The natural daily cycles of light and dark have played a fundamental role in shaping the development of an adaptive intrinsic clock mechanism which allows organisms to coordinate the function of multiple organs by setting the correct circadian timing of cellular processes ensuring proper homeostasis. In mammalian skin, homeostasis is maintained by epidermal stem cells (epSCs). EpSCs localize to specialized niches where they undergo cycles of quiescence and proliferation. Several pathways are known to play essential roles in epSC function; however, how are these pathways spatiotemporally coordinated, and why not all stem cells within the niche behave in the same manner, is still poorly understood. We have analyzed the role of the molecular circadian clock in fine-­‐tuning the behavior of epidermal stem cells. Using a fluorescent circadian reporter mouse model, we demonstrate that the dormant epidermal stem cell compartment contains two co-­‐existing populations of stem cells in different clock states. Global comparative transcriptome analysis indicated that each clock population corresponds to a distinct predisposition state of response towards stem cell activating and dormancy cues. We provide evidence that the core circadian transcription factors BMAL1 and CLOCK bind to regulatory elements in the promoters of several of these stem cell homeostatic genes, thus being directly responsible for creating these two stem cell clock states. Unbalancing this clock driven equilibrium of epSCs in vivo resulted in progressive changes in the response of stem cells to activating or dormancy cues, which led to a progressive premature tissue aging, and a significant reduction in the development of cutaneous squamous cell carcinomas. Thus, our results indicate that the molecular clock machinery fine-­‐tunes the spatiotemporal behavior of epidermal stem cells within their niche, and that perturbation of this mechanism affects tissue homeostasis and the predisposition to neoplastic transformation. / Los ciclos naturales de luz y oscuridad han sido determinantes en el desarrollo de un reloj molecular intrínseco que permite coordinar la función de múltiples órganos para mantener la homeostasis global del organismo. La homeostasis del compartimento queratinocítico de la piel depende de una población de células troncales adultas epidermales (epSCs). Las epSCs están localizadas en nichos específicos y especializados desde dónde responden a las necesidades de repoblación celular del tejido mediante la alternancia de fases de quiescencia y proliferación. Varias rutas de señalización regulan el comportamiento de las epSCs; sin embargo, aún no entendemos bien porqué no todas las epSCs se comportan de la misma manera dentro de un mismo nicho troncal, y cómo están coordinadas a nivel espacio-­‐temporal. Hemos analizado el impacto del ritmo circadiano sobre las función de las epSCs. Mediante un ratón reportero fluorescente del ritmo circadiano hemos demostrado que el nicho troncal quiescente contiene dos poblaciones de epSCs en diferentes fases de su reloj molecular. El análisis comparativo global del transcriptoma de ambas poblaciones indicó que las dos poblaciones corresponden a dos estados opuestos de predisposición a responder a estímulos de activación y quiescencia. Mostramos resultados que demuestran que los factores de transcripción circadianos Bmal1 y Clock regulan directamente la expresión de genes que regulan el comportamiento de las epSCs. La arritmia in vivo en las epSCs resultó en una pérdida progresiva de la homeostasis tisular, un envejecimiento prematuro y una reducción significativa en el desarrollo de tumores escamosos de piel. Por lo tanto, nuestros resultados indican que la maquinaria del reloj molecular permite a las epSCs a anticiparse y coordinar su respuesta a estímulos locales del nicho, lo que constituye un mecanismo esencial para su correcta función en el tejido

Over the last several decades, the emerging ‘integrated’ view of the cell has triumphed over the ‘one gene/one protein/one function’ paradigm. This is illustrated by the biologically opposite effects of key regulatory proteins in different cell types, in established versus primary cells, and in vitro versus in vivo situations. The persistent theme throughout this dissertation is the integration of a wide range of data sources for the purpose of understanding distinct cellular contexts. We first use circadian expression data from human epidermal stem cells to discover waves of transcripts expressed in tune with known clock genes and show that time-of-day dependent responses to proliferation/differentiation cues is important for skin homeostasis. We then combine this expression data with information on protein structures and complexes to describe how protein-complex assembly is temporally regulated during differentiation. Lastly, we show that human protein complexes are composed of a stable ‘core’ and a plastic ‘periphery’ whose tissue-specific expression allows protein complexes to function in a context-dependent manner. / En las últimas décadas, la emergente vista integrativa de la célula ha triunfado sobre el paradigma histórico: ‘un gene/una proteína/una función’. Esto es ilustrado por los efectos biológicos opuestos de proteínas regulatorias clave en cultivos celulares inmortalizados frente a primarios e in vitro frente a in vivo. El tema persistente en este disertación es la integración de un amplio set de datos para estudiar los distintos contextos celulares. En primer lugar, utilizamos los datos de expresión génica obtenidos de células madre epidérmicas para descubrir las ondas de transcripción expresadas en sintonía con los genes conocidos de los ritmos circadianos. En este estudio demostramos que las respuestas de las células madres a las señales de proliferación/diferenciación dependen de hora del día y el tiempo circadiano es importante para la homeostasis de la piel. Posteriormente, combinamos estos datos de expresión con la información estructural de proteínas y complejos proteicos para describir la regulación temporal de complejos durante el proceso de diferenciación. Por último, mostramos que los complejos de proteínas humanos están compuestos de un ‘núcleo’ estable y una 'periferia' plástica cuya expresión específica de tejido celular permite que los complejos de proteínas funcionen de una manera dependiente del contexto.

