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Les parasites protozoaires du genre Leishmania sont les agents microbiens responsables d’un groupe de maladies connues sous le nom de leishmanioses. L’infection productive dépend de la capacité de survie du parasite suite au premier contact initial du système immunitaire de l’hôte. Par conséquent, la prolifération du parasite à l’intérieur des phagolysosomes sera responsable de la pathologie. Les promastigotes stationnaires, récupérés en culture axénique de laboratoire sont semblables aux promastigotes métacycliques. Ces derniers sont fortement immunomodulateurs et sont considérés, traditionnellement comme la forme la plus infectieuse du parasite. Les protéines sécrétées de différents organismes ont été directement impliquées dans plusieurs pathologies. Donc, il est possible que les protéines sécrétées par Leishmania, soient également impliquées dans la capacité du parasite à subvertir le système immunitaire. Les avancées récentes dans l’étude du sécrétome de plusieurs types de Leishmania ont permis d’affirmer que le sécrétome est fort complexe. Nous avons déterminé qu’environ 300 protéines sont sécrétées par le parasite, la plupart d’entre elles ayant aucun signal canonique de sécrétion. Le sécrétome de Leishmania est donc composé surtout de protéines qui sont libérées par sécrétion non conventionnelle,. Afin d’étudier le sécrétome associé à la virulence, nous avons développé et validé une approche qui a permis l’étude des composants de l’exoprotéome des parasites stationnaires et logarithmiques. Cette approche était basée sur la culture continue des parasites dans un milieu de culture sans supplément de sérum de bovin fœtal, cRPMI, dans lequel la virulence des parasites est maintenue. Grâce à cette approche nous avons mis en évidence un exoproteome distinct de ceux jusqu’à date répertorié. La méthode de production et de la récupération de l’exoproteome sont donc très importants. Notre exoprotéome est dominé par la GP63, une glycoprotéine dont l’importance centrale dans l’infection a été déjà validée. La culture continue des parasites est donc essentiel pour avoir un exoprotéome représentatif. Nous avons également déterminé que la cultutre en continu pouvait amener à une diminution de la virulence et quarante divisions sont nécessaires pour une perte de virulence significative. Par conséquent toutes nos études se sont fait chez des parasites comptant moins de 20 divisions. Le principal mécanisme associé à la perte de virulence a été identifié comme une incapacité de se différencier en amastigotes. Le cRPMI a donc permis la culture des parasites pour l’étude de l’exoprotéome tout en maintenant la virulence des parasites. La présence de vésicules, décrite déjà comme un composant de l’ exoprotéome, a été confirmée aussi par notre approche continue et a été confirmé, d’ailleurs, dans l’exoproteome des parasites en phase de croissance logarithmique. Les vésicules récupérées des parasites logarithmiques diffèrent de celles recueillies de parasites en phase stationnaire de croissance. En effet des protéines potentiellement impliquées dans la rénovation et le recyclage du contenu protéique, tels certains composants du ribosome étaient enrichies dans les parasites en phase logarithmique tandis que les vésicules des parasites stationnaires ont un contenu protéomique ayant des caractéristiques similaires aux corps apoptotiques des cellules de mammifères. En dehors de la GP63, plusieurs autres protéines décrites comme immunomodulatrices ont été retrouvées dans l’exoprotéome des parasites stationnaires, ce qui indique que celui-ci contient un ensemble de protéines avec un potentiel d’interaction directe avec les cellules du système immunitaire. Immunologiquement, l’exoprotéome récupéré des parasites stationnaires a été capable d’activer les cellules dendritiques, laissant supposer une fonction importante dans la création d’un environnement inflammatoire précoce lors des premières étapes de l’infection. En conclusion, la recherche développée a contribué à l’avancement des connaissances actuelles sur la biologie du Leishmania, grâce au développement et à la validation d’une nouvelle approche afin d’étudier son exoprotéome. L’exoprotéome récupéré était dynamique, il avait une composition spécifique, dépendant du stade du parasite. Cet exoprotéome avait des effets spécifiques sur les cellules dendritiques et il jouait un rôle important dans les étapes précoces de l’infection. Cette étude a ouvert des nouvelles perspectives sur l’exoprotéome de Leishmania spp. permettant la découverte de nouvelles protéines immunomodulatrices et, en corrolaire, de nouvelles cibles pour le contrôle de la maladie associée au parasite. / Protozoa parasites of the genus Leishmania are the responsible for a group of diseases known as leishmaniasis. The infection is associated with the capacity of these parasites to survive in the phagolysosomes of infected macrophages. Successful infections with pathogenic Leishmania spp. are linked to the capacity of the parasite to survive the initial impact of the host immune system and to interfere with the infected cells rendering them incapable of eliminating the parasites. The secreted proteins from the parasite are expected to be in the front line for interactions with the host. Recent advances in the study of the secretome of Leishmania spp. depicted it as highly complex with the majority of proteins without any predictable secretion signal. The secretome is composed of proteins that are released by different mechanisms like conventional and unconventional secretion. Several proteins secreted by Leishmania spp. are known to interact and influence the outcome of the disease by directly interfering with the host immune cells. The proteomic studies on the Leishmania spp. secretome identified more than three hundred proteins released into the exterior. The stationary promastigotes recovered in axenic culture were enriched in the most virulent promastigote form, the metacyclic parasites. Therefore we aimed at evaluating the exoproteome associated with the stationary parasites. To achieve this we developed