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Detecting genetic variants in radiation-induced lung disease

Paun, Mihaela January 2013 (has links)
Thoracic radiotherapy, a common treatment modality for thoracic cancers, has pulmonary side-effects of either excessive inflammation (alveolitis), or pulmonary fibrosis consisting of uncontrolled deposition of collagen in the lungs, for which no cure exists. Prior knowledge, before radiotherapy, of patients genetically predisposed to fibrosis would improve cancer treatments. Based on the known similarities between human and mouse responses to lung irradiation, we used a murine model to detect molecular pathways, immune mechanisms and genetic variants associated with the development of fibrosis. Through a gene expression study in the lungs of fibrosis-prone C57Bl/6J and alveolitis-prone A/J and C3H/HeJ mice we found that several inflammatory pathways are significantly altered and differentiate between alveolitis- and fibrosis-prone mice and that Cell Adhesion Molecule signaling is the most significantly perturbed pathway in all strains. The differences in fibrosis between inbred mice led us to perform a genome-wide association analysis in a panel of 27 strains. We found several variants in immune genes associated with fibrosis, among which several SNPs upstream of Cell adhesion molecule 1 (Cadm1), a promising potential candidate gene for susceptibility to fibrosis. The role of immunity in lung disease prompted the investigation of mice lacking Tlr2 and/or Tlr4 receptors in response to thoracic irradiation. While Tlr2-/- and Tlr4-/- mice did not differ from C57Bl/6J wildtype, Tlr2,4-/- mice have decreased survival and more severe fibrosis compared to irradiated wildtype animals. Subsequent analyses of lymphocytes infiltrating the lungs after thoracic irradiation revealed the more severe fibrosis in the Tlr2,4-/- strain to be due to increased production of Il6, Tgfβ and Il17 and lack of protective Ifnγ. These studies also showed the pro-fibrotic role of Il17, as Il17-/- mice do not develop the disease. To summarize, in this thesis we identified immune pathways and several candidate genes associated with the presence of fibrosis following thoracic radiation. We also showed that disease development is dictated, in part, by Tlr signaling and disequilibrium between pro- and anti-fibrotic cytokines. / La radiothérapie thoracique, un traitement commun pour les cancers de la cavité thoracique, a des effets secondaires au niveau des poumons: l'inflammation excessive (alvéolite) ou la fibrose pulmonaire qui consiste d'un dépôt incontrôlable de collagène dans les poumons, et pour laquelle aucun traitement n'existe. La connaissance a priori, avant l'administration de la radiothérapie, des patients susceptibles au développement de la fibrose, améliorerait considérablement les traitements du cancer. Étant données les similarités des réponses à la radiation entre l'homme et la souris, nous avons utilisé un modèle murin pour la détection des voies moléculaires, mécanismes immunitaires et des variantes génétiques associés avec le développement de la fibrose pulmonaire. A travers une étude d'expression des gènes sur les poumons des souris susceptibles à la fibrose, C57Bl/6J et à l'alvéolite, A/J and C3H/HeJ, nous avons identifié certaines voies inflammatoires significativement impactées par le traitement et différentient entre les souches susceptibles à la fibrose, et celles succombant à l'alvéolite. Parmi celles-ci, la voie de Signalisation des Molécules d'Adhésion Cellulaire est la plus perturbée dans toutes les souches. Pour déterminer la composante génétique qui détermine les différences en degré de fibrose parmi les souches des souris consanguines, nous avons fait une analyse d'association pan-génomique sur un groupe de 27 souches de souris. Nous avons identifiés plusieurs variants associés à la fibrose, situés dans des gènes immunitaires, parmi lesquels, plusieurs SNPs dans le gène Cadm1 (Cell Adhesion Molecule 1). Étant donné le rôle de l'immunité dans la maladie pulmonaire, nous avons testé la réponse des souris manquant les récepteurs Tlr2 et/ou Tlr4 à la radiation thoracique. Tandis que les souris Tlr2-/- et Tlr4-/- ne diffèrent pas dans leur phénotype de la souche sauvage C57Bl/6J, les souris Tlr2,4-/- succombent plus tôt, a une fibrose plus sévère que les souris sauvages. Des analyses ultérieures sur les lymphocytes qui s'infiltrent dans les poumons à la suite de la radiation, ont démontré que la fibrose plus sévère chez les souris Tlr2,4-/- est due à une production augmentée des cytokines Il6, Il17 et Tgfβ et à l'absence du Ifnγ qui a un rôle protecteur. Ces études ont aussi montré le rôle pro-fibrotique du Il17, étant donné que les souris Il17-/- ne développent pas la maladie. Pour conclure, dans cette thèse nous avons identifié des voies de signalisation immunitaires et plusieurs gènes candidats associés avec la présence de la fibrose suivant la radiation thoracique. Nous avons aussi montré que le développement de la maladie est dicté, en partie, par la voie de signalisation des récepteurs Tlr et aussi par un déséquilibre entre les cytokines pro- et anti-fibrotiques.
