diversas finalidades, a identificação de espécies arbóreas pode ser complexa e até mesmo inviável em determinadas condições, motivando o desenvolvimento de métodos assistidos por inteligência computacional. Nesse sentido, estudos têm se concentrado na avaliação de características extraídas a partir de imagens da folha e, apesar dos avanços, não são aplicáveis a espécies caducifólias em determinadas épocas do ano. Logo, o uso de características baseadas na textura em imagens do tronco poderia ser uma alternativa, mas ainda há poucos resultados reportados na literatura. Portanto, a partir da revisão de trabalhos anteriores, foram realizados experimentos para avaliar o uso de métodos de inteligência computacional no reconhecimento de padrões de textura em imagens do tronco arbóreo. Para tanto, foram consideradas espécies arbóreas caducifólias nativas da flora brasileira. As primeiras análises experimentais focaram na avaliação de padrões. Como resultado, verificou-se que a melhor capacidade de generalização é alcançada combinando o uso de estatísticas de primeira e segunda ordem. Contudo, o aumento de variáveis preditoras demandou uma abordagem capaz de lidar com informação redundante. Entre as técnicas avaliadas para essa finalidade, a análise fatorial exploratória proporcionou redução na taxa de erros durante o aprendizado de máquina e aumento da acurácia durante a validação com dados de teste. Por fim, constatando que a variabilidade natural da textura no tronco arbóreo causa uma ambiguidade no reconhecimento de padrões, o uso da modelagem fuzzy foi avaliado. Em comparação com outros algoritmos de aprendizagem de máquina, a abordagem fuzzy proporcionou resultados competitivos e, assim, pode ser considerada uma alternativa promissora para novos avanços no apoio a identificação de espécies arbóreas usando inteligência computacional. / Although the arboreal identification is mandatory for several purposes, it can be complex and infeasible under certain conditions, motivating the development of computer-aided methods. In this sense, studies have focused on the assessment of features extracted from leaf images and, despite advancements, they are not applicable for deciduous species in some periods of year. Therefore, the usage of features based on texture in trunk images could be an alternative, but there are still few outcomes reported in the literature. Thus, from the review on previous studies, experiments have been performed for evaluating the use of computational intelligence methods for texture patterns recognition in trunk images. For that, native species from the deciduous Brazilian forest were considered. Firstly, the experimental analyzes focused on the evaluation of patterns. As a result, it was noted that the best generalization ability is reached using the first-order statistics in combination with second-order descriptors. Nevertheless, the increase of predictor variables required an approach capable of dealing with redundant information. Among the techniques assessed for this purpose, the exploratory factor analysis provided an error rate reduction during the machine learning, and an accuracy improvement in the validation over testing dataset. Finally, taking into account that the natural variability of texture in arboreal trunk causes an ambiguity in the pattern recognition, the usage of fuzzy modeling has been evaluated. In comparison with other machine learning algorithms, the fuzzy approach afforded competitive results, and hence it can be a promising alternative for further progress in the arboreal identification supported by computational intelligence.