La mort de les cèl•lules ciliades, com a conseqüència de diversos factors com l’envelliment, el soroll elevat o l´ús d’ototòxics, causa sordesa. Els mamífers no tenen la capacitat de regenerar les cèl•lules ciliades. No obstant, els vertebrats inferiors han mantingut aquesta capacitat mitjançant la proliferació de les cèl•lules de suport i/o la seva transdiferenciació. S’ha descrit la via de l’àcid retinoic (AR) com a un factor important durant el procés de regeneració de diversos òrgans. Tanmateix, el paper de la via a l’orella interna és poc conegut. L’estudi del patró d’expressió gènica, anàlisis funcionals i seguiment del llinatge cel•lular, ens ha permès determinar la importància de l’AR durant el procés de regeneració de les cèl•lules ciliades en peix zebra. Després de la mort d’aquestes, el bloqueig de la via de l’AR tant a l’orella interna com a la línia lateral impedeix la seva regeneració i redueix la proliferació de les cèl•lules de suport. Altrament, s’indueix l’expressió dels components de la via de l’AR. Finalment, demostrem que l’AR és essencial per reduir l’expressió de p27kip i sox2 a les cèl•lules de suport permetent que aquestes proliferin de nou. Com a conclusió, he pogut descobrir una nova funció de l’AR durant la regeneració de les cèl•lules ciliades que podria ser rellevant en futures estratègies terapèutiques / Hair cell damage, caused by various insults, results in hearing loss in humans, one of the major health problems nowadays. In mammals damaged hair cells cannot regenerate, whereas lower vertebrates have retained the ability to replace them by inducing cell proliferation of supporting cells and/or their transdifferentiation. Retinoic Acid (RA) has been implicated in several organs regeneration but its role in hair cell regeneration is unknown. A combination of gene expression profiling, functional assays and cell-lineage tracing experiments allows us to highlight the importance of the RA pathway in hair cell regeneration in zebrafish. Regeneration is impaired upon blockade of the RA pathway in both the inner ear and lateral line systems together with a reduction of supporting cell proliferation. Moreover, the expression of RA pathway components is induced during hair cell regeneration, confirming the activation of the pathway. Finally, we demonstrate that RA is critical for downregulating p27kip and sox2 in supporting cells, allowing them to re-enter the cell cycle. This pivotal role of RA could be relevant in the development of future therapeutic strategies

L’Esclerosi Lateral Amiotròfica (ELA) és una malaltia neurodegenerativa de la motoneurona. Totes les neurones del sistema motor es veuen afectades pel flux degeneratiu en aquesta malaltia des de l’escorça motora primària fins a la junta neuromuscular. Al 1993, la descoberta de mutacions en el gen SOD1 va obrir nous horitzons experimentals amb la creació dels primers rosegadors transgènics per aquesta malaltia. Des d’aquell moment i fins a l’actualitat la mutació més estudiada en l’ELA ha estat la SOD1-G93A a tot el món. Els models transgènics per aquesta mutació de la SOD1 han revelat mecanismes essencials de la neurodegeneració en aquesta malaltia incloent l’excitotoxicitat, la disfunció proteica i la degeneració axosinàptica entre altres. En aquest treball hem explorat els canvis moleculars que tenen lloc als terminals-C, uns terminals molt especialitzats en les α-moto neurones, dels rosegadors transgènics SOD1-G93A. A més, també hem focalitzat la nostra atenció a la relació patològica que s’estableix en l’ELA familiar (ELAF) entre la mutació SOD1-G93A i les mitocòndries de les motoneurones. En relació als terminals C en moto neurones durant la ELAF, hem trobat canvis associats a l’aparició dels símptomes com ara expressió incrementada del factor neurotròfic Neuregulina-1 localitzat també per primer cop a la cisterna subsinàptica dels terminals C aposats a les α-moto neurones. La Neuregulina-1 en aquestes estructures de reticle endoplasmàtic va ser observada a dins de vesícules extracel·lulars (VEs), suggerint que l’anàlisi de la Neuregulina-1 en VEs durant ELA és especialment prometedor com a biomarcador potencial en aquesta malaltia. Així nosaltres hem desenvolupat també un nou mètode per tal d’aïllar VEs, donat que aquest és un pas essencial previ a l’estudi de les proteïnes associades amb aquestes estructures. El nostre mètode aplicat a la purificació de VEs en teixits complexos fou capaç de facilitar la identificació de la Neuregulina-1 en VEs provinents de teixits clínics i fluids biològics. En relació a les implicacions de la mitocòndria en la ELA, hem trobat que la mutació SOD1-G93A estabilitza la proteïna PINK1 a la mitocòndria seguidament activant el factor nuclear NFκB en neurones. La interacció seqüencial entre la SOD1 mutant i NFκB crea una clara disfunció en la capacitat proteolítica del proteosoma, el qual promou coagregació de la SOD1 mutant i el PINK1 en aquestes cèl·lules. Aquests resultats afegeixen un substancial coneixement mecanístic sobre els rols de la mitocòndria en els events neurodegeneratius clàssics de l’ELA, com ara en l’agregació de proteïnes disfuncionals en moto neurones. Seguint el nostre estudi de l’afectació mitocondrial en la ELA, hem creat i caracteritzat un