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Functional characterization of wheat, fusarium head blight resistance (QTL) «Fhb1» based on non-target metabolomics and proteomics

Gunnaiah, Raghavendra January 2013 (has links)
Fusarium head blight (FHB) caused by Fusarium graminearum is a dreadful disease of wheat (Triticum aestivum L.). Host resistance to FHB in wheat is quantitatively inherited. Though more than 100 QTLs have been identified, only a few have been validated. However, the resistance mechanisms governed by these QTLs are poorly understood. A type II FHB resistance QTL Fhb1 is the most consistent and largest effect QTL in wheat against FHB spread in wheat. Non-targeted metabolic and proteomic profiling of wheat near isogenic lines (NILs) with resistant and susceptible Fhb1 alleles was used to functionally characterize Fhb1 using a high resolution LC-MS. The Fhb1 from a moderately resistant cultivar Nyubai was associated with cell wall thickening, mainly at the rachis, due to deposition of hydroxycinnamic acid amides (HCAAs), phenolic glucosides and flavonoids. A hypothetical protein coding gene (GenBank: CBH32656.1) near Fhb1 locus was putatively identified as hydroxycinnamoyl transferase, which catalyzes the biosynthesis of HCAAs. Deoxynivalenol (DON) accumulation was high in both the NILs, eliminating DON detoxification as a mechanism associated with Fhb1 (Chapter III). For additional confirmation, the Fhb1 resistant allele, from a highly FHB resistant cultivar Sumai-3 was profiled. Even though the DON accumulation was low in resistant NIL, the detoxification of DON by host UDP-glycosyltransferase was moderately high in both the NILs, with no significant difference. Interestingly, unlike in the resistant NIL, constitutively present glycerophospholipids were absent in the susceptible NIL following pathogen inoculation due to degradation of membrane. Membrane degradation was caused due to programmed cell death as evidenced by DNA laddering in the susceptible NIL. A locus TAA_ctg0954b.00390.1 was identified as an Fhb1 candidate gene that contains a calmodulin binding motif and two nucleolar localization signal motifs and hence re-annotated as calmodulin binding protein (TaCaMBP_Fhb1). The TaCaMBP_Fhb1 is induced following pathogen infection, binds to Ca2+ bound calmodulin, and triggers Ca2+ signalling cascade including transcriptional activation of endonucleases that cleaves the genomics DNA and cause programmed cell death. The resistant allele of TaCaMBP_Fhb1 lacks part of the promoter region and is non-functional in triggering Ca2+ signalling. While the susceptible allele of TaCaMBP_Fhb1, with functional promoter region is capable of triggering Ca2+ signalling and programmed cell death. The necrotrophic pathogen F. graminearum feeds on the dead tissue, multiply in the host and produce more DON, following a repeated cycle in the susceptible genotype (Chapter IV). The wheat resistance mechanisms against FHB were further confirmed, based on metabolic profiling of rachis, from a resistant cultivar Sumai-3 and a susceptible cultivar Roblin, for resistance against spread of a trichothecene producing (Wild: FgTri5+) and a trichothecene non- producing (mutant: FgTri5-) isolates of F. graminearum. The wild isolate repressed several host resistance mechanisms in both the cultivars due to production of DON. The FHB resistance to spread in Sumai-3 was mainly because of increased cell wall thickening, especially at rachis, due to deposition of lignin, HCAAs and flavonoids, and partially, due to induced RR metabolites which in turn reduced the fungal biomass and toxin biosynthesis. The resistance was not attributed to DON detoxification by UDP-glycosyltransferase, as it was not significant in both the cultivars confirming our previous studies (Chapter V). The resistant alleles of two Fhb1 candidate genes, identified in this study, can be suitably stacked into genome of elite cultivars to enhance FHB