Orientador: José Geraldo Nery / Banca: Eleni Gomes / Banca: Adriano Aguiar Mendes / Resumo: A busca por fontes alternativas de energia e/ou a valorização das existentes (principalmente de caráter "limpo") é tema amplamente discutido nos setores científicos e industriais, com ênfase aos processos catalíticos envolvidos na conversão de biomassa a biocombustíveis e/ou outros produtos de interesse de diversos setores industriais, e foi a base motivacional deste trabalho. O principal objetivo do presente trabalho foi a obtenção de biocatalisadores heterogêneos a partir da imobilização de lipases em nanozeólita faujasita (FAU) após troca iônica com o metal de transição Ni2+, e o uso dos complexos nanozeólita-enzima em reações de transesterificação do óleo de Microalgas em ésteres etílicos (FAEEs). Inicialmente, foi sintetizada a nanozeólita FAU (NaX-Na+ ), seguida da sua troca iônica com soluções de sulfato de níquel (0,5M) encubadas a 80°C por 3 dias (3D), formando o material denominado NaX-Ni2+(0,5M-3D). Os materiais obtidos tiveram suas estruturas cristalográficas confirmadas por Difração de Raios X (DRX). Após os experimentos de troca-iônica, os materiais foram utilizados para imobilização das lipases fungicas de T. lanuginosus (TLL), R. miehei (RML), C. rugosa (CRL) e de C. antarctica B (CALB), e foram denominados NaXNi2+(0,5M-3D)-TLL,Ni2+(0,5M-3D)-RML, Ni2+(0,5M-3D)-CRL e Ni2+(0,5M-3D)-CALB respectivamente. As atividades lipolíticas desses complexos foram determinadas a partir da hidrólise de azeite de oliva emulsificado, sendo encontrados os valores de 850, 550, 425 e 50 U/g respectivamente. Objetivando-se a otimização da produção de ésteres etílicos, os complexos foram aplicados em reações de transesterificação do óleo de microalgas em várias condições experimentais. O uso de 5% m/m (massa de catalisador/massa óleo) do complexo com TLL apresentou conversão de 85% de ésteres etílicos (12h/35°C) após adição... / Abstract: The attempt to find new sources of energy and/or the valorization of the existent (mainly those of "clean" sources) is an issue widely discussed at the scientific and industrial sectors, with emphasis to the catalytic processes involved in biomass conversion to biofuels and/or others products of industrial interest, motivated this work. The main goal of this work was the synthesis of heterogeneous biocatalysts by immobilization of several lipases onto nano sized faujasite zeolite (FAU) after transition metal Ni2+ ion exchange. These biocatalysts were used in the microalgae oil transesterification to fatty acid ethyl esters (FAEEs). At first, the nano sized zeolite FAU was synthetized (NaX-Na+ ), then the product was ion exchanged with nickel sulfate solution (0,5M) incubated under 80°C for 3 days (3D), yielding the denominated NaXNi2+(0,5M-3D) support. The obtained materials had their crystallographic structures confirmed by X-Ray Diffraction. After the ion exchange experiments, the materials were used to the fungal lipases from T. lanuginosus (TLL), R. miehei (RML), C. rugosa (CRL) and C. antarctica B (CALB) immobilization, and the complexes denominated NaX-Ni2+(0,5M-3D)- TLL,Ni2+(0,5M-3D)-RML, Ni2+(0,5M-3D)-CRL and Ni2+(0,5M-3D)-CALB respectively. The complexes' activities were measured by the emulsified olive oil hydrolysis, its activities values being 850, 550, 425 e 50 U/g respectively. Aiming the FAEEs yielding optimization, the complexes were applied in the microalgae oil transesterification under several experimental conditions. Using 5% w/w (weight of catalyst/weight of oil) of the TLL's complex 85% of FAEEs yield was achieved(12h/35°C) after one step ethanol addition in 1:4 molar ratio (oil:alcohol), while the RML's complex yielded 52% (12h/45°C) after step-wise alcohol addition (every each 2 hours, total of 4 steps), and the assays conditions for these ... / Mestre

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Coorientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Alessandro de Mello Varani / Banca: Tiago Santana Balbuena / Banca: Rosa dos Prazeres Melo Furriel / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Resumo: Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção dos ecossistemas, uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares que ajudam na mineralização da matéria orgânica, liberação de carbono e nutrientes na forma de serem assimilados. Devido a esses importantes fatores cada vez mais aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais a fim de diminuir o impacto ambiental e obter maior eficiência e menor custo durante os processos de catalise. Mas esse potencial biocatalítico ainda é pouco explorado. As hidrolases pertencem ao grupo de maior interesse para o mercado de enzimas sendo amplamente utilizadas em processos industriais tais como, a aplicação de aditivos em alimentos para animais, têxteis, para a produção de biodiesel e biossíntese de novos antibióticos. Nesse sentido, o objetivo do trabalho foi o de encontrar novas enzimas hidrolíticas. Para isso, foi utilizada biblioteca metagenômica de solo sob Eucalyptus spp. (EAA) realizando uma busca para identificar clone positivo e a construção da biblioteca "shotgun". Os dados gerados pelo