nou model de Drosophila que expressa la mutació humana SOD1-G93A exclusivament en fibres musculars toràciques sota el promotor 24B. Aquest model de Drosophila transgènica recapitula amb èxit el fenotip mitocondrial prèviament observat de l’ELA presentant importants avantatges sobretot en l’elecció de nous compostos terapèutics. En definitiva, els resultats generats en aquesta tesi proporcionen evidència experimental, extensa comprensió molecular i insinuen nous horitzons terapèutics sobre els mecanismes moleculars i els events neurodegeneratius associats a la disfunció sinàptica i mitocondrial en l’ELAF. / La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa de la motoneurona. Todas las motoneuronas se ven afectadas desde la corteza motora primaria hasta la unión neuromuscular. En 1993 la descubierta de mutaciones en el gen SOD1 abrió nuevos límites experimentales con la creación de los primeros roedores transgénicos para esta enfermedad. Desde ese momento y hasta la actualidad, la mutación más estudiada en la ELA ha sido la mutación SOD1-G93A. Los modelos transgénicos de esta mutación han revelado mecanismos esenciales de la neurodegeneración en la ELA, incluyendo la excitotoxicidad, la disfunción proteica y la degeneración axosináptica entre otras. En este trabajo hemos explorado los cambios moleculares que tienen lugar en los terminales C, unos terminales altamente especializados de las α-motoneuronas, en un modelo murino de ELA con la mutación SOD1-G93A. Además, también hemos focalizado nuestra atención sobre la relación patológica que se establece en la ELA familiar (ELAF) entre la mutación SOD1-G93A y las mitocondrias. En relación a los terminales C durante la ELAF, hemos encontrado cambios asociados con la aparición de síntomas, como por ejemplo el incremento de la expresión del factor neurotrófico Neuregulina-1, localizado por primera vez en la cisterna subsináptica de los terminales C. La Neuregulina-1 en esas estructuras de retículo endoplasmático fue observada dentro de vesículas extracelulares (VEs), sugiriendo que el análisis de la Neuregulina-1 dentro de VEs en la ELA resulta especialmente prometedor como biomarcador potencial para esta enfermedad. Así, nosotros hemos desarrollado también un nuevo método para purificar VEs, dado que este es un paso esencial previo al estudio de las proteínas asociadas con estas estructuras. Nuestro método aplicado a la purificación de VEs de tejidos complejos fue capaz de facilitar la identificación de la Neuregulina en VEs provenientes de tejidos clínicos y fluidos biológicos. En relación a las implicaciones de la mitocondria en la ELA, hemos encontrado que la mutación SOD1-G93A estabiliza la proteína PINK1 en las mitocondrias activando el factor nuclear NFκB en neuronas. La interacción secuencial entre la SOD1 mutante y el NFκB crea una clara disfunción sobre la capacidad proteolítica del proteosoma, la cual a su vez promueve co-agregación de la SOD1 mutante y PINK1 en estas células. Estos resultados suman un sustancial conocimiento mecanístico sobre los roles de la mitocondria en eventos degenerativos clásicos de la ELA, como es la agregación de proteínas disfuncionales en motoneuronas. Siguiendo nuestro estudio de la afectación mitocondrial en la ELA, hemos creado y caracterizado un nuevo modelo de Drosophila que expresa la mutación humana SOD1-G93A en fibras musculares torácicas bajo el promotor 24B. Este modelo de Drosophila transgénica recapitula con éxito en fenotipo mitocondrial característico de la ELA presentando importantes ventajas para la elección de nuevos compuestos terapéuticos. En definitiva, los resultados generados en esta tesis proporcionan evidencia experimental, extensa comprensión molecular y insinúan nuevos horizontes terapéuticos acerca de los mecanismos moleculares y eventos neurodegenerativos asociados con la disfunción sináptica y la disfunción mitocondrial en la ELAF. / Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is an orphan age-associated neurodegenerative disease. All motoneurones in ALS are affected by degenerative flow from the primary motor cortex to the neuromuscular junction. In 1993, mutations of the gene SOD1 opened new research avenues allowing for the generation of familial ALS experimental models in rodents. Since then, the FALS mutation SOD1-G93A has been extensively studied worldwide in ALS to date. Transgenic models for this SOD1 mutation have revealed essential mechanisms of neurodegeneration including excitotoxicity, proteinopathy and axosynaptic degeneration among others. In this dissertation, we explored the molecular changes that occur in C-terminals, a very specialised synapse type from α-motoneurones of SOD1-G93A rodents. Also, we focused on the pathological relationship between the FALS mutant SOD1-G93A and mitochondria in motoneurones. With regard to C-terminals in FALS motoneurones, we found changes that were symptomatically associated with the up-regulated expression of the neurotrophic factor Neuregulin-1 located for the first time in the subsurface system of C-boutons juxtaposed to α-motoneurones. Furthermore, Neuregulin-1 in these endoplasmic reticulum structures was observed inside extracellular vesicles, suggesting that analysis of Neuregulin-1 from extracellular