resistance in wheat. / La fusariose de l'épi est une maladie fongique attaquant le blé (Triticum aestivum) induite par Fusarium graminearum. La fusariose cause de sévères pertes économiques dues à la réduction de la qualité et des rendements suite à la contamination par les mycotoxines trichothecene. La résistance du blé face à la fusariose est un trait quantitatif. Plus de 100 LCQ on été identifiés et un petit nombre a été validé. Cependant, les mécanismes de résistance gouvernés par ces LCQ sont peu connus. Fhb1 est le LCQ le plus consistent qui produit le plus grand effet face à la fusariose du blé. Une caractérisation fonctionnelle à l'aide d'un LC-MS à haute résolution de lignées isogéniques avec ou sans l'allèle susceptible Fhb1 a générée des profils de métabolites non ciblés ainsi que protéomique. Le Fhb1 d'un cultivar modérément résistant, Nyubai, a été associé avec le développement de la paroi cellulaire plus épaisse, surtout au niveau du rachis due à la déposition d'acides amides hydroxycinnamic (HCAAs), de glucosides phénolique ainsi que de flavonoïdes. Le gène codant pour une protéine hypothétique (GenBank: CBH32656.1) située près du locus Fhb1 a été identifiée comme étant possiblement une hydroxycinnamoyle transférase. Cette protéine déclencherait la biosynthèse de HCAAs. L'accumulation de DON a été plus élevée dans les deux lignes isogéniques. La détoxification de DON est un mécanisme associé avec Fhb1 (Chapitre III). Pour confirmer, l'allèle Fhb1 la résistance du cultivar Sumai-3 a été profilé. Contrairement aux lignes iso géniques, aucune présence constitutive de glycérophospholipides, n'a été détectée chez les lignées susceptibles en raison de la dégradation des membranes. La dégradation de membrane s'est avérée être causée par la mort cellulaire programmée comme le démontre le patron de dégradation de l'ADN de la variété susceptible NIL. Le locus TAA_ctg0954b.00390.1 fut identifié comme candidat pour le gène Fhb1 qui contient un domaine de liaison à la calmoduline et deux signaux de localisation nucléaire. Ce dernier fut donc annoté en tant que protéine de liaison à la calmoduline (TaCaMBP_Fhb1). TaCaMBP_Fhb1 est induit suite à l'infection du pathogène pour ensuite se lier à la calmoduline liée au Ca2+ pour ensuite initier une cascade de signaux qui inclut l'activation transcriptionnelle d'endonucléases qui clivent l'ADN génomique causant ainsi la mort cellulaire programmée. L'allèle résistante de TaCaMBP_Fhb1 présente une délétion au niveau du promoteur ce qui la rend non fonctionnel pour l'activation du signalement Ca2+ impliqué dans la mort cellulaire programmée. Le pathogène nécrotrophe F. graminearum se nourrit des tissus morts, se multiplie et produit plus de DON pour faciliter l'infection; perpétuant ainsi un cercle vicieux chez le génotype susceptible (Chapitre IV). C'est résultats on été confirmés à l'aide d'un profilage métabolique des rachis de la lignée résistante Sumai-3 et la lignée susceptible Roblin lors de l'infection avec (Wild : FgTri5+) trichothécène producteur et (Mutant :FgTri5- ) trichothécène non producteur qui sont deux isolats de F. graminearum. L'isolat producteur est parveu à inhiber plusieurs mécanismes de résistance de l'hôte dans les deux cultivars grâce à la production de DON. La résistance FHB à l'infection dans Sumai-3 était principalement lié à l'augmentation des parois cellulaires particulièrement au niveau des rachis à cause de la déposition de lignine, HCAAs et de flavonoïdes et partiellement due à l'augmentation des métabolite RR qui réduisent la biomasses des champignons ainsi que la synthèse des toxines. La résistance n'a pas été attribuée à détoxification de DON par l'UDP-glycosyltransferase, puisque les résultats étaient similaires dans les deux cultivars (Chapitre V). Les allèles résistants, des deux gènes candidats Fhb1 identifiés dans cette étude, pourraient-être ajoutés au génome de cultivars élites de blé pour augmenter leur résistance au FHB.
