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ETUDE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DE LA PROTEINE CHAPERON D'HISTONES ASF1Agez, Morgane 31 March 2008 (has links) (PDF)
Au sein des cellules eucaryotes, l'ADN est compacté sous la forme de chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. Cette structure protéique protège l'ADN des agressions oxydantes et a un rôle essentiel dans la régulation des processus nucléaires. Ce travail a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes de remodelage de la chromatine. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l'interaction entre les protéines du nucléosome que sont les histones H3 et H4 et le chaperon d'histones Asf1. Nous avons résolu par RMN la structure du complexe entre Asf1 et les histones. Ce travail a constitué une base pour, d'une part, analyser la fonction de cette interaction in vivo et, d'autre part, initier la conception de peptides inhibiteurs spécifiques de cette interaction et anti-tumoraux potentiels. Au cours de ce travail, nous avons également développé une méthode in vitro d'étude des mécanismes moléculaires d'assemblage et de désassemblage de nucléosomes par Asf1.
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Danos oxidativos promovidos por espécies de Mn(III) sobre biomoléculas e células em situação de estresse / Oxidative damage induced by Mn(III) species over biomolecules and stressed cellsPereira, Tatiana Araujo 08 March 2012 (has links)
O manganês é um elemento traço essencial, porém existe uma preocupação com seus potenciais efeitos neurotóxicos associados à exposição a níveis excessivos, podendo provocar uma síndrome conhecida como manganismo, cujos sintomas são semelhantes aos da doença de Parkinson. A maioria dos trabalhos envolvendo manganês usa espécies de Mn(II), mas sabe-se que Mn(III) é acumulado em maior quantidade no cérebro. Nesse sentido, foi feito um estudo dos danos oxidativos e de toxicidade provocados por três complexos de Mn(III): citrato, pirofosfato e salicilenodiamina (respectivamente MnCit, MnPPi e EUK8). Para tanto, as três espécies foram sintetizadas e caracterizadas por métodos espectroscópicos. Em seguida foram determinadas suas capacidades pró-oxidantes sobre os seguintes marcadores: dihidrorodamina (DHR), tirosina (Tyr), albumina (BSA) e dopamina (DA). Finalmente, seu efeito sobre células cerebelares e da cepa HeLa estressada por meio de irradiação UV também foi avaliado, e foi usado ascorbato na tentativa de tratar o dano sobre células HeLa. O teste com a DHR também foi feito em presença de H2O2 e ascorbato. A capacidade pró-oxidante testada por fluorescência da DHR sugere que o ascorbato atua como anti-oxidante. Além disso, MnCit e MnPPi (mas não EUK8), quando na presença de H2O2, são menos oxidantes. O mesmo comportamento foi percebido nas medidas de fluorescência de Tyr. A carbonilação da BSA, verificada pela absorbância do seu marcador (DNPH), seria indício de capacidade oxidante dos complexos, mas não percebeu-se variação significativa de grupos C=O na proteína após tratamento com espécies de Mn(III), mesmo em amostras com H2O2, embora notem-se as mesmas tendências apresentadas pelos complexos com DHR e Tyr. Estudos de oxidação de DA por luminescência tiveram resultados inconclusivos, mas dados mais concretos em testes com medidas de absorbância de soluções de DA e fluorescência de misturas de DA com DHR indicaram que DA é preferencialmente oxidada por todos os compostos. A viabilidade celular de culturas de células neuronais granulares (CGC) mostrou pouca diferença entre as toxicidades dos compostos, mas verifica-se uma relação inversamente proporcional entre as toxicidades e lipofilicidades dos complexos. O mesmo não ocorre nos experimentos com HeLa, cuja viabilidade foi avaliada por contagem de colônias após fixação e coloração das células, pois nesse caso o EUK8 se mostrou o mais tóxico dos três. Além disso, ao contrário do observado com a DHR, o ascorbato teve ação pró-oxidante, e, aparentemente, houve um efeito sinérgico negativo entre os complexos e a radiação UV. Tratamento com o quelante p-aminossalicilato só foi eficaz na recuperação das culturas para amostras não irradiadas. / Manganese is an essential trace element, however there is considerable concern regarding its neurological effects when in excess, giving rