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PAX2 optimizes nephron number during kidney development

Dziarmaga, Alison. January 2005 (has links)
In normal human populations, nephron number varies widely from 300,000 to over one million nephrons per kidney. This dramatic range was once considered to have no clinical relevance, but recently it has been found that individuals at the lower end of the nephron number spectrum have increased risk of essential hypertension during adulthood. Final nephron number is determined during fetal kidney development and is irreversibly set by birth in humans. The mechanisms which set nephron number remain a mystery. / Humans with the Renal-Coloboma Syndrome (RCS) are born with renal hypoplasia due to a paucity of nephrons. This hereditary disease is caused by mutations in the PAX2 gene, a transcription factor expressed in the kidney, brain and eye. During normal kidney development, PAX2 exerts multiple functions. However, it remains unclear which of these functions is crucial for optimal branching morphogenesis, leading to sufficient nephron formation. Based on our previous observations, we hypothesized that the anti-apoptotic function of PAX2 is critical for determining congenital nephron number. / To test this hypothesis, we used the human PAX2 promoter to target a pro-apoptotic gene (Bax) to the ureteric bud and showed that this was sufficient to cause renal hypoplasia, mimicking RCS. We show that suboptimal fetal branching causes congenital nephron deficits in heterozygous Pax2 mutant mice, which subsequently compromises renal function at one year of age. Furthermore, the nephron deficit in Pax2 mutant mice was rescued by targeting an anti-apoptotic gene (BCL2) to the ureteric bud in fetal kidney. / Finally, we discovered that PAX2 directly activates transcription of the NAIP gene, encoding an endogenous caspase inhibitor first identified in brain. We demonstrate Naip gene expression in developing mouse kidney and show that inhibition of Naip in collecting duct cells causes increased caspase-3/7 activity. / These studies support our hypothesis that the anti-apoptotic function of PAX2 is critical for setting congenital nephron number and we have identified an anti-apoptotic protein, directly regulated by PAX2, which may serve to protect ureteric bud cells from programmed cell death.

Transmission and distribution pattern of disease-related genes in early mammalian embryos

Dean-Booth, Nicola. January 2006 (has links)
Knowledge of the mechanisms involved in the transmission of pathogenic mutations during early development is paramount to understanding the inheritance of human disease. The current thesis investigated the transmission to early embryos of the (CTG)n repeat in the human dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) gene, which is expanded in dystrophia myotonica type 1 (DM1) and of heteroplasmic mitochondrial DNA (mtDNA). For each of these studies, single in-vitro cultured human or in-vivo generated mouse oocytes and embryos were genotyped for the specific DNA sequences of interest. / Initially, genotyping was optimised at the single-cell level using different protocols and methods of product detection. Fluorescent-based PCR analysis of the mutation of interest multiplexed with a linked polymorphic marker was found to provide maximal efficiency and accuracy. Once standardised, these tests were applied to clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and served as the experimental basis for further work presented in this thesis. This included two studies investigating the transmission of the DMPK repeat. In the first study, the objective was to determine whether transmission ratio distortion (TRD) in favour of larger normal-sized alleles ((CTG)19-37) was evident during early human embryogenesis. A statistically significant TRD in favour of DMPK (CTG)19-37 repeats was observed in embryos, which remained significant when female embryos were considered separately. This TRD was shown to be specifically due to the transmission of repeats in the (CTG)19-37 range. The developmental time-point of TRD of these alleles was suggested to occur around the time of fertilisation. In addition, instability in this repeat length was demonstrated during paternal transmission. The second objective was to further elucidate the timing and variability of the intergenerational enlargements observed in expanded DMPK alleles in early development. From our analysis, repeat expansion was found to occur in oogenesis, most likely before the completion of meiosis I. Furthermore, variable degrees of expansion were observed in each cohort of embryos, which are comparable to the phenotypic variability seen between DM1 siblings. / In the final chapter, the segregation pattern of murine heteroplasmic mtDNA in oocytes and early embryos was examined in order to determine the feasibility of PGD for mtDNA mutations. This study demonstrated that the mean level of heteroplasmy in the polar body of an oocyte or a single blastomere of an embryo was representative of the level in the embryo as a whole and, therefore, PGD would be a viable option for women heteroplasmic for mtDNA point mutations.

Genetics of radiation-induced lung disease in the mouse

Tomko, Tomasz January 2013 (has links)
Radiation therapy of the thorax may result in side effects such as alve- olitis and pulmonary fibrosis, both of which limit the efficacy of cancer therapy. Previously, it was determined that mice congenic on chromosomes 2, 4 and 11 succumb to radiation-induced lung disease significantly faster than C57BL/6J mice. Herein we use chromosome 4 and 11 congenic strains and chromosome 4 sub-congenic strains to identify radiation-induced lung response susceptibility loci in C3H/HeJ congenic mice on a C57BL/6J background. Mice were treated with 18-Gy whole-thorax irradiation and their survival, lung histopathology, and BAL cell types were determined. All protein coding genes within the congenic regions were analyzed in silico and a QTL-wide association study was completed for each congenic region using the survival time phenotypes of 27 inbred strains. The C3H/HeJ strain succumbed to radiation-induced lung disease significantly faster than the C57BL/6J strain and exhibited an increase in the percentage of neutrophils combined with a decrease in the percentage of macrophages in the BAL. The survival time phenotype of the chromosome 4 congenic and sub-congenic strains, as well as the chromosome 11 congenic strain, did not differ from the C57BL/6J response. The chromosome 11 congenic strain exhibited a significant increase in alveolitis, fibrosis, and percentage of lymphocytes in the BAL in addition to a decrease in the percentage of macrophages compared to the C57BL/6J strain. Only one of five chromosome 4 sub-congenic strains differed in response from the C57BL/6J strain, these differences included a decrease in the percentage of macrophages and an increase in the percentage of lymphocytes in the BAL. In silico analysis of congenic regions decreased the number of probable candidate genes by 69% and a QWAS on the chromosome 2 congenic region determined a significant association with a SNP located in the first intron of the Wfdc8 gene. In this animal model, a locus on chromosome 2 appears to be associated with the survival time phenotype of whole-thorax irradiated mice. / La radiothérapie du thorax peut entraîner des effets secondaires tels que l'alvéolite et la fibrose pulmonaire, les deux qui limitent l'efficacité de la thérapie du cancer. Auparavant, il a été déterminé que les souris congéniques sur les chromosomes 2, 4 et 11 succombent à la maladie induite par le rayonnement du poumon significativement plus rapide que les souris C57BL/6J. Ici, nous utilisons le chromosome 4 et 11 souches congéniques et le chromosome 4 sous-souches congéniques pour identifier les radio-induites loci de susceptibilité dans pulmonaires réponse des souris C3H/HeJ congéniques sur un fond C57BL/6J. Les souris ont été traitées avec 18 Gy d'irradiation du thorax entier et leur survie, du poumon histopathologie et types de cellules BAL ont été déterminées. Toutes les gènes codant des protéines à l'intérieur des régions congéniques ont été analysés in silico et une étude de QTL à l'échelle association a été effectuée pour chaque région congéniques utilisant les phénotypes de temps de survie de 27 souches consanguines. La souche C3H/HeJ succombé à la maladie pulmonaire induite par un rayonnement beaucoup plus rapidement que la souche C57BL/6J et présentaient une augmentation du pourcentage de neutrophiles et de la baisse du pourcentage de macrophages dans la BAL. Le phénotype temps de survie des 4 chromosomes souches congéniques et sous-congéniques, ainsi que le chromosome 11 souches congéniques, ne diffère pas de la réponse C57BL/6J. Le chromosome 11 souche congénique a montré une augmentation significative de l'alvéolite, fibrose, et le pourcentage de lymphocytes dans le LBA en plus d'une diminution du pourcentage de macrophages par rapport à la souche C57BL/6J. Seulement l'un des cinq sous-chromosome 4 souches congéniques différente en réponse à partir de la souche C57BL/6J, ces différences inclus une diminution du pourcentage de macrophages et une augmentation du pourcentage de lymphocytes dans la BAL. Une analyse in silico des régions congéniques diminué le nombre de gènes candidats probables de 69% et un QWAS sur le chromosome 2 congéniques région déterminée une association significative avec un SNP situé dans le premier intron du gène Wfdc8. Dans ce modèle animal, d'un locus du chromosome 2 semble être associé avec le phénotype de toute la durée de survie des souris irradiées-thorax.

Defining the role of different KRAS effectors in the initiation and progression of lung cancer