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Characterization of the «Smpec» Knock-out mouse

Aljebali, Latifa January 2013 (has links)
The Smpec gene is expressed solely in the chondrocytes at the resting and proliferating zones but not in the hypertrophic chondrocytes. The SMPEC protein is a chondroitin sulfate proteoglycan (CS PG) composed of 121 amino acids. In silico analysis suggests it is a transmembrane protein. The purpose of this study was to characterize the Smpec knockout (KO) mouse and identify its role in skeletogenesis in vivo. To confirm the suggested topology for the SMPEC protein, immunofluorescence (IF) was performed on 4 days post natal (P4) distal femur. The protein was localized to the cell surface of resting and proliferating chondrocytes, but also accumulated in intercolumnar septum of hypertrophic chondrocytes, suggesting its shed. Alcian blue /alizarin red staining, which stains cartilage and bone respectively, was performed on arms of P4 wild-type (WT) and KO mice and there were no qualitative differences in staining intensity neither in bone nor in cartilage of KO compared to WT. However, quantitative measurement indicated that the humeri were all statistically reduced in length by 10.4% in the KO compared to the WT. As it is wellknown that the longitudinal growth of long bones is mediated through the growth plate, thereby we focused our study on this region. Safranin O/Fast green staining in P4 distal femur revealed that the chondrocyte cell density of the resting and proliferating zones appeared less in the KO than in WT littermates. Quantitative analysis confirmed the hypocellularity of these zones. However, the thickness of the hypertrophic zone was normal. The expression profile of genes known to be important in skeletogenesis and mineralization was assessed by real-time qPCR. No statistically significant changes were detected in the Smpec KO as compared to WT at the three ages analyzed (day 4, day 28 and12 months). Similarly, primary chondrocytes cultures established from KO and WT rib cages, did not present any significant changes in expression of Col2a1, Col10a1, Sox9, and Acan. Furthermore, in such cultures, extracellular matrix deposition of proteoglycanaggrecan as assessed by alcian blue staining, was not significantly altered, indicating similarity in the metabolic activity of the chondrocytes. This indicates for the first time that loss of Smpec results in mild dwarfism in mice and that its function cannot be compensated by other genes at least at neonatal ages. The mechanism by which the lack of SMPEC causes dwarfism is still unclear. / Le gène Smpec est exprimé uniquement dans les chondrocytes de la plaque de croissance à l'exception de la zone hypertrophiée. La protéine SMPEC est une protéoglycane contenant de la chondroïtine sulfate (CS PG) et composée de 121 acides aminés. Une analyse in silico indique qu'il s'agit d'une protéine transmembranaire. Le but de cette étude était de caractériser le phénotype d'un modèle de souris dont le gène Smpec a été inactivé (KO), en particulier l'effet sur la formation du squelette. Pour confirmer la topologie proposée pour SMPEC, elle a été localisée par immunofluorescence (IF) sur des fémurs au jour 4 postnatal (P4). La protéine est présente à la surface de la cellule dans la zone superficielle et la zone de prolifération. Par contre, elle s'accumule aussi dans la matrice extracellulaire de la zone hypertrophiée, entre les colonnes de chondrocytes. Ce résultat suggère que le domaine extracellulaire est coupé et libéré dans la matrice à la zone de transition. Une coloration avec le bleu alcian et l'alizarine rouge, a été réalisée pour visualiser le cartilage et l'os dans les humérus au jour 4 postnatal. Aucune différence qualitative dans l'intensité de la coloration, ni dans les os ni dans le cartilage n'a été détectée dans la souris KO par rapport à la souris sauvage. Cependant, une mesure quantitative a révélé que plusieurs parametres osseux sont significativement diminues dans le KO, entre autre la longueur totale qui est reduite de 10.4% par rapport a la souri sauvage. Étant donné que la plaque de croissance est responsable de la croissance longitudinale des os longs, nous avons ensuite plus spécifiquement investigué cette région. Une coloration avec la safranine O a permis de révéler la densité cellulaire dans les zones superficielle et de prolifération était diminuée dans la souris mutante. Cependant, l'épaisseur de la zone de chondrocytes hypertrophiés est demeurée inchangée. Le profil d'expression de plusieurs gènes connus pour être importants dans squelettogenèse et la minéralisation est aussi restée inchangée dans les plaques de croissance isolées à partir des femurs in vivo, et dans les cultures de chondrocytes in vitro. Aussi, les depots de proteoglycan aggrecan dans la matrice extracellulaire in vitro n'a pas été modifiée indiquant la similitude de l'activité métabolique des chondrocytes KO et sauvages. Ceci indique pour la première fois que la perte de fonction du gène Smpec in vivo cause un nanisme léger, mais que le mécanisme en cause demeure indéterminé.