sequêciamento foram utilizados para a montagem do mapa com sequencis conservadas que permitiu identificação de genes codificadores de pirofosfatase inorgânica (PPase) e tioesterase (TEs). A pirofosfatase inorgânica tem um papel importante no metabolismo do fósforo, além de controlar a concentração celular de pirofosfato (PPi) e processo de biossíntese. Tioesterases (TEs) são responsáveis pela hidrólise de um grupo tioéster carboxílico e um átomo de enxofre em ácidos graxos. A metagenômica revelou-se como uma ferramenta inovadora para explorar novos biocatalisadores na microbiota presente no solo. A análise dos dados in silico permitiu a predição da estrutura tridimensional e possível função das proteínas, assim os resultados sugerem que MetaPPase... / Abstract: The soil diversity of microorganisms with potential to select new genes, enzymes and compounds able to supply the high demand of biotechnology industry. In this sense, an immense diversity of microorganisms, yet most remains unexplored. Thus, soil diversity it is stimulated the search for new biocatalyst to high efficiency and stability, has been a constant pursuit of enzymologists, biochemists and chemical engineers. One of that biocatalyst is the hydrolases group, which are great interest to market for enzymes that cleavage of chemical structure by the addition of water. The hydrolases are widely used in industrial processes such as the application of additives in animal feed, textile, biodiesel production and biosynthesis of new antibiotics. Thus, the aim of this work was to find new hydrolases genes. In this paper, we used metagenomic library of soil under Eucalyptus spp. arboretum (EAA), was performed screening to identify a positive clone and construct the shotgun library. The data was analyzed using bioinformatics tools, to assemble the functional map and identify a hydrolase gene as possible novel inorganic (PPase) a thioesterase (TEs). The inorganic pyrophosphatase that has an important role in phosphorus metabolism controlling the cellular concentration of pyrophosphate (PPi) and biosynthetic process. Thioesterase (TEs) responsible for the hydrolysis of a carboxylic thioester group and a sulfur atom in fatty acids. The metagenomic revealed itself as an innovative tool for exploring novel biocatalysts in the microbiota present in the soil. The data analyses provide three-dimensional structure and protein function and the results suggest that MetaPPase is M- PPase and perchance an H+_PPase transporting subfamilies and TEs_ Meta possibly a new thioesterase / Doutor

O volume de dados gerados pelos vários projetos de sequenciamento genômico tem aumentado drasticamente nos últimos anos. Para processar, adequadamente, toda essa massa de dados são necessárias ferramentas eficientes a fim de se extrair informações genéticas úteis. Algumas das informações mais importantes neste processo são conhecidas como genes. A identificação computacional de genes de organismos eucariotos ainda é um problema em aberto, e é uma das principais tarefas em bioinformática atualmente. O presente trabalho investiga as principais técnicas utilizadas na tarefa de identificação de genes e propõe a aplicação de algumas delas, em uma arquitetura híbrida, baseada em software embarcado e hardware reconfigurável utilizando FPGA. O principal objetivo é desenvolver uma ferramenta que possa reduzir o tempo de execução do processo da identificação de genes em sequências de DNA explorando o paralelismo inerente dos modelos adotados e descrevendo-os em uma linguagem de descrição de hardware. Dentre as principais contribuições do presente trabalho estão a implementação de sensores de sinais em hardware reconfigurável e a proposta de um modelo para gerenciamento dos sensores. Os resultados obtidos comprovam a adequação do modelo proposto ao problema em questão e abre novas possibilidades ao uso da computação reconfigurável e dos sistemas embarcados na solução dos problemas de bioinformática. / The amount of data produced by the several genomic sequencing projects has increased dramatically in recent years. To process all this data, effective tools to extract useful genetic information are needed. One of the most important information in this process are known as genes. The computational identification of genes of eukaryotic organisms is still an open problem, and it is a major task in bioinformatics today. This study investigates the main techniques used in the task of identifying genes, and proposes the use of some of them, in a hybrid architecture, based on embedded software and reconfigurable hardware using FPGA. The main goal is to develop a tool that can reduce the runtime of the process of identifying genes in DNA sequences, exploring the parallelism inherent in the models adopted, and describing them in a hardware description language. Among the main contributions of this work are the implementation of sensor signals in reconfigurable hardware and the proposal of a model for managing the sensors. The results confirm the suitability of the proposed model to the problem and open new possibilities to the use of reconfigurable computing and embedded systems for solving bioinformatics problems.