Vandal, Guillaume January 2013 (has links)
Lung cancer is currently the most deadly malignancy in Canada, accounting for 27% of all cancer-related deaths. Over 70% of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) are diagnosed at a late stage, with a 5-year survival below 10%. In NSCLC, the two oncogenes that are most frequently mutated are the EGFR and KRAS genes. While targeted therapies have been developed for patients with EGFR mutations, oncogenic KRAS mutations are so far not druggable. KRAS is a small GTPase that acts as an on/off switch to activate multiple signalling pathways, including the PI3K/Akt pathway, the Raf-Mek-Erk pathway and the RalGDS/Ral pathway. In the BrafCA mouse model of lung tumourigenesis, it was shown that the Cre-mediated expression of BrafV600E, activating the Raf-Mek-Erk pathway, causes the formation of adenomas that undergo widespread senescence at the benign stage. However, oncogenic KRAS mutations in mice cause adenocarcinomas, which suggests that other pathways activated by KRAS cooperate with sustained RAF-MEK-ERK signalling to bypass the oncogene-induced senescence proliferation arrest. To elucidate which pathways may cooperate with the Raf-Mek-Erk pathway to lead to lung adenocarcinomas, I created four effector domain mutants of KRASV12 (S35, G37, E38 and C40). The S35 and E38 mutants bind to Raf proteins but not PI3K or RalGDS; the G37 mutant binds to RalGDS and not Raf or PI3K and the C40 mutant is specific to PI3K. I designed lentiviral vectors that code for the KRAS mutants (V12, V12/S35, V12/G37, V12/E38 or V12/C40), or eGFP as a negative control, bicistronically with the Cre recombinase. These lentiviruses were used to infect BrafCA/+ and wild-type mice. The biggest tumours seen in BrafCA/+ mice received the KRASV12 virus, followed closely by KRASV12/C40, suggesting that the PI3K and Raf-Mek-Erk pathways cooperate to increase tumour growth. There was a significant decrease in tumour penetrance in all conditions where any KRAS mutant was present compared to the eGFP control, suggesting that KRAS may directly activate effectors with tumour suppressive functions. Moreover, tumours in wild-type mice were only seen with KRASV12 expression. / Le cancer du poumon est le cancer affichant la plus grande mortalité au Canada, comptant pour 27% des mortalités liées au cancer. Plus de 70% des patients atteints du cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) sont diagnostiqués à un stade tardif, avec une survie à 5 ans en-dessous de 10%. Les deux oncogènes les plus fréquemment mutés dans le CPNPC sont les gènes KRAS et EGFR. Des thérapies ont été développées pour les patients dont le cancer a le gène EGFR muté, mais aucune médicamentation ciblée n'existe pour les mutations de KRAS. KRAS est une petite protéine GTPase qui agit comme interrupteur marche/arrêt pour l'activation de plusieurs voies de signalisation en aval, dont les voies PI3K/Akt, Raf-Mek-Erk et RalGDS/Ral. Dans le modèle murin de tumorigenèse pulmonaire BrafCA, il a été démontré que la mutation BrafV600E, activant la voie Raf-Mek-Erk, cause la formation d'adénomes qui subissent une induction de sénescence au stade bénin. Des mutations du gène KRAS peuvent causer la formation d'adénocarcinomes, suggérant que d'autres voies de signalisation activées par KRAS coopèrent avec une signalisation soutenue de la voie Raf-Mek-Erk pour contourner l'apparition de sénescence d'induction oncogénique.Pour faire la lumière sur quelles voies de signalisation peuvent coopérer avec la voie Raf-Mek-Erk pour mener aux adénocarcinomes pulmonaires, j'ai créé quatre mutants de KRASV12 (S35, G37, E38, C40). Les mutants S35 et E38 interagissent avec les protéines Raf mais pas PI3K ou RalGDS; le mutant G37 peux lier RalGDS mais pas Raf et PI3K; le mutant C40 est spécifique pour PI3K. J'ai conçu des vecteurs lentiviraux codant pour ces mutants de KRAS (V12, V12/S35, V12/G37, V12/E38, V12/C40), ou l'eGFP comme contrôle négatif, de manière bicistronique avec la recombinase Cre. Des souris BrafCA/+ et d'autres de type sauvage ont été infectées avec ces lentivirus. Les plus grosses tumeurs observées étaient dans des souris BrafCA/+ ayant reçu le virus codant pour KRASV12, suivi de près par le mutant V12/C40, ce qui suggère que les voies PI3K et Raf-Mek-Erk coopèrent positivement dans la croissance tumorale. Il y avait une diminution significative dans le nombre de tumeurs observées dans toutes les conditions où un mutant de KRAS était présent comparativement au contrôle eGFP, suggérant que KRAS pourrait activer directement des effecteurs avec des fonctions suppresseurs de tumeur. De plus, dans les souris de type sauvage, des tumeurs n'ont été observées qu'avec l'expression de KRASV12.

Direct assessment and validation of allele specific transcription factor binding in the human genome