vesicles in ALS holds promise as a potential reliable biomarker for that neurodegenerative disease. We therefore have developed a new method for isolation of extracellular vesicles, as this remains as an essential step for the study of molecules associated with these structures. Our method applied to purify extracellular vesicles from complex biological tissues was able to facilitate the identification of Neuregulin-1 in extracellular vessicles from clinical tissues and biological fluids. Regarding implications of mitochondria in ALS, we have found that the FALS mutant hSOD1-G93A stabilises PINK1 in mitochondria and subsequently activates NFκB in neuronal cells. Sequential interaction between hSOD1 and NFκB impairs the proteosome proteolitic function promoting co-aggregation of SOD1 and PINK1 in these cells. These results add substantial mechanistic insight on the roles of mitochondria in classical ALS-associated neurodegenerative events, including aggregation of dysfuntional proteins in motoneurones. Following our study of mitochondria affectation in ALS, we have created and characterised a novel Drosophila model that expresses human SOD1-G93A in thoracic muscles under the genetic muscular promoter 24B. Flies expressing human SOD1-G93A in thoracic muscles successfully recapitulate FALS mitochondrial phenotype with several advantages in front of the current available rodent models for this FALS mutation. Taken together, the results generated in this thesis provide experimental evidence, further molecular comprehension and promise novel therapeutic approaches to the molecular mechanisms and neurodegenerative events associated with synaptic frailty and mitochondrial disfunction in FALS.

Spinal muscular atrophy (SMA) is a genetic disorder caused by loss of the Survival motor neuron 1 gene (SMN1), lead to reduced SMN protein level and selective dysfunction of MNs. SMN reduction causes neurite degeneration and cell death without classical apoptotic features, but the direct events leading to MN degeneration in SMA are still unknown. Autophagy is being a primary target for the treatment of many neurodegenerative diseases. The objective of the present study is to analyze the role of autophagy in SMA pathology, the mechanisms that regulate SMN protein degradation and the origin of neurodegeneration in spinal cord MNs. To this end, we have reduced the Smn protein by using the lentivirus knockdown method. In Smn-reduced MNs from lentivirus Smn knockdown and SMA type I transgenic mice models, we have observed the increase of autophagy markers and autophagosome accumulation. Treatment with autophagy activators or inhibitors or proteasome inhibitors or calpain knockdown induce changes of Smn protein level in MNs suggesting the role of autophagy and proteasome in the regulation of Smn protein in these cells. Therefore the results contribute to new insight about Smn protein regulation in MNs and the possible role of autophagy in SMA neurodegeneration. / L'atròfia muscular espinal (SMA) és un trastorn genètic, causada per la pèrdua o la mutació del gen de la supervivencia de les neurones motores 1 (SMN1), cosa que condueix a una reducció dels nivells de la proteïna SMN i una disfunció selectiva de les MN. S’ha descrit que la reducció d’SMN causa la degeneració de les neurites i la mort cel•lular sense les característiques apoptòtiques clàssiques, però els esdeveniments directes que condueixen a la degeneració de les MN en l’SMA encara són desconeguts. L’autofàgia és una diana principal per al tractament de moltes malalties neurodegeneratives. L'objectiu d’aquest estudi és analitzar el paper de l'autofàgia en la patologia de l’SMA, els mecanismes que regulen la degradació de la proteïna SMN i l'origen de la neurodegeneració en les MN de la medul•la espinal. Amb aquesta finalitat, hem reduït la proteïna SMN utilitzant el mètode de silenciament amb lentivirus. Hem analitzat els canvis en els marcadors d’autofàgia en les MN en cultiu amb l’SMN reduïda amb lentivirus i en cultius de MN de models de ratolins transgènics de SMA de tipus I. Hem observat que la reducció de l’SMN provoca un augment dels marcadors d’autofàgia i l'acumulació d’autofagosomes. A més, el tractament amb activadors de l'autofàgia, inhibidors de l'autofàgia o inhibidors del proteasoma o calpaïna indueix canvis en els nivells de la proteïna SMN en les MN, la qual cosa suggereix un paper de l'autofàgia i el proteasoma en la regulació de la proteïna SMN en aquestes cèl•lules. Conjuntament, aquests resultats contribueixen a una nova visió sobre la regulació de la proteïna SMN en les MN i sobre el possible paper de l'autofàgia en la neurodegeneració en l’ SMA. / La atrofia muscular espinal (AME) es un trastorno genético causado por la pérdida de la supervivencia de las neuronas motoras del gen 1 (SMN1) que conduce a la reducción de nivel de proteína SMN y a la disfunción selectiva de los MNs. La reducción de SMN causa la degeneración de axones y la muerte celular sin características apoptóticas clásicas; sin embargo, los motivos directos que conducen a la degeneración del MN en AME aún se desconocen. La autofagia está siendo un objetivo principal para el tratamiento de muchas enfermedades neurodegenerativas. El objetivo del presente