O ser humano tem uma grande estima pelo processo de raciocínio que desenvolveu durante a sua evolução. Uma das áreas da computação foi desenvolvida com o objetivo inicial de simular a inteligência humana dentro de programas computacionais. Esta área ficou conhecida como inteligência artificial. Nas últimas décadas a inteligência artificial tem se baseado nas mais diversas formas de organização que tenham padrões. Um desses métodos é o algoritmo de otimização por colônias de formigas, apresentado no início da década de 90, e que apresentou bons resultados para vários problemas que tiveram modelos implementados. A biologia molecular visa analisar as estruturas moleculares contidas nos seres vivos, dentre elas as seqüências de DNA, RNA e os aminoácidos das proteínas. Devido o grande número de informações envolvidas nessa análise torna-se inviável em termos de tempo de processamento uma busca em todo o espaço de soluções possíveis, o que torna interessante o uso de algoritmos que percorram este espaço de busca de forma eficiente. Um dos problemas da biologia molecular é a reconstrução de árvores filogenéticas. Ele visa relacionar de forma hereditária as diversas espécies através das informações contidas em suas seqüências. Desta forma é possível saber quais espécies são mais próximas em termos evolutivos. Outro problema é o dobramento de proteínas. Uma proteína é um polímero que pode desempenhar as mais diversas funções em um ser vivo. A função que uma proteína desempenha esta diretamente relaciona a sua forma tridimensional. Uma proteína é codificada no DNA, e sintetizada no ribossomo de uma forma linear, a partir desta forma ela se dobra sobre a sua estrutura obtendo a sua forma final. Com a compreensão deste processo, seria possível a identificação de proteínas mal formadas e até mesmo o desenvolvimento de novas proteínas com funções específicas. O presente trabalho visa descrever dos modelos, baseados na otimização por colônia de formigas, desenvolvidos para os problemas. Além disso, foram desenvolvidos recursos especiais que permitem percorrer o espaço de busca de forma mais efetiva obtendo melhores soluções. Os resultados obtidos com as metodologias propostas apresentaram resultados similares ou até melhores que métodos já conhecidos que utilizaram o algoritmo de otimização por colônia de formigas para os mesmos problemas. / The human being has great esteem for the reasoning process developed during its evolution. One of the areas of the computation was developed with the initial objective to simulate human intelligence inside computational programs. This area is known as artificial intelligence. In the last decades artificial intelligence has been basing on the most diverse forms of organization that have standards. One of these methods is the ant colony optimization algorithm, presented in the beginning of nineties, and that achieved good results for some problems that had had implemented models. Molecular biology aims to analyze the molecular structures present in living creatures, amongst them the sequences of DNA, RNA and protein aminoacids. Due to great number of information being confronted in this analysis it is impracticable in terms of processing time a search in the whole space of possible solutions, what makes interesting the use of algorithms that cover the search space efficiently. One of the problems of molecular biology is phylogenetic trees reconstruction. It aims to relate hereditarily the several species through information present in its sequences. In that manner, it is possible to know which species are more closely related to one another and which are more distantly related.