Schiavi, Alicia January 2013 (has links)
Characterization of human genetic variation has focused on expression quantitative trait loci (eQTL) mapping; however, direct assessment of cis-regulatory variation requires allele-specific approaches. Measuring allelic expression (AE) on a genome-wide scale appears more powerful as environmental and trans-acting influences are minimized. Results indicate that allele-specific differences in transcript expression within an individual can affect up to 30% of loci. The underlying variants can be identified by mapping differences in AE on Illumina BeadChips. Over 50% of population variance in AE is explained by mapped cis-rSNPs. Studies show that these cis-rSNPs have been implicated in differences in transcription factor (TF) binding, suggesting that TF action can be further investigated using population variation as a tool. In this thesis, these approaches have been extended to explore allele-specific TF binding using the model NF-κB by monitoring the consequences of gene knockdown in a genome-wide manner. NF-κB has been shown to be involved in the immune response and the NF-κB motif is enriched in lymphoblastoid cell lines (LCLs), mainly in promoters and strong enhancer elements. We intersected mapped candidate cis-rSNPs detected in LCLs in our above experiments as well as matched control SNPs from HapMap YRI and CEU populations with publicly available NF-κB Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)-seq experiments from the ENCODE project. Preliminary analysis of regions surrounding candidate cis-rSNPs were enriched in NF-κB binding sites versus matched controls, with 39.0 % of top SNPs overlapping at least one NF-κB ChIP-seq peak. To elucidate the impact of candidate SNPs on AE imbalances, we performed TNF- α induction coupled to inhibition of NF-κB in LCLs followed by AE analysis on Illumina HumanOmni5-Quad BeadChips. We used in house mapped cis-regulatory variants in the LCL population merged with data from the aforementioned experiment. Our data set, which consisted of loci associated to top 10 cis-rSNPs ranked by p-value (pv; top10= 10 most significant p-values) that showed diminished AE upon perturbation of NF-κB were overlapped with publicly available data. This data consisted of ENCODE ChIP-seq peaks and TRANSFAC binding sites for NF-κB and known cooperative TFs of NF-κB. Loci that had an AE change at greater than 3 SNPs upon perturbation of NF-κB and were associated to top heterozygous SNPs (rank 1, 2, 3) yielded 581 cases out of ~1700. Analysis of top 3 ¬cis-rSNPs described showed a significant difference of over 5-fold between case and control SNPs, such that 64% of loci had a top 3 heterozygous SNP that was found in an LCL specific TF ChIP-seq peak or TRANSFAC binding site for NF-κB or a known cooperative TF of NF-κB. Bioinformatics analysis suggests that identified SNPs are essential for NF-κB binding. A case study was also done in order to perturb the TF SNAI1 because we had a strong hypothesis for the association of SNAI1 and WNT4, as well as, evidence for its role in fibroblasts (FBs). We were not able to reproduce the effect of SNAI1 on WNT4 in vivo. Upon comparison of the regulatory role of NF-κB and SNAI1 in LCLs and FBs, respectively; we observed that NF-κB had a regulatory effect on approximately 33% of loci in comparison to only approximately 2% of loci for SNAI1 in FBs. This study illustrates that key regulatory TFs, such as NF-κB in LCLs, can be globally studied at a single base resolution in living cells using a combination of perturbation and sensitive measurements with allelic resolution. / La caractérisation de la variation génétique a mis l'accent sur les loci d'expression de caractères quantitatifs(eLCQ); cependant, l'évaluation directe des variations régulatrices en cis nécessite des approches allèle-spécifique (cis-rSNPs). La mesure de l'expression allélique (EA) est très efficace puisque les perturbations environnementales et les influences en trans sont réduites. Les résultats indiquent que les différences d'EA peuvent affecter jusqu'à 30% des loci chez un individu. Les polymorphismes responsable de telles variations peuvent être identifiés par cartographie des différences d'EA en utilisant des puces de génotypage Illumina. Ainsi, plus de 50% de la variance en EA de la population est expliqué par la cartographie des cis-rSNPs. Des études ont montré que ces cis-rSNPs ont été impliqués dans des différences de liason de facteurs de transcription (FT). Celà suggère que l'étude du mode d'action de ces FT pourrait être approfondie par l'utilisation comme outil des polymorphismes dans la population. Nous avons appliqué cette approche au FT NF-κB et analysé les conséquences de l'inactivation de ce gène à l'échelle du genome. Des données récentes montrent l'implication de NF-κB dans la réponse immunitaire et son motif de liaison à l'ADN est retrouvé enrichi dans les cellules lymphoblastoïdes humaines (LCL), surtout au niveau des promoteurs et des activateurs transcriptionnels. Nous avons croisé les cis-rSNPs cartographiés dans des LCLs des populations HapMap YRI et CEU, ainsi que des SNPs de contrôles, avec des données d'immunoprécipitation de chromatine suivi de séquençage à haut débit (ChIP-seq) utilisant l'anticorps NF-κB du projet ENCODE et accessible au public. Des analyses préliminaires des régions contenant les cis-rSNPs candidats ont montré un enrichissement des sites de liaison pour le facteur NF-κB par rapport aux sites contrôles. En effet, 39% des sites candidats sont situés dans un site de liaison pour NF-kB. Afin d'étudier le rôle potentiel des cis-rSNPs sur l'EA différentielle, nous avons réalisé des expériences d'induction de TNF-α couplé à l'inhibition de NF-κB dans les LCLs suivie par l'analyses de l'EA sur des puces de génotypage Illumina 5M. Nous avons ensuite comparé ces données avec la cartographie de cis-rSNPs dans des LCLs générée dans notre laboratoire.Nos données sont composées de cis-rSNPs associés à l'EA différentielle de loci suite à la perturbation de NF-κB et classés par valeur p (pv; top10= les 10 valeurs les plus significatives) et ont été croisées avec des données accessibles au public. Ces données sont composées des coordonnées de pics de ChIP-seq et des sites de liaison TRANSFAC pour le facteur NF-κB et de ses co-régulateurs transcriptionnels connus. Les loci montrant des différences d'EA suite à la perturbation de NF-κB et avec 1 ou plusieurs des cis-rSNPs (« top3 » pv) hétérozygotes dans les individus étudiés étaient aux nombre de 581. La recherche de ces cis-rSNPs « top 3 » dans les sites de liaison (pics de ChIP-seq) dans les LCLs ou dans un site de TRANSFAC pour NF-κB ou pour un de ses co-régulateurs transcriptionnels montrent un enrichissement significatif (64% des loci) avec un ratio supérieur à 5 par rapport aux SNPs de contrôles.L'analyse bioinformatique suggère que les SNPs identifiés sont essentiels pour la liason de NF-κB. Une étude complémentaire à consisté à perturber le FT SNAI1 probablement associé au gène WNT4 et présentant un rôle important dans les fibroblastes (FB). Cependant, nous n'avons pas été en mesure de reproduire l'effet de SNAI1 sur WNT4 in vivo.Nous avons ensuite comparé les rôles régulateurs de NF-κB et de SNAI1 dans les LCLs et les FBs respectivement (par inactivation de ces gènes). Nous avons observé que NF-κB a un effet régulateurs sur environ 33% des loci dans les LCLs contre seulement 2 % pour SNAI1 dans des FBs.Cette étude supporte l'utilisation de perturbations de l'expression de FT pour étudier le rôle clé de FTs régulateurs dans un type cellulaire donné.