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Functional studies of PARK2/PACRG leprosy susceptibility factor

Bouka, Aimée-Angélique January 2013 (has links)
Leprosy is a chronic human infectious disease that is caused by Mycobacterium leprae, a slow growing intracellular parasite mostly of macrophages and Schwann cells. In 2010, there were an estimated 228,474 new cases worldwide. Research conducted for decades has strongly suggested that genetic factors participate in host susceptibility to leprosy. Employing a positional cloning approach, the Schurr group had identified genetic variants in the shared PARK2/PACRG promoter region as major leprosy susceptibility factors. Specifically, it was possible to identify two PARK2 promoter allelic combinations that were strongly associated with leprosy susceptibility. The reference allelic combination that was not associated with leprosy was considered a "resistant" combination while the one which was associated with leprosy (OR = 5.28; CI 95% = 2.06–13.55) was considered a leprosy "susceptible" allelic combination. Using two strains of transgenic mice carrying a human PARK2 promoter overlapping the leprosy risk factors fused to a firefly gene reporter, we studied the activity of the human PARK2 promoter and the leprosy susceptibility alleles in mice. We found a tissue distribution of the reporter construct in mice that was consistent with the expression of PARK2 in human organs. However, we also noted that the transgenes had poor correlation with endogenous mouse Park2 expression. Unexpectedly, pPARK2/FLuc transgenes were down-regulated in the spleen of mice following BCG and S. Typhimurium infection. Likewise, endogenous mouse Park2 expression was repressed in the spleen by BCG and S. Typhimurium infection as well as by LPS exposure. We did not detect consistent differential allelic expression of the two pPARK2/FLuc transgenes. Parkin expression was modulated in the spleen by immune stimulation. This finding added a new element supporting the hypothesis of Parkin being a host defense protein. The transgenic mouse model did not provide data that supported a direct role of the human leprosy susceptibility factors in PARK2 expression levels. / La lèpre est une maladie chronique infectieuse affectant les êtres humains. Elle est causée par Mycobacterium leprae, un parasite intracellulaire à croissance lente ayant un tropisme pour macrophages et les cellules de Schwann. En 2010, il y eu environ 228.474 nouveaux cas de lèpre diagnostiqués dans le monde entier. Des recherches menées depuis des décennies ont fortement suggéré que des facteurs génétiques de l'hôte contribuent fortement à la susceptibilité à la lèpre. Utilisant une approche de clonage positionnel, le groupe Schurr a identifié des polymorphismes génétiques dans la région promotrice partagée par les gènes PARK2 et PACRG comme facteurs prédisposant à la lèpre. Plus précisément, il a été possible d'identifier deux combinaisons alléliques principales localisées dans le promoteur du gène PARK2 qui étaient statistiquement associées à la lèpre. La combinaison allélique sans association à la lèpre était considérée comme étant la combinaison conférant une «résistance» contre la lèpre tandis que celle qui a été associée à la maladie (OR = 5,28, IC 95% = 2,06 à 13,55) a été considéré comme étant la combinaison conférant "susceptibilité" à la maladie. En utilisant deux souches de souris transgéniques contenant un promoteur humain du gène PARK2 ainsi que les facteurs de risque pour la lèpre fusionné avec un gène rapporteur codant pour la luciférase, nous avons étudié l'impact des deux combinaisons alléliques liées à la lèpre sur l'activité du promoteur humainPARK2. Il a été déterminé que l'expression du rapporteur chez la souris en terme de distribution tissulaire est comparable à l'expression de PARK2 chez l'homme, mais que l'expression des transgènes a une faible corrélation avec l'expression de Park2 endogène chez la souris. En outre, les transgènes pPARK2/FLuc sont régulés à la baisse dans la rate par lors d'une infection avec BCG et S. Typhimurium. De plus, l'expression endogène de Park2 chez la souris est réprimée dans la rate par l'infection au BCG et à la S. Typhimurium ainsi que l'exposition au LPS. Enfin, nous avons pu conclure qu'il n'y a pas d'expression différentielle stable entre les deux allèles du transgène pPARK2/FLuc. L'expression de Parkin est modulée dans la rate par la stimulation immunitaire. Cette observation ajoute un nouvel élément qui soutient que PARK2 appartient au mécanisme de défense de l'hôte. Nos lignées de souris transgéniques n'ont pas apporté de résultats prouvant l'impact des facteurs de susceptibilité de la lèpre sur l'expression différentielle du promoteur PARK2.
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GFP-based screen for meiotic mutants in «C. elegans»

Nolis, Thomas January 2009 (has links)
Meiosis causes the reduction of diploid cells into haploid gametes playing a significant role in all sexually reproducing organisms. The progression of meiosis can be broken down into two stages: meiosis-I and meiosis-II. In meiosis-I, homologous chromosomal segregation results in the formation of a chiasma – a secure connection between homologs. Establishing a chiasma requires three major landmarks between homologous chromosomes: recognition and alignment, synapsis, and recombination. A defect in any one of these key events can cause chromosomal non-disjunction or cell aneuploidy. The nematode Caenorhabditis elegans has many attributes that make it a well-suited model for studying various aspects of meiosis. The germ-line nuclei mature in a spatiotemporal manner, and the nuclei are easily distinguishable, during their progression of meiotic prophase-I, through DAPI staining. Should a mutation impair homologous chromosomal segregation of the X-chromosome the progeny of the animal will bear a visibly higher percentage of males, presenting a 'High Incidence of Males', or a 'Him', phenotype. The goal of this study is to screen, identify, and isolate more Him mutations by building on the screen "Green Eggs and Him". Nineteen Him mutants have been isolated, and 17 studied, in this project. DAPI staining has allowed the categorization of the mutants into: cell cycle, pairing, synapsis, or recombination defective mutants. Measuring autosomal and X-chromosome non-disjunction levels have allowed for an additional severity-level categorization for each of the seventeen mutations found. 4 mutations were found to be severe, 3 as severe/moderate, 2 moderate, 4 as moderate/low, and 4 were categorized as low-severity mutations. 9 of the 17 mutations were determined as having recombination deficiencies; 5 as pairing/synapsis defects – where the deficiency could be in just one of the processes, or compounded in both; / La méiose cause une réduction de chromosomes diploïdes dans les gamètes qui sont haploïde, jouant un rôle significatif dans tous organismes qui se reproduisent sexuellement. La progression de méiose peut être séparée en deux étapes : méiose-I et méiose-II. En méiose-I, la ségrégation chromosomique des homologues a pour résultat la formation d'un chiasma – une connexion assurée entre homologues. Etablir un chiasma exige trois événements majeures entre les chromosomes homologues : la reconnaissance et l'alignement, le synapse, et la recombinaison. Un défaut dans n'importe lequel de ces événements clés peuvent causer la non-disjonction des chromosomes ou l'aneuploïdie de la cellule.Le nématode Caenorhabditis elegans a beaucoup d'attributs qui le favorise comme un modèle pour étudier des aspects divers de la méiose. Les noyaux des cellules germinales mûrissent d'une manière spatiotemporale, et les noyaux sont facilement identifiables pendant la progression de prophase-I avec un traitement DAPI. Si une mutation diminue la ségrégation des homologues du chromosome X, la progéniture de l'animal comptera un pourcentage élevé de mâles, présentant un phénotype « Lui ».L'objectif de cette étude est de trier, identifier, et isoler des mutations « Lui » avec le criblage « Oeufs Verts et Lui ». Dix-neuf mutants « Lui » ont été isolé, et dix-sept étudié, dans ce projet. Le traitement avec DAPI a permis la catégorisation des défauts des mutants dans une des catégories suivantes: le cycle cellulaire, l'union des homologues, le synapse, ou la recombination. La mesure des taux de non-disjonction des autosomes comparé à celui pour le chromosome X a permis une catégorisation supplémentaire des dix-sept mutations par rapport à leur sévérité. Quatre mutations sont sévères, trois sont sévères à modérées, deux sont modérées, quatre sont modérées à fa
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Elucidation of the functional consequences of «NLRP7» mutations

Bukhari, Ebtihaj January 2009 (has links)
Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by the absence of, or abnormal, embryonic development and hydropic degeneration of the chorionic villi. In both Canada and the United States, the incidence of HM is 1 in every 1000 pregnancies. Recently, NLRP7 has been found to be responsible for recurrent hydatidiform moles (RHM) after the identification of various mutations in this gene. To investigate the functional consequences of NLRP7 mutations on IL-1β maturation and secretion, I used site-directed mutagenesis to introduce the various mutations found in patients with RHM into WT-NLRP7. HEK293 cell lines were cotransfected with WT-NLRP7, procaspase-1, and pro-IL-1β, as well as with or without Cardinal (CARD-8.). My results demonstrate that WT-NLRP7 inhibits IL-1β secretion in a dose-dependent manner. Furthermore, I found that Cardinal (CARD8), an important component of other inflammasomes, has no impact on the inhibitory effect of WT-NLRP7. My findings strengthen the idea that NLRP7 may function as a feedback regulator of IL-1β secretion. / Une môle hydatidiform (MH) est une anomalie de la grossesse caractérisée par soit l'absence de l'embryo ou du développement embryonnaire ainsi que la dégénérescence des villosités choriales. Au Canada et aux États-Unis, l'incidence des MH est 1 sur 1000 naissances. Récemment, NLRP7 a été trouvé responsable des môles hydatidiform à répétition, après l'identification de différentes mutations dans le gène. Pour étudier les conséquences fonctionnelles des mutations de NLRP7 sur la maturation et la sécrétion de IL-1β, j'ai utilisé le site de mutagenèse dirigée pour introduire les différentes mutations trouvées chez les patientes atteintes de môles recurrentes. Des cellules HEK293 ont été cotransfectées avec la copie normale de WT-NLRP7, procaspase-1, pro-IL-1β, avec et sans Cardinal (CARD-8.). Mes résultats démontrent que WT-NLRP7 inhibe la sécrétion de IL-1β d'une manière dose-dépendante. De plus, j'ai trouvé que Cardinal (CARD8), une composante importante d'autres inflammasomes, n'a pas d'effet sur l'inhibition de WT-NLRP7. Mes constatations renforcent l'idée que NLRP7 peut fonctionner comme un régulateur de la sécrétion de l'IL-1β.
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Characterization of transcript isoform variations in human and chimpanzee

Benovoy, David January 2009 (has links)
Transcript expression and pre-mRNA processing are emerging as important mechanisms that increase the complexity of eukaryotic transcriptomes. These processes allow a genomic locus to produce a number of mRNAs and proteins with distinct properties that affect function, stability, and sub-cellular localization by controlling the rate of transcript expression, by varying the initiation or termination of transcription and by modulating the inclusion of exons (alternative splicing) in mature mRNAs. Thus, it is crucial to determine the extent of these types of variations to better understand their importance in creating organism diversity. The studies described in this thesis provide the first genome-wide estimations of how single nucleotide polymorphisms (SNPs) affect the regulation of transcript expression and pre-mRNA processing in a human population as well as between humans and chimpanzees using a microarray-based approach. We first demonstrated that transcript expression changes at the isoform level are common between two unrelated individuals and that these changes are heritable and therefore have an underlying genetic component. We then investigated what proportion was under genetic control in a normal human population by conducting a genome-wide association analysis between single nucleotide polymorphisms and transcript isoform variants. We found that 50-55% of transcript expression variation is isoform based. We also extended our comparison of human transcript isoform variation to chimpanzee. We showed that genetic substitutions in regulatory sequences are responsible for some of the isoform variations observed between these two closely related species. We ascertained that in our study these isoform variations are responsible for certain phenotypic differences mostly related to immune responses. These results constitute an important change in the way genetic variations are viewed in humans and chimpa / Le niveau d'expression d'un transcrit et les processus de maturation de celui-ci en ARN messager (ARNm) se révèlent être des mécanismes augmentant la complexité du transcriptome des eucaryotes. Ces processus permettent au même locus génomique de produire plusieurs ARNm et protéines ayant des propriétés distinctes qui affectent leurs fonctions, leur stabilité et leurs localisations intra cellulaire en contrôlant la vitesse de transcription, en variant le site d'initiation ou de terminaison de la transcription et en modulant l'inclusion d'exons (épissage) dans les ARNm matures. Il est donc primordial de déterminer l'ampleur de ces types de variations afin de mieux comprendre leur impact sur la diversite des oraganismes. Les études décrites dans cette thèse fournissent les premières estimations de la façon dont les variations de polymorphism nucléotidique simple (SNP) peuvent affecter la régulation de l'expression d'un transcrit et ses processus de maturation à l'échelle du génome entier. Ces processus sont examinés dans une population humaine et entre humain et chimpanzé en utilisant une méthode basée sur les puces à ADN. Nous démontrons d'abord l'existence d'un nombre important de variations d'isoformes d'ARNm entre deux individus non apparentés et nous démontrons que ces variations sont héritées ce qui leur révèle une composante génétique. Par la suite, nous avons déterminé quelle proportion et quel type de variation au niveau de l'isoform était sous contrôle génétique dans une population humaine. En réalisant une analyse d'association entre l'expression des transcrits du génome entier et les SNPs présents dans cette population, nous avons observé que 50-55% de la variation était à l'échelle de l'isoforme du transcrit. Nous avons aussi étendu cette comparaison au chimpanzé en utilisant les profils d'expression mesurés lors de l'analyse précédente. N