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Alessandro de Mello Varani / Banca: Lucia Maria Carareto Alves / Banca: Luciano Takeshi Kishi / Resumo: O entomopatógeno Bacillus thuringiensis têm se destacado no controle biológico de insetos-praga como alternativa viável em substituição aos inseticidas químicos. A bactéria é caracterizada pela produção de cristais protéicos em concomitância com o processo de esporulação. Esses cristais são formados por polipeptídeos que apresentam propriedade entomopatogênica frente a diversas ordens de insetos, porém são inócuos ao meio ambiente. Dessa forma, o conhecimento da diversidade de genes de B. thuringiensis presente no solo é de extrema importância para compreender sua distribuição ecológica e seus efeitos em habitats diferentes. Em paralelo, o uso de técnicas de análise envolvendo metagenômica são propostas para estudar comunidades microbianas presentes no meio ambiente, permitindo inclusive o acesso a microrganismos incultiváveis. A partir desta proposta o presente trabalho analisou a diversidade de genes codificadores das proteínas entomopatogênicas de B.thuringiensis em seqüências metagenômicas de DNA extraído de solo com cultivo de cana-de-açúcar e solo de floresta nativa em estações climáticas distintas. Foi possível identificar linhagens que possivelmente deram origem ao material genético via plataforma MG-RAST e os genes codificadores das proteínas entomopatogênicas foram identificados utilizando o software BLAST. Os resultados evidenciam uma provável influência das estações climáticas sobre a diversidade dos genes obtidos por este tipo de análise / Abstract: The entomopathogen Bacillus thuringiensis is the most used alternative to control pests as opposed to the use of chemical products. This bacterium is able to produce crystals protein with entomopathogenic properties coded by the cry genes during its sporulation phase. The knowledge of the diversity of cry genes found in B. thuringiensis that is considered a soil bacterium is of extreme importance to allow us to understand the ecological distribution and its potential effects on the environment. Aside from this, the use of metagenomics techniques are being proposed to study microbial communities, as a way to overcame uncultivable microorganism. Based on such proposition this work aimed to evaluate the presence of B. thuringiensis entomopathogenic protein coding genes from metagenomic DNA extracted from soil samples on which sugar-cane has been cultivated as well as native forest soil samples obtained during different seasons of the year. It was possible to identify some strains of B. thuringiensis using the platform MG-RAST and their respective cry genes using the software BLAST. The obtained results allowed us to consider the influence of the climate on the diversity of cry genes that could be recognized by this type of analysis / Mestre

Resumo: A predição de estruturas secundárias e terciárias pode contribuir para elucidar o problema de enovelamento de proteínas. Para isso, métodos de Redes Neurais Artificiais (RNAs) e Algoritmos Genéticos são utilizados a fim de predizê-las, a partir de determinadas seqüências primárias de aminoácidos. Neste sentido, esta pesquisa visa à utilização de três níveis de RNAs. O primeiro nível é composto por um vetor de entrada representando a seqüência primaria dos aminoácidos, com uma dimensão de 22.n, onde n é o tamanho da janela compreendida entre 7 a 23. O segundo nível possui a implementação dos resultados da primeira rede. Por fim o terceiro nível é composto por um júri de decisão. As RNAs são treinadas no Simulador MATLAB 5.0, um software composto de vários recursos para a sua implementação (Neural Network Toolbox). As RNAs implementadas são do tipo Multi Layer Perceptron (MLP), que utilizam o algoritmo backpropagation (RPROP) e a função de treinamento trainrp. Os dados obtidos são comparados com os preditores 'The Predict Protein Server Default' (www.emblheidelberg.de/predictprotein/submit_def.html), 'The PSA Protein Structure Prediction Server' (http//bmerc-www.bu.edu/psa/request.html) e 'The PSIPRED Protein Structure Prediction Server' (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/), a fim de se obter um modelo de predição. / Abstract: The prediction of (secondaray and tertiary) structures of proteins can contribute to elucidadate the protein-folding problem. In oder to predict these structures we used