Genetic structure of the white-footed mouse in the context of the emergence of Lyme disease in Southern Quebec

Rogic, Anita January 2013 (has links)
The white-footed mouse (Peromyscus leucopus) has expanded its northern limit into southern Québec over the last few decades. P. leucopus is a great disperser and colonizer and is of particular interest due to its link to human health: it is considered one of the primary reservoirs for the spirochete bacterium that causes Lyme disease in humans. There is no current information on whether the mice are establishing successful populations on the mountains and forest fragments found scattered throughout the Montérégie region, what the genetic flow is between these habitable sites, and whether various landscape barriers (i.e. agricultural fields, highways and main water bodies) have an effect on their dispersal. We conducted a population genetics analysis on 11 populations using 11 microsatellite markers to identify the processes that account for the current level and distribution of their genetic variation. Tick data was collected at each site as well to provide insight on the spread of the disease. Geographic distance had little effect on the overall genetic structure of the populations, but barriers were effective. Agricultural matrices had the weakest barrier effect on dispersal, highways slowed down dispersal but were not absolute barriers, and main rivers were strong dispersal barriers. The abundance of ticks collected on mice varied within the study area and we predicted areas of greater risk for Lyme disease. Our results are pertinent to merge with ongoing Lyme disease surveillance programs in Québec to help determine the future threat of this disease in the province, and to contribute towards disease prevention and management strategies throughout fragmented landscapes in southern Canada. / Au cours des dernières décennies, la souris à pattes blanches (Peromyscus leucopus) a étendu les limites de sa distribution du nord-est des États-Unis vers le sud du Québec. Ce petit mammifère est un excellent migrateur et colonisateur de nouveaux habitats. Cette espèce présente un intérêt tout particulier en matière de santé humaine puisqu'elle est considérée comme l'un des principaux réservoirs de la bactérie causant la maladie de Lyme. À l'heure actuelle, il y a peu de données concernant les populations de souris à pattes blanches en Montérégie, à savoir : a) si elles colonisent avec succès les montagnes et forêts fragmentées réparties à travers cette région; b) s'il existe un flux génétique bas ou élevé entre les populations occupant ces différents sites en Montérégie et finalement, c) si les champs agricoles, les autoroutes et les étendues d'eau agissent en tant que barrières influençant la dispersion des individus entre les habitats. Nous avons effectué une analyse génétique de 11 populations provenant de 11 sites de la région en utilisant 11 séquences microsatellites pour identifier la distribution et le niveau de variation génétique entre ces différentes populations. Des données concernant les tiques ont aussi été recueillies à chacun de ces sites afin d'établir un portrait de la propagation de la maladie de Lyme. Nos résultats confirment que la distance géographique entre les sites a peu de répercussions sur la structure génétique de ces populations contrairement aux barrières. Les champs agricoles montrent les effets les plus faibles sur la dispersion. Les autoroutes ralentissent la dispersion des souris et ne sont donc pas des barrières absolues, contrairement aux rivières qui ont l'impact le plus fort. L'abondance de tiques trouvées sur les souris varie selon les sites étudiés et nous avons pu utiliser ces données afin de prédire les endroits qui constituent un plus grand risque de propagation de la maladie. Nos résultats sont pertinents pour le programme de surveillance de la maladie de Lyme au Québec puisqu'ils aident à déterminer les menaces futures de propagation de la maladie dans la province. Nos conclusions peuvent ainsi contribuer à une meilleure prévention et une gestion stratégique de la maladie de Lyme à travers diverses régions du sud du Canada.

Recovery of PEX1-Gly843Asp associated peroxisome dysfunction by flavonoid compounds in fibroblasts from Zellweger spectrum patients