and validated an approach that would enable the study of the exoproteome components of stationary and logarithmic parasites. This approach was based on the continuous cultivation of the parasites in a medium without any protein supplementation that maintained the basic virulence of the parasites. The continuous approach produced a GP63-rich exoproteome that was distinct from the traditional approaches indicating that the process of recovery induced a significant bias in the study. Furthermore as the continuous approach was chosen, we determined the mechanisms associated with loss of virulence assuring that fully virulent parasites were used. At least forty parasite divisions were required for a short-term loss of virulence. The main mechanism associated with loss of virulence was identified as a growing incapacity to differentiate into amastigotes. The defined time interval of forty divisions enabled us to evaluate the exoproteome without loss of virulence related to the subculture. The protein-free medium developed, cRPMI, retained parasite virulence and morphology similar to that of parasites grown in standard media. The exoproteomes recovered using cRPMI were dominated by proteins without any recognizable secretion sequence, in concordance with reports on other Leishmania spp. The presence of vesicles, already reported as a component of the exoproteome, was also confirmed using our continuous approach. Furthermore, the presence of vesicles in the logarithmic parasites exoproteome was confirmed. The protein content of these vesicles presented a dynamic profile that was dependent on the parasite stage. The vesicles recovered from logarithmic parasites seemed to be related to protein turnover, being significantly enriched in ribosomal components. The vesicles from stationary parasites are of different composition, presenting some characteristics similar to apoptotic bodies. Immunologically the exoproteome recovered from stationary parasites was able to activate dendritic cells suggesting that the exoproteome might have a function in the creation of an early inflammatory environment leading to the recruitment of neutrophils and monocytes that might function as safe heavens for the parasites. In conclusion, our research has contributed to the advance of the current knowledge of Leishmania biology, through the development and validation of a novel approach to study the Leishmania secretome. The exoproteome recovered from stationary parasites had specific immune-modulating effects on bone marrow derived dendritic cells, indicating that it can play an important role in the precocious steps of infection. This study opened new perspectives into the Leishmania spp. exoproteome that will enable the search of new immunomodulatory proteins that might become the future targets to leishmaniasis control.

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Les cellules endothéliales cornéennes constituent un tissu à la fois extrêmement particulier et d’une importance singulière. En effet, celui-ci est pourvu d’une capacité régénératrice pratiquement nulle, mais son intégrité est essentielle à la transparence cornéenne et donc à la vision. Par contre, l’endothélium cornéen fait défaut dans diverses pathologies telles que la dystrophie de Fuch et la kératopathie bulleuse du pseudophaque. La méthode traditionnelle pour le remplacement d’un endothélium cornéen pathologique est la greffe de cornée pleine épaisseur. Par contre, la greffe lamellaire postérieure est une alternative chirurgicale en plein essor, très intéressante, puisqu’elle permet de remplacer seulement la portion malade de la cornée. Cette technique chirurgicale a ouvert la porte à une nouvelle possibilité au niveau du génie tissulaire. En effet, il est maintenant envisageable de greffer un endothélium produit en laboratoire. Un défi supplémentaire, que s’est imposé notre équipe, est de reconstruire non seulement un endothélium complet, mais d’en reconstruire un qui serait également autologue, l’immunogénicité jouant un rôle non négligeable lors d’échec de greffes. Mon rôle dans ce projet était donc d’évaluer la faisabilité de reconstruire par génie tissulaire un endothélium cornéen autologue pour notre modèle animal, et ce, à des fins de greffes. D’abord en optimisant les conditions de culture afin de permettre la croissance des cellules endothéliales cornéennes animales. Puis en reconstruisant in vitro un endothélium à partir d’une biopsie cornéenne de taille minimale. Un endothélium sain similaire au tissu natif a ainsi été reconstruit.

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La E-sélectine, un récepteur d'adhérence spécifique des cellules endothéliales interagit avec le Death Receptor 3 (DR3), exprimé par les cellules du cancer du côlon. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux mécanismes par lesquels les voies activées en aval de DR3 confèrent des avantages de survie aux cellules cancéreuses du côlon. Dans un premier temps, nous avons montré que DR3 est exprimé par les cellules HT29 sous une version potentiellement sécrétée et sous une forme membranaire toutes deux tronquées. Ces versions dépourvues de Death Domain n’induisent pas l'apoptose. Secondairement, nous avons constaté que la E-sélectine déclenche la phosphorylation sur tyrosine du récepteur via un membre de la famille des Src kinases. Nous avons finalement obtenu des preuves indiquant que la E-sélectine comme le TL1A activent l’axe de survie PI3K/Akt/ NFB. / E-selectin, a specific endothelial adhesion receptor, interacts with Death Receptor 3 (DR3) expressed by colon cancer cells. In this study, we investigated further the mechanisms by which the E-selectin-activated pathways downstream of DR3 confer a survival advantage to colon cancer cells. We found that DR3 exists under both transmembrane and secreted versions in HT29 cells. These Death Domain deleted isoforms hamper apoptosis. Additionally, we found that E-selectin could trigger the tyrosine phosphorylation Tyr285 of DR3 in a Src family member-dependent manner. We also obtained evidence indicating that E-selectin and TL1A induce the PI3K/Akt/NFκB p65 survival axis.