methods of Artificial Neural Network (ANN) and genetic algorithms starting from the primary sequences of amino acids. The present work is composed of 3 networks levels. The first level is composed of ANNs of an input vector representing a segment of primary amino acid sequence. Since the encoding scheme uses a local window into the sequence, the input vector is a 22.n dimensional vector where n is the number of positions in the window (between 7 and 23). The outputs of level 1 are the inputs of the second level ANNs. The third level is the jury decision. The ANNs were trained with the Simulator MATLAB 5.0, software with several tools for its implementation (Neural Network Toolbox). The implemented ANNs are Multi Layer Perceptron (MLP) kind, which use the backpropagation algorithms (RPROP) together with training function trainrp. The obtained date are compared with the predictors 'The Predict Protein Server Default' (www.emblheidelberg.de/predictprotein/submit_def.html), 'The PSA Protein Structure Prediction Server' (http//bmerc-www.bu.edu/psa/request.html) e 'The PSIPRED Protein Structure Prediction Server' (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) in order to heve an idea of the quality of the prediction. / Orientador: Jorge Chahine / Coorientador: José Roberto Ruggiero / Coorientador: Luís Paulo Barbour Scott / Banca: Roosevelt Alves da Silva / Banca: Elso Drigo Filho / Mestre

Orientador: Jorge Chahine / Banca: Ronaldo Júnio De Oliveira / Banca: José Fernando Ruggiero Bachega / Banca: Gabriel Gouvêa Slade / Banca: Fábio Rogério de Moraes / Resumo: Esfingomielinase D (SMase D) é uma enzima conhecida por catalisar a clivagem de esfingomielina em ceramida-1-fosfato e colina, atividade presente apenas em aranhas do gênero Loxosceles (aranhas marrom) e em bactérias patogênicas do tipo Corynebacterium. A SMase D, também encontrada na literatura como fosfolipase D, é o principal componente do veneno de aranhas do gênero Loxosceles, capaz de induzir sozinha as lesões dermonecróticas características do loxoscelismo. Apesar da importância clínica, poucos detalhes sobre o mecanismo de ação destas enzimas são conhecidos. Neste trabalho, o mecanismo catalítico das SMases D de aranhas do gênero Loxosceles é estudado através de métodos computacionais como docking, dinâmica molecular clássica, simulações a pH constante e métodos híbridos QM/MM. Primeiramente são avaliadas as interações da SMase D com o íon sulfato, mio-inositol-1-fosfato, o substrato esfingomielina e o inibidor suramina, assim como os prováveis estados de protonação das histidinas 12 e 47 na presença e ausência de ligantes. A seguir, a barreira de energia livre experimental para liberação da colina é estimada em 21 kcal/mol através da teoria do estado de transição e da constante catalítica (kcat) da SMase D de Loxosceles laeta. Este valor é comparado às energias de ativação calculadas em simulações QM/MM para as vias de catálise covalente (entre 18 e 24 kcal/mol) e não covalente (25 kcal/mol), os quais correlacionam bem com o valor de 21 Kcal/mol, estimado experimentalmente. Adicionalmente, é sugerido um papel crucial para o grupo hidroxila da esfingomielina no processo de catálise. Dependendo do modo de ligação da hidroxila, a catálise pode ser covalente ou não covalente, com produtos distintos nos dois tipos de catálise. Interessante notar que os dois processos possuem energias de ativação comparáveis, em torno de 25 Kcal/mol, o que poderia supor que os dois processos são... / Abstract: Sphingomyelinases D (SMase D) are enzymes that catalyze sphingomyelin in ceramida-1-fosfate and choline. This activity is only found in Loxosceles brown spiders and Corynebacterium pathogenic bacterias. SMase D, or phospholipase D, is the main component of spider venoms of the genus Loxosceles, being able to induce the characteristic dermonecrotic features of the whole venom. Despite of the clinical importance o these enzymes, their action mechanism is not completely described. In this work, the catalytic mechanism of SMases D against sphingomyelin is studied through computational methods like docking, classical molecular dynamics, constant pH simulations and hybrid methods QM/MM. First, molecular interactions of SMases D with sulfate ion, myo-inositol-1-phosphate, sphingomyelin (the substrate) and suramin inhibitor are evaluated, as well as the protonation states of the catalytic histidines, 12 and 47, in presence or absence of ligands in the active site. Then, the free energy barrier of 21 kcal/mol for choline release is estimated using the transition state theory and the catalytic constant of Loxosceles laeta activity (kcat). This value is compared to the activation energies obtained through QM/MM simulations for covalent (between 18 and 24 kcal/mol) and non-covalent (25 kcal/mol) pathways. Additionally, the hydroxyl group of sphingomyelin is proposed to play a crucial role in the catalytic mechanism. Depending on the binding way of the hydroxyl group, the catalysis may be covalent or non-covalent, with different reaction products in each case. Interestingly, the two processes showed similar activation energies, suggesting that they may be equally probable, as discussed in some experimental studies for different phospholipase D. Finally, the affinity of SMases for mimetic membranes is discussed / Doutor

Orientador: Alessandro de Mello Varani / Coorientador: Elisângela Soares Gomes / Banca: Marcos Túlio Oliveira / Banca: Mariana Carina Frigieri / Resumo: Os Elementos Genéticos Móveis (EGMs) são segmentos de DNA presentes em todos os domínios, e que apresentam a capacidade de mobilização em um genoma. São considerados agentes chaves na evolução e diversificação dos seres vivos. Sequências de Inserção (IS) são os EGMs mais abundantes dos procariotos. IS são elementos compactos, que codificam o gene responsável pela mobilização, a transposase. Estudos de genômica comparativa indicam que a transposase é o gene mais abundante presente em banco de dados públicos de genomas e metagenomas. O presente estudo avaliou a abundância e diversidade de transposases a partir de dados de sequenciamento de alto rendimento provenientes de duas bibliotecas metagenômicas, a primeira originada de solo com cultivo de cana-de-açúcar e a segunda de solo de floresta. Os metagenomas foram analisados através de duas frentes de investigação. Na primeira frente de investigação foram identificadas as transposases em um conjunto de 267.879.464 reads paired-end (2x100bp) através da ferramenta MG-RAST. Na segunda frente de investigação, os reads de cada metagenoma foram montados (de novo assembly) e posteriormente anotados através da plataforma MG-RAST e da ferramenta ISsaga 2.0. A plataforma MG-RAST identificou 902.982 (reads) com função atribuída para transposases, enquanto que a ferramenta ISsaga 2.0 recuperou 592 (scaffolds) contendo quadros aberto de leitura (ORFs) codificando para transposases. Um total de 120 (22%) scaffolds e 767.534 (85%) reads anotados foram classificados em grupos taxonômicos distintos, onde o filo Proteobacteria (48% - MG-RAST e 34,3% - ISsaga 2.0) foi predominante. Análises comparativas e biocuração indicam que 695.296 (77%) dos reads foram incorretamente atribuídos com função transposase pela ferramenta MG-RAST. Dentre as famílias de transposases classificadas pelo ISsaga 2.0 destacam-se as famílias: IS110 (76/13,9%), IS3 (74/13,6%), e em particular... / Abstract: Mobile Genetic Elements (MGE) are segments of DNA present in the biological domains that have the ability to move around within a genome. They are considered key player in the evolution and diversification of living things. Insertion Sequences (IS) are the most abundant MGEs of prokaryotes. IS are compact elements that encode the gene responsible for the mobilization, the transposase. Comparative genomic studies indicate that the transposase is the most abundant gene found in public database of genomes and metagenomes. This study evaluated the abundance and diversity of transposases from high-throughput sequencing data originated from two metagenomic libraries, one from soil with sugarcane cultivation and the other from forest soil. The metagenomes were analyzed through two research fronts. In the first one, transposases were identified in a set of 267. 879. 464 reads paired-end (2x100bp) by MG RAST tool. In the second front of research, the reads of each metagenome were fitted (de novo assembly) and subsequently recorded by ISsaga 2.0 tool and platform MG-RAST. The platform MG- RAST identified 902.982 (reads) with allocated transposase function, whereas the 2.0 ISsaga tool recovered 592 (scaffolds) containing open reading frames (ORFs) coding for transposase. A total of 120 (22%) scaffolds and 767.534 (85%) reads noted were classified in different taxonomic groups resulting the phylum Proteobacteria (48% - MG-RAST and 34.3% - Issaga 2.0). Comparative analysis and biocuration indicate that 695.296 (77%) of the reads were incorrectly assigned with transposase function by MG-RAST tool. Among the families of transposase classified by Issaga 2.0, feature the families: IS110 (76 / 13.9%), IS3 (74 / 13.6%), and particularly 65 scaffolds (11.9%) from ISNCY family (not classified yet). Another noticeable result is that no IS previously described in the literature has been identified in these metagenomic data. This study revealed: (a) MG-RAST ... / Mestre