MacLean, Gillian January 2013 (has links)
Zellweger spectrum disorder (ZSD) is due to defects in any one of 13 PEX proteins, encoded by PEX genes, which are required for peroxisome biogenesis. ZSD features neurologic, hepatic and renal abnormalities; however, one common mutation, PEX1-p.Gly843Asp (G843D), confers a milder phenotype and represents 30% of all ZSD alleles. Thus, identifying treatments for this allele will benefit many patients. We recently showed that PEX1-G843D behaves as a misfolded protein amendable to improved function by chemical and pharmacologic chaperones. In a small molecule screen, we reported recovery of peroxisomal matrix enzyme import by acacetin diacetate, a flavonoid that may bind to the ATP binding site of PEX1-G843D to improve conformation. In order to develop a lead compound from this library 'hit', we evaluated an additional 34 flavonoids for peroxisomal matrix enzyme import recovery using a patient fibroblast cell line hemizygous for PEX1-G843D and expressing a GFP-tagged peroxisome targeting signal (PTS1-GFP reporter). Eight flavonoids were identified as potential pharmacologic chaperones. Based on these compounds, additional flavonoid derivatives were produced and tested to determine the minimal pharmacophore. Relevant functional groups that enhanced or decreased efficacy were identified from these compounds, with diosmetin as the most effective one. These findings will aid in determining structure activity relationships, as knowledge of chemicals that are effective and ineffective will be used to determine the interactions that are important in developing a pharmacophore model. To determine how the flavonoids may be affecting PEX1 and associated proteins, PEX6 and PEX5, subcellular fractions were analyzed by SDS-PAGE and Blue Native PAGE to evaluate protein localization and complex formation. This was first done in wild type and various null cell lines to determine what to expect in normal and diseased states. It was found that PEX1 and PEX6 are dependent on each other and on PEX26 for stable levels and peroxisomal localization, and that PEX5 is dependent on these three proteins for stable levels and cytosolic localization. It was also determined that PEX1 is present in the cytosolic fraction as a monomer and a trimer, and in the peroxisomal fraction as a hexamer and dodecamer. Flavonoid treatment did not appear to affect the localization of PEX1 or PEX6 or complex formation. Thus, we propose that the flavonoids interact with a partially folded population of PEX1 that is already able to interact with PEX6 and localize to the peroxisomal membrane. In addition, we propose that this interaction of protein and drug enhances the residual ATPase activity of the PEX1 complex, thus improving matrix protein import, as observed in the cell-based experiments. / Le trouble du spectre de Zellweger (Zellweger Spectrum Disorder – ZSD) est dû à des defaults dans l'une des treize protéines PEX, codées par les gènes PEX, nécessaires pour la biogenèse des péroxysomes. ZSD a des caractéristiques neurologiques, hépatiques et des anomalies rénales. Cependant, une mutation fréquente, PEX1-p.Gly843Asp (G843D), confère un phénotype moins sévère et représente 30% de l'ensemble des allèles ZSD. Ainsi, l'identification de traitements pour cet allèle sera bénéfique à de nombreux patients. Nous avons récemment montré que PEX1-G843D se comporte comme une protéine mal conformée, dont la fonction peut-être améliorée par des protéines chaperons chimiques ou pharmacologiques. En examinant une série de petites molécules, nous avons observé une amélioration dans l'importation d'enzyme de la matrice du péroxysome par le diacétate d'acacétine, un flavonoïde qui peut interagir avec le site de liaison de l'ATP de PEX1-G843D, afin d'améliorer sa conformation. Afin de développer un composé de base à partir de cette bibliothèque de molécules, nous avons évalué trente-quatre autres flavonoïdes pour l'amélioration de l'importation d'enzyme de la matrice péroxysomale en utilisant une lignée de fibroblastes d'un patient hémizygote pour PEX1-G843D et qui exprime un signal de ciblage péroxysomal GFP (rapporteur PTS1-GFP). Huit flavonoïdes ont été identifiés en tant que protéines chaperons pharmacologiques potentielles. En utilisant ces composés comme base, des dérivés supplémentaires de flavonoïdes ont été produits et testés afin de déterminer le pharmacophore minimal. Les groupes fonctionnels pertinents, qui accroissent ou diminuent l'efficacité, ont été identifiés à partir de ces composés, la diosmétine étant la plus efficace. Ces résultats permettront d'élucider les relations structure-activité, de même qu'une notion des produits importants dans le développement d'un modèle de pharmacophore.Afin de déterminer comment les flavonoïdes pourraient affecter PEX1 et les protéines associées, PEX5 et PEX6, des fractions subcellulaires ont été analysées par SDS-PAGE et PAGE Bleu Natif, pour évaluer la localisation des protéines et la formation de complexe. Ceci fut tout d'abord effectué à l'aide de lignées nulles et de type sauvage, pour avoir une idée des états normaux et pathologiques. Il a été constaté que PEX1 et PEX6 sont dépendantes l'une de l'autre ainsi que de PEX26 pour leur stabilité et une localisation péroxysomale, et que PEX5 est dépendante de ces trois protéines pour sa stabilité et une localisation cytosolique. Il a été déterminé que PEX1 est présente dans la fraction cytosolique à l'état de monomère et de trimère, et dans la fraction péroxysomale à l'état d'hexamère et de dodécamère. Le traitement aux flavonoïdes n'a pas l'air d'avoir un effet sur la localisation de PEX1 et PEX6 ou sur la formation de complexe. Ainsi, nous proposons que les flavonoïdes interagissent avec une population de PEX1 qui a une mauvaise conformation, et qui est capable d'interagir avec PEX6 et de se localiser à la membrane péroxysomale. De plus, nous proposons que cette interaction protéine-composé améliore l'activité ATPase résiduelle du complexe PEX1, améliorant ainsi l'importation de protéines de la matrice, comme observé dans les expériences in vitro.