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Biological effects and genetic analysis of thermosensitivity in hypertension

Malo, Danielle January 1989 (has links)
Acute heat exposure is more lethal to spontaneously hypertensive mice (SHM) than to normal mice. By genetic breeding experiments, we have demonstrated that the gene responsible for thermosensitivity, defined as the rate of body temperature increase, segregates with an increment of blood pressure in the F2 generation, supporting the possibility that thermosensitivity is part of a locus involved in hypertension. This locus is responsible for 25% of the difference in blood pressure between normal mice and SHM. Although severe, acute heat exposure is more detrimental in hypertension, brief episodes of chronic, mild heat stress are beneficial in that they normalize basal blood pressure in SHM. After 35 days of chronic heat treatment, the blood pressure of hypertensive mice is indistinguishable from that of the normotensives. The molecular response to heat which is characterized by the induction of heat stress genes, is abnormal in hypertension. Accumulation of heat stress proteins (HSP70) and of their mRNA following heat exposure is greater in tissues from hypertensive animals. These higher levels of hsp70 mRNA are observed not only after whole body heat exposure but also after in vitro heat stress of isolated organs and cells, and are due to an increased transcriptional rate of hsp70 gene. Our results indicate that increased heat sensitivity is associated with high blood pressure. When heat sensitivity is modified by chronic heat exposure, which could lead to the development of thermotolerance, there is a decrease in blood pressure. Abnormalities in the heat shock response in hypertensive animals may be responsible for their increased heat sensitivity as a part of the expression of the environmental modulation of hypertension.
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Toward a molecular description of proteus syndrome

Thiffault, Isabelle January 2004 (has links)
Proteus Syndrome is a rare overgrowth syndrome in which tumors are a prominent feature. Proteus syndrome comprises an association of asymmetrical gigantism, verrucous epidermal naevi, vascular malformations, hamartomas and hyperostosis. There is no known molecular basis for this overgrowth syndrome but several reports have suggested abnormalities of chromosome 1 could play a role and the abnormal regulation of growth factors could also be important. / We obtained paired and unpaired DNA samples from seven cases of Proteus syndrome from Montreal and Greenwood Genetics Center, South Carolina. In all analyses, we compared simultaneously DNA from affected and unaffected areas from these children. Direct sequencing was used to look at somatic mutation or other alterations in growth, apoptosis or tumor suppressor genes, such as PTEN, GPC3 and CDKN1C. / A genome-wide, 10cM 388 marker microsatellite screen were performed to uncover putative somatic genomic microdeletions or other rearrangements by comparing the allelotype of the affected and unaffected tissues from Proteus syndrome patients.
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Targeted transgenesis : the hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) gene locus

El-Gouhary, Inas January 2003 (has links)
To overcome the limitations that accompanied traditional transgenesis using pronuclear injections, multiple methods have been employed to target a single copy of a transgenic sequence to a chosen location in the genome. One of which is the introduction of a construct as a single copy, in a known orientation, upstream of the hprt (hypoxanthine phosphoribosyl transferase) gene. The present study is designed to characterize the influence this locus could impose on the expression capability of the docked sequence. / Consistent ectopic expression of reporter constructs bearing different Myelin Basic Protein (mbp) regulatory elements and docked at the hprt locus was noted in cardiomyocytes and major CNS blood vessels; two sites in which mbp is not thought to be expressed. This ectopic expression originated from endogenous hprt enhancer activity as similar mbp reporter constructs, randomly inserted, did not reproduce the same expression phenotypes. / In addition, this work also unraveled aspects of the complex nature of mbp gene regulation. The results obtained from this study reveal that reporter constructs containing mbp enhancer elements docked in hprt locus expressed ectopically in the cartilagenous cells of the vertebral bodies during the mouse mid-fetal development period. / Finally, analysis of the "enhancer trap" construct exposed additional ectopic expression in the muscles of the back and tongue uncovering further hprt enhancer activity. Surprisingly, when mbp enhancer sequences were added to the "enhancer trap" construct, marked reduction in muscle expression was noted.

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