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Julio Cesar Borges / Resumo: Neste trabalho foi realizado um estudo de caracterização das proteínas RUV - 1 e RUV - 2 de Neurospora crassa, as quais são proteínas ubiqua mente encontradas e descritas estar envolvidas em diferentes processos celulares. Resultados anteriores obtidos pelo nosso grupo identificaram, através de espectrometria de massas, a proteína RUV - 1 como uma proteína capaz de se ligar ao promotor do gene da glicogênio sintase ( gsn ) durante a resposta ao choque térmico. Mais tarde, foi demonstrado que a proteína foi capaz de se ligar in vitro, e de maneira especifica, a o motivo de DNA STRE, também presente no promotor gsn . Considerando que a proteína RUV - 1 in terage com a proteína parceira RUV - 2 e, juntas, participam de grandes complexos proteicos que atuam na regulação de diferentes processos celulares, e ste trabalho teve como objetivo realizar estudos de caracterização das proteínas RUV - 1 e RUV - 2. Os resultad os de expressão gênica mostraram que o gene ruv - 1 foi s uperexpresso na condição de choque térmico e que o gene ruv - 2 n ão mostrou alteração na expressão na mesma condi ção. Além disso, foi demonstrado que o transcrito do gene ruv - 2 é parcialmente processado n a situação de choque térmico, e não em outra condição indutora de estresse, através do processo conhecido como intron retention levando à síntese de uma proteína truncada . No entanto, os resultados mostraram que a proteína RUV - 2 foi detectada em extratos celulares do fungo obtidos até 4 h de choque térmico. Os cDNAs ( ruv - 1 e ruv - 2 ) foram inserido s no vetor pET28a e as proteínas expressas em E. coli . Entretanto, ainda não foi finalizada a expressão de ambas utilizando o plasmídeo bicistrônico pETDUET - 1, par a a análise de interação de ambas proteínas. Neste trabalho também foi construída uma linhagem do fungo modificada geneticamente, a qual produz a proteína RUV -... / Abstract: In this work, we performed characterization studies of Neurospora crassa RUV - 1 and RUV - 2, which are ubiquitous protein and have been described to be involved in different cellular processes. Previous results obtained by our group identified, by mass sp ectrometry, RUV - 1 as a protein able of binding to the glycogen synthase gene promoter ( gsn ) during heat shock response. Later, it was demonstrated that the protein was able to bind in vitro, and in a specific manner, to the STRE DNA motif, also present in gsn promoter. Since RUV - 1 interacts with RUV - 2 protein, and together participate in large protein complexes that act in the regulation of different cellular processes, this study aimed to conduct characterization studies of RUV - 1 and RUV - 2 proteins . G ene expression results showed that ruv - 1 gene, but not ruv - 2 gene was overexpressed under heat shock. Furthermore, it was shown that ruv - 2 transcript was incompletely processed under heat shock through a process known as intron retention that leads to the prod uction of a truncated protein. No other stress inducing condition s led to the same phenomenon . However, RUV - 2 protein was detected in cell extracts of the fungus exposed to heat shock up to 4 h . The c DNA c ( ruv - 1 and ruv - 2 ) w ere inserted into the pET28a vec tor and the proteins were expressed in E. coli . However, it has not yet been completed the molecular cloning in the bicistronic plasmid pETDUET - 1, which allows the production of both proteins in the same cell, what is required for protein - protein interacti on analysis. In t his work, was also constructed a genetically modified strain, which produces the V5 - tagged RUV - 1 protein (V5 - RUV - 1 ), which that will be later used in immunoprecipitation assay for the identification of partner proteins. Chromatin immunopre cipitation (ChIP) assay using this strain w as performed in order to investigate... / Mestre