The role of Lkb1 in preimplantation mouse embryos

Shafik, Marian January 2013 (has links)
LKB1 is a tumor suppressor gene associated with a rare autosomal dominant disorder known as Peutz-Jeghers Syndrome (PJS) which is characterized by the formation of benign gastrointestinal polyps and an increased risk of development of malignant tumors. It has been shown that Lkb1 is involved in various cellular events such cell cycle regulation, cell polarity formation and epithelial morphogenesis, and energy metabolism. The role of Lkb1 in development was examined in Lkb1 KO mice. Interestingly, the homozygous mutant embryos survive up to around E9.5 and die due to vasuclogenesis defects. Although cell polarity and epithelial morphogenesis play important roles in cell allocation and lineage specification in the preimplantation embryos, no clear defect was observed.We hypothesize that lack of early phenotypes in the Lkb1 mutant embryo is because maternal loaded Lkb1 protein and mRNA are sufficient for the embryo to go through the early stages. To test this, we generated maternal/zygotic null Lkb1 embryos using the oocyte specific Cre line, ZP3-Cre (a recombinase enzyme that is active in the oocytes) with the floxed Lkb1 conditional KO mouse line. Interestingly, both maternal/zygotic-deleted homozygous (MZLkb1-/-) embryos and maternal-deleted heterozygous (MLkb1+/-) embryos established epithelial layers at E3.5 and E4.5 with clear apico-basal polarity. Although the first three cell lineages, trophoectoderm, epiblast and primitive endoderm were formed, we found a bias towards a particular cell fate; the PE lineage, at E3.5 in the both MLkb1+/- and MZLkb1-/- embryos.We also found changes in cell allocation and ICM morphology in the blastocyst. We quantified those changes and found that there is an observable spreading of the epiblast and PE tissue in both the MLkb1+/- and MZLkb1-/-) mouse embryos. Taken together, I conclude that Lkb1 does play a role in the early stages of development of the mouse embryos where it affects cell morphology and lineage specification. / LKB1 est un gène suppresseur de tumeur associé à une maladie autosomique dominante rare connue sous le nom de Peutz-Jeghers (PJS). Cette pathologie se caractérise principalement par la formation de polypes bénins gastro-intestinaux et un risque accru de développer des tumeurs malignes.Il a été démontré que LKB1 est impliqué dans divers événements cellulaires tels que la régulation du cycle cellulaire, l'établissement de la polarité cellulaire et la morphogenèse épithéliale ainsi que le métabolisme énergétique. Le rôle de LKB1 dans le développement a été étudié chez les souris KO LKB1. Fait intéressant, les embryons homozygotes mutants survivent jusqu'au jour embryonnaire E9.5 et meurent en raison d'un défaut au niveau de la vasculogenèse. Bien que la polarité cellulaire et la morphogenèse épithéliale jouent des rôles importants dans la répartition des cellules et la spécification du lignage¬ dans les embryons préimplantatoires, aucun défaut évident n'a été observé chez ces souris. Nous émettons l'hypothèse que l'absence de phénotypes précoces chez l'embryon LKB1 mutant est due au fait que l'ARNm et la protéine LKB1 qui sont chargés maternellement sont suffisants pour permettre à l'embryon de passer les premiers stades du développement. Afin de tester cela, nous avons généré des embryons LKB1 nuls maternels/zygotiques. Pour ce faire, nous avons utilisé la ZP3-Cre, une lignée de souris qui exprime la Cre recombinase spécifiquement dans les ovocytes et nous l'avons croisé avec la lignée de souris floxée KO conditionnel LKB1.Fait intéressant, les embryons homozygotes maternels/zygotiques-supprimés (MZLkb1-/-) ainsi que les embryons hétérozygotes maternels-supprimés (MLkb1+ /-) ont mis en place des couches épithéliales à E3.5 et E4.5 avec l'établissement d'une polarité apico-basale claire. Bien que les trois premières lignées de cellules ont été formées, soit le trophectoderme, l'épiblaste et l'endoderme primitif, nous avons observé un biais pour un type de cellules en particulier soit, la lignée PE, à E3.5 chez les embryons MLkb1 +/- et MZLkb1-/-. Nous avons également observé des changements dans la répartition des cellules et la morphologie de la masse cellulaire interne (ICM) dans le blastocyste. Nous avons quantifié ces changements et constaté qu'il y a une propagation observable de l'épiblaste et du tissu PE à la fois chez les embryons de souris MLkb1 +/- et MZLkb1-/-. Dans l'ensemble, nous concluons que LKB1 joue un rôle dans les premiers stades du développement des embryons de souris où il affecte la morphologie des cellules et la spécification du lignage cellulaire.

The role of Pax2 and Gata3 transcription factors in urogenital system development and cancer.

Nguyen, Alana January 2012 (has links)
The complexity of its development makes the urogenital system vulnerable to a number of developmental defects, some of which are associated with a higher susceptibility to malignant transformation. Cancer, as a group of heterogenous disease, poses a serious challenge because of our limited understanding of normal cellular processes. The main focus of my thesis is to understand the link between development of an organ and the process of malignant transformation. Specifically, we examined the role of Pax2 and Gata3 transcription factors in development and cancer of the urogenital system. In the kidney, Pax2 is essential for survival and specification of nephric progenitor cells and is turned off once the tissue has differentiated. We showed that a downstream target of Pax2, CnABP, is overexpressed in Wilms' tumors and promotes cellular characteristics compatible with oncogenic transformation. Unexpectedly, we uncovered a function for CnABP in regulating the Calcineurin signaling pathway, which has also been implicated in Wilms' tumor. The close relationship between Pax2 and Gata3 in the kidney led to the examination of their roles in the prostate, an organ site also highly susceptible to malignancy. The strong implication in the literature for the role of Gata3 in prostate cancer led to the discovery that this transcription factor plays an essential role during all stages of prostate development as well as maintenance of the adult gland. Importantly, we established that Gata3 is lost during prostate tumor progression in both human and mouse. By enforcing the expression of GATA3 in a mouse prostate tumor model, we demonstrated that GATA3 mutually antagonizes the PI3K/Akt signaling pathway to impede Pten-loss mediated tumor progression. Critically, the role of Gata3 in prostate cancer is compatible with its function in the normal context, in regulating terminal differentiation and integrity of ductal structure.From this work, we conclude that the inappropriate expression of developmental regulators can be conducive to malignant transformation. Thus, there is a great deal to be learned from development that can be applied to tumor biology. Ultimately, the aim of our research is to improve understanding of normal versus diseased states with the ultimate goal of discovering new diagnostic and therapeutic tools that are currently unavailable to cancer patients. / Les principales fonctions de l'appareil urogénital sont le maintien de l'homéostasie ainsi que la reproduction, ce qui est essentiel à la fois à l'organisme et à la survie de l'espèce. Par sa complexité, le développement de l'appareil urogénital est vulnérable à plusieurs anomalies, certaines étant associées à une prédisposition plus élevée au cancer. Résultant d'une série d'affections hétérogènes, le cancer demeure un défit sérieux dû à notre connaissance limitée des processus cellulaires normaux. Les travaux décrits dans la présente thèse concernent l'étude du lien entre le développement d'un tissue et son mécanisme de transformation oncogénique. Plus précisément, nous nous sommes concentrés sur deux facteurs de transcription nécessaires au développement de l'appareil urogénital, Pax2 et Gata3, ainsi que leur rôle dans le contexte du cancer du rein et le cancer de la prostate.En ce qui attrait au cancer du rein, nous avons démontré qu'une cible en aval de Pax2, CnABP, est surexprimé chez la tumeur de Wilms et semble à l'origine de diverses caractéristiques cellulaires liées au développement de tumeurs. Nous avons découvert une fonction de CnABP dans la régulation de la voie de signalisation de Calcineurine, elle-même associée à la tumeur de Wilms. Dans la même étude d'expression génique par puces à ADN qui permit d'établir un lien entre Pax2 et la cible CnABP, nous avons identifié une cible additionnelle, le facteur de transcription Gata3. Il est intéressant de remarquer que Pax2 et Gata3 sont tous deux exprimés dans la prostate, le site de développement de tumeurs solides le plus fréquent parmi l'appareil urogénital. Par des études additionnelles, nous avons démontré que Gata3 est nécessaire au développement ainsi que l'homéostase de la prostate adulte. Fait à noter, l'expression de Gata3 se trouve réduite suivant la progression de tumeurs de la prostate aussi bien chez l'humain que chez la souris. Une fois l'expression de Gata3 soutenue dans un model murin de cancer de la prostate, nous avons observé que Gata3 peut contrer la voie de signalisation PI3K/Akt afin d'entraver la progression de tumeurs médiée par la perte de Pten. Nos résultats démontrent que le rôle de Gata3 dans le cancer de la prostate est compatible avec sa fonction dans le contexte normal, dont la régulation de la différentiation terminale et maintien de l'intégrité des structures canalaires.En somme, les travaux présentés dans cette thèse nous permettent de conclure que les anomalies dans l'expression de facteurs de régulation du développement peuvent favoriser la transformation oncogénique de cellules normales. En conséquence, chacun de ces facteurs représente une opportunité de choix vers de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques contre le cancer.