estudio es analizar el papel de la autofagia en la patología de la AME, los mecanismos que regulan la degradación de la proteína SMN y el origen de la neurodegeneración de los MNs en la médula espinal. Con este fin, hemos reducido la proteína SMN utilizando un método de reducción lentiviral. En la Smn reducida mediante el método de reducción lentiviral y modelos de ratones transgénicos AME de tipo I, hemos observado el aumento de los marcadores de autofagia y la acumulación de autofagosoma. El tratamiento con activadores o inhibidores de la autofagia o inhibidores del proteasoma o calpaína reducida induce cambios del nivel de la proteína SMN en los MNs que demuestran el papel de la autofagia y del proteasoma en la regulación de la proteína SMN en estas células. Por lo tanto, los resultados contribuyen a una nueva visión sobre la regulación de las proteínas Smn en el MN y el posible papel de la autofagia en la neurodegeneración de AME.

Most cells store energy in lipid droplets (LDs), specialized storage organelles composed of a neutral lipid core that, during their biogenesis, is packaged into a single phospholipid monolayer decorated with specific proteins. Regulation of LDs size and number requires the function of the conserved ER protein Seipin/Fld1, however the molecular function of this protein remains poorly understood. Yeast seipin Fld1 is in complex with Ldb16, an uncharacterized ER protein. Like fld1Δ cells, LDB16 deletion mutant displays a similar aberrant LDs morphology phenotype: lower number of supersized LDs (SLD) or tiny and clustered LD aggregates, depending on the absence or presence of the phospholipid precursor inositol in the media, respectively. The growth stage of cells also impacts on the relative distribution of these phenotypes: while LD aggregates predominate in dividing cells, SLDs are found primarily in stationary phase cells. We found that the complex formed by Ldb16 and Fld1 is required for normal LDs phenotype. In particular, this dual LD morphology is not observed for any other mutants studied so far suggesting that Fld1/Ldb16 have a unique role in LD biogenesis. Combining mass spectrometry analysis on purified LDs with light microscopy, we found that the distribution of many ER and LDs proteins is altered in these mutants. Analysis of a subset of proteins enriched at LDs surface in mutant cells indicated that the physical properties of clustered LDs may differ from those of supersized LDs. Moreover our data obtained by following the process of LDs biogenesis in presence or absence of inositol points toward a role for Fld1/Ldb16 complex in organizing membrane domains at LDs assembly site. In the absence of the complex, the segregation between the two compartments could be lost and the assembly of LDs is impaired resulting in defects in phospholipid packing that is exacerbated in inositol presence. We propose a function in facilitating the establishment of LD identity by acting as a diffusion barrier at the ER-LD contact sites / La mayoría de las células almacenan la energía en partículas lipídicas, también conocidas como “lipid droplets” (LD), unos orgánulos especializados compuestos por un núcleo de lípidos neutros que, durante su biogénesis, se empaqueta de forma coordinada en una monocapa de fosfolípidos decorada con proteínas específicas. La regulación del tamaño y número de LDs requiere la función de la proteína conservada de retículo endoplasmático (RE) Seipina/Fld1. Sin embargo, la función molecular exacta de esta proteína no está clara. La seipina/Fld1 de levadura está en complejo con Ldb16, una proteína de RE no caracterizada. Como las células fld1Δ, la deleción del gen correspondiente a esta proteína muestra la misma doble morfología aberrante de LDs: un LD individual y de tamaño gigante (SLD, “single and supersized LD”) o LDs pequeños y agrupados, en función de la ausencia o presencia, respectivamente, del precursor fosfolipídico inositol en el medio. La fase de crecimiento de las células también influye en la distribución relativa de estos fenotipos: mientras que los agregados de LDs predominan en las células en división, los SLDs se encuentran principalmente en células en fase estacionaria. Observamos que el complejo formado por Ldb16 y Fld1 es necesario para el fenotipo de LDs normal. En particular, esta doble morfología de LDs no se observa en ningún otro mutante estudiado hasta ahora, lo que sugiere que Fld1 / Ldb16 tiene un papel único en la biogénesis de LDs. Combinando el análisis de espectrometría de masas en LDs purificados con microscopía, se observó que la distribución de muchas proteínas de RE y LDs estaba alterada en estos mutantes. Los cambios observados en un subconjunto de proteínas enriquecidas en la superficie de las LDs, nos indicaron que las propiedades físicas de los LDs agrupados podrían diferir de las de los LDs gigantes. Los datos obtenidos siguiendo el proceso de biogénesis de LD sugieren que el complejo Fld1/Ldb16 organiza dominios de membrana en los sitios de ensamblaje de LDs, y en su ausencia la segregación entre RE y LDs pueden perderse. Proponemos que la función del complejo Fld1/Ldb16 es facilitar el establecimiento de la identidad del LD, actuando como una barrera de difusión en los sitios de contacto RE-LD.

Material addicional: http://hdl.handle.net/10230/25608 / Lsm proteins regulate RNA metabolism and are conserved in the three domains of life, typically functioning as RNA-binding complexes involved in a wide range of post-transcriptional mechanisms. Generally, their functions have been explored in unicellular models using biochemical approaches; however their physiological roles in multicellular organisms remain unknown. This gap in knowledge is biomedically relevant since alterations of individual LSM proteins functions have been related to cancer development. We performed a functional study of the eleven LSM proteins encoded in the C. elegans genome. We found that although lsm-1 and lsm-3 genes are not essential for the viability of the organism, they are required for wild type healthspan. In addition LSM-1 and LSM-3 proteins function in stress responses by promoting cytoplasmic LSM foci formation and influencing Insulin/IGF-like signaling pathway, a major regulator of development and stress response in metazoans. This study uncovers a physiological role for the LSM proteins in multicellular organisms as essential players for healthspan maintenance and stress adaptation. / Las proteínas de la familia Lsm están conservadas desde bacterias a humanos y participan en el metabolismo de ARN. Aunque el estudio de sus funciones ha sido generalmente abordado mediante aproximaciones bioquímicas en modelos unicelulares, sus funciones en organismos multicelulares son desconocidas. Su estudio en organismos modelo es de especial relevancia biomédica ya que la alteración específica de ciertas proteínas Lsm ha sido relacionada con el desarrollo del cáncer. Mediante el estudio funcional de las once proteínas Lsm presentes en C. elegans, mostramos cómo los genes lsm-1 y lsm-3, pese a no ser esenciales para la viabilidad del organismo, son necesarios para el mantenimiento de su salud. Además, LSM-1 y LSM-3 funcionan durante la respuesta a estrés promoviendo la agregación citoplasmática de proteínas LSM y contribuyendo a la correcta señalización a través de la vía de la Insulina/IGF-like, importante en la regulación del metabolismo y la respuesta a estrés en metazoos. Este estudio destaca el importante papel fisiológico de las proteínas LSM en el desarrollo y la adaptación al estrés de un organismo multicelular.

The 1st part of the thesis demonstrates that autophagy promotes cell death by an intrinsic apoptotic pathway at the early times of trophic-nutritional deprivation. In this paradigm, autophagy also promotes apoptosis induced by anticancer drugs. At longer times, autophagy displays its assumed protective role on starved cells. Time, being the only determinant of the dual role of autophagy on cell fate, is a novelty that impinges on tumor biology and therapy. The 2nd part of the thesis focuses on the compound 2-phenylethynesulfonamide (PES) with a promising lethal selectivity for cancer cells, already published. PES is an inhibitor of Heat Shock Protein 70 and autophagy, thus impairing cell proteostasis. The thesis reveals a positive feed-back between reactive oxygen species and p53 in the PES mode of action. Finally, PES uncovers an unexpected pro-survival function of BAX protein, precisely the promotion of mitochondrial fusion. / La primera part de la tesi demostra que l'autofàgia promou la mort cel•lular per una via apoptòtica intrínseca a temps inicials de la privació-tròfica nutricional. En aquest paradigma, l'autofàgia també promou l’apoptosi induïda per fàrmacs anticancerosos. A temps més llargs, l'autofàgia mostra el seu paper protector. El temps com a únic determinant de la funció dual de l'autofàgia en el destí cel•lular és una novetat, que incideix en la biologia i teràpia antitumoral. La segona part de la tesi estudia el compost 2-feniletísulfonamida (PES) amb una prometedora letalitat selectivitat pel càncer, ja publicada. PES és un inhibidor de “Heat Shock Protein 70” i autofàgia, fet que trenca la proteostasi cel•lular. La tesi revela una retroalimentació positiva entre espècies reactives d’oxigen i p53 en el mecanisme d’acció de PES. Finalment, PES posa de manifest una funció inesperada i pro-supervivència de la proteïna BAX, concretament promoure la fusió mitocondrial. / La primera parte de la tesis demuestra que la autofagia promueve la muerte celular por vía apoptótica intrínseca a tiempos tempranos de privación trófico-nutricional. En este paradigma, la autofagia también promueve apoptosis inducida por fármacos anticancerosos. A tiempos más largos, la autofagia muestra su papel protector. El tiempo como único determinante de la función dual de la autofagia en el destino celular es una novedad, que incide en la biología y terapia antitumoral. La segunda parte de la tesis estudia el compuesto 2-feniletinosulfonamida (PES) con una prometedora letalidad selectiva por el cáncer, ya publicada. PES es un inhibidor de "Heat Shock Protein 70" y autofagia, lo cual rompe la proteostasis celular. La tesis revela una retroalimentación positiva entre especies reactivas de oxígeno y p53 en el mecanismo de acción de PES. Finalmente, PES pone de manifiesto una función inesperada y pro-supervivencia de la proteína BAX, concretamente promover la fusión mitocondrial.