Patterns of diversification in neotropical butterflies

Arias Mejia, Carlos January 2013 (has links)
The Tropical Andes is one of the most biodiverse regions in the world, yet the origin of this diversity remains poorly understood. One long-standing hypothesis proposes that diversification occurred due to vicariance and allopatry in Pleistocene forest refuges. In contrast, recent studies suggest that the uplift of the Andes, during the Miocene-Pliocene boundary, provided opportunities for both allopatric and ecological speciation. In the present study I tested these hypotheses as well as other process (i.e. center of origin vs center of accumulation hypotheses) that might explain current patterns of neotropical diversity. In particular, I used population genetic tools, ecological data and species-level phylogenetic information to address questions about the underlying causes of diversification in two different groups of neotropical mimetic butterflies: Heliconius cydno and the two Ithomiinae genera Hyalyris and Hypothyris. My results support a complex model of diversification extremely entwined with the final uplift of the Andes. In both cases (Hyalryis-Hypothyris and H. cydno), colonization of the Andes slopes was accompanied by mimicry shifts. Moreover, in the case of Hyalryis there was a strong correlation between altitudinal switches and color pattern shifts. Thus, strong ecological isolation, driven by locally adaptive differences in mimetic wing patterns and habitat use, played an important role in promoting divergence. In general, my results support the idea that speciation is a cumulative process, where the combination of multiple isolation barriers with major phenotypic and ecological difference, facilitates population divergence despite gene flow. / Les Andes Tropicales forment une des régions du monde présentant la plus grande biodiversité, mais l'origine de cette biodiversité reste peu connue. Depuis longtemps, une des hypothèses proposées pour l'expliquer suggère que la diversification eut lieu par vicariance et allopatrie dans les refuges forestiers du Pléistocène. Cependant, d'autres études récentes suggèrent que la surrection l'élévation des Andes, entre le Miocène et le Pliocène, a créé les conditions favorables à une spéciation aussi bien allopatrique que écologique. Dans cette étude, j'ai testé ces hypothèses ainsi que d'autres processus (par exemple l'hypothèse du centre d'origine vs. l'hypothèse du centre d'accumulation) qui pourraient expliquer les patrons actuels de diversité tropicale. Plus précisément, j'ai utilisé une approche combinant des outils génétiques, des données écologiques et des informations phylogénétiques au niveau des espèces pour répondre aux questions concernant les causes de la diversification dans deux groupes différents de papillons mimétiques néotropicaux: Heliconius cydno et les deux genres d'Ithomiinae, Hyalyris et Hypothyris. Les résultats de mes travaux appuient un modèle de diversification complexe étroitement lié à l'élévation finale des Andes. Dans les deux cas (Hyalryis-Hypothyris et H. cydno), la colonisation des flancs des Andes a été accompagnée d'un changement de mimétisme. En outre, dans le cas des Hyalryis il y a eu une forte corrélation entre les variations d'altitude et les changements dans les patrons de couleur. Ainsi, le fort isolement écologique, induit par des différences adaptatives locales dans les patrons mimétiques des ailes, joue un rôle important dans l'apparition de la divergence. D'une façon générale, mes résultats soutiennent l'idée selon laquelle la spéciation est un processus cumulatif, où la combinaison de plusieurs barrières d'isolement avec des différences phénotypiques importantes rend possible la divergence des populations malgré le flux génétique.

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