Los sinusoides del bazo humano promueven la lenta percolación de la sangre, favoreciendo la captura de antígeno por los fagocitos y linfocitos del sistema inmune local. Estratégicamente posicionadas delimitando los vasos, e históricamente conocidas como células retículo-endoteliales, las células que delinean los sinusoides (SLCs), tienen una biología enigmática y podrían ser vistas como un componente desconocido del sistema inmunológico. En esta tesis hemos observado que las SLCs poseían un fenotipo simil-endotelial, eran específicas de humano y expresaban moléculas típicamente asociadas al linaje endotelial como el factor de von Willenbrand, y las moléculas CD31, CD54, CD102, CD105 y CD141. Sin embargo, a diferencia de las células endoteliales, las SLCs también expresaban moléculas típicamente asociadas al linaje estromal como la vimentina y la actina de músculo liso, junto con varias moléculas del linaje mieloide como CD14, CD36, CD163, MR, DEC-205 y TLR4. A si mismo, las SLCs evidenciaron una huella genética típicamente macrofágica que incluía sensores microbianos, receptores de tipo “scavenger”, mediadores de la respuesta inmunitaria y reguladores de la fagocitosis y la presentación antigénica. Además de fagocitar antígenos a través de un mecanismo actina-dependiente, las SLCs secretaban BAFF, APRIL, IL-6 y CXCL10, induciendo el reclutamiento, la activación y la supervivencia de células B de la zona marginal, un subtipo celular especializado en la respuesta de anticuerpos frente a antígenos provenientes de la sangre. Por lo tanto, las SLCs son células endoteliomieloides que funcionan como centinelas dotados de funciones fagocíticas y que ayudan en la producción de anticuerpos. / Sinusoid vessels promote the slow percolation of venous blood through the red pulp of the spleen, thereby favoring antigen capture by phagocytes and lymphocytes of the local immune system. Strategically positioned around sinusoids and historically known as reticulo-endothelial cells, sinusoid-lining cells (SLCs) have an enigmatic biology and thus can be viewed as an orphan component of our immune system. We found here that SLCs were a human-specific population of endothelial-like cells that expressed typical endothelial molecules such as von Willenbrand factor, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD102 (ICAM-2), CD105 (endoglin) and CD141 (thrombomodulin). However, unlike endothelial cells, SLCs also expressed the stromal molecules vimentin and smooth muscle actin along with several myeloid molecules such as CD14, CD36, CD163, MR, DEC-205 and TLR4. Accordingly, SLCs showed a prominent macrophage-like gene signature that included microbial sensors, scavanger receptors, immune mediators, and regulators of phagocytosis and antigen presentation. Besides phagocytosing particulate antigens through an actin-dependent mechanism, SLCs released BAFF, APRIL, IL-6 and CXCL10, which enhanced the recruitment, activation and survival of marginal zone (MZ) B cells, a splenic lymphocyte subset specialized in innate-like antibody responses to blood-borne antigens. Thus, SLCs are endothelialmyeloid cells that serve as sentinels endowed with phagocytic and antibody-enhancing functions.

El cultiu de cèl·lules animals és una tecnologia que disposa d'un gran potencial econòmic i social, cada cop més elevat degut a la pròpia importància de les aplicacions en les que es troben relacionats aquests productes, que es troba enfocat al descobriment, desenvolupament i ús de nous productes biotecnològics. Degut a la major complexitat del cultiu de cèl·lules animals i a les limitacions que presenten envers els cultius de cèl·lules procariotes per a l'obtenció d'elevades concentracions cel·lulars, és necessari dotar el cultiu de cèl·lules animals de tecnologies que permetin optimitzar‐ne la seva expansió cel·lular i poder evitar l'actual suboptimització de la majoria dels processos de cultius de cèl·lules animals, que s'han basat en estratègies de cultiu simples (discontinu) i que limiten fortament les concentracions finals obtingudes. Un dels paràmetres clau en un cultiu de cèl·lules és la concentració cel·lular, essent la màxima concentració cel·lular un dels objectius primordials dels cultius cel·lulars a la fi de poder obtenir la màxima productivitat. No és estrany, doncs, que aquest paràmetre es consideri el més important a monitorar en línia per a aquest tipus de processos. Tot i que la majoria de productes biotecnològics son produïts mitjançant cultius de cèl·lules animals que creixen en suspensió, cada cop existeix un ventall de productes més extens produït exclusivament per cèl·lules adherents, com per exemple quan una línia cel·lular adherent no s'ha pogut adaptar amb èxit cap a un cultiu en suspensió, quan el producte són les pròpies cèl·lules adherents, quan es tracta d'un producte viral o proteic que necessita dels tipus concrets de cèl·lules animals adherents o per a les tecnologies emergents de les cèl·lules mare i l'enginyeria tissular, on la majoria dels llinatges cel·lulars resultants són adherents. La problemàtica però, recau en que moltes de les tecnologies que es troben desenvolupades actualment es varen focalitzar cap als cultius de cèl·lules animals en suspensió, mentre que els cultius de cèl·lules animals adherents es deixaven a banda. El fet que aquestes cèl·lules es trobin adherides formant una monocapa a la superfície del sistema de cultiu i no es trobin en suspensió, implica que les actuals metodologies i sensors comercials utilitzats pel seguiment de la concentració cel·lular en cultius de cèl·lules no adherents i que gaudeixen d'una bona sensibilitat, no siguin aplicables. A més a més, les mesures actuals que s'utilitzen pel monitoratge de cultius de cèl·lules adherents impliquen la utilització de mètodes destructius i fora de línia, obligant a la utilització de diversos cultius en paral·lel per a poder obtenir més d'un valor de concentració cel·lular al llarg d'un creixement cel·lular, amb la variabilitat que això significa. Així doncs, en aquest treball s'ha abordat aquesta problemàtica, amb l'objectiu de desenvolupar i implementar unes tecnologies que permetin el seguiment, en línia, de la concentració cel·lular, ja sigui de forma directa o bé de forma indirecta, mitjançant la seva estimació a partir de la mesura de l'activitat cel·lular, i que pugui abraçar l'ampli ventall de línies cel·lulars existents que creixen en adherència i que disposen de característiques cel·lulars diferents (consums de nutrients, concentracions cel·lulars, necessitats en el medi de cultiu...). / The cultivation of animal cells is a technology that has great economic and social increasingly potentials, due to the very important applications in which these products are related, which are focused on the discovery, development and use of new biotechnology products. Due to the greater complexity of the cultivation of animal cells and its limitations to obtain high cell concentrations when compared to prokaryotic cells, we must develop new technologies which permits the optimization of animal cell cultures in order to prevent the current suboptimitzation of most animal cell cultures processes, which are usually based on simple cultivation strategies (batch) that limit strongly the final obtained cell concentrations. One of the key parameters in cell culture is cell density being, the maximum cell density, one of the main objectives of cell cultures in order to obtain maximum productivity. It's for this reason that it is considered the most important parameter to monitor online. Although most biotechnology products are produced by animal cells that grow in suspension cultures, the products produced exclusively for adherent cells are in constant increase, for example when an adherent cell line can't be successfully adapted to suspension cultures, when the product are the same adherent cells, when a required viral or protein product are only produced by specific types of adherent animal cells or for the emerging stem cell and tissue engineering technologies, where most of its related cell lines are adherent. The problem however, lies in that many of the current technologies have been developed for suspension animal cells, while adherent animal cell lines were left aside. The fact that these adherent cells are attached to the surface forming a monolayer culture system and are not suspended in the medium, means that the current methodologies and commercial sensors with good sensibilities used to monitor cell concentration in suspension cell cultures, can't be used for adherent cells. In addition, the current measurements used to monitor adherent cell cultures involve the use of destructive offline methods, forcing the use of various cultures in parallel in order to obtain different measurements over a whole cell growth, with the variability that it means. Thus, this work has been addressed to solve this problem with the objective to develop and implement some technologies that permits to online monitor of cell using direct methods and indirect methods through their estimation from the measurement of cellular activity, technologies which must permit to monitor cell concentration to the wide range of existing adherent cell lines with different cellular characteristics (nutrient uptake, final cell concentrations, needs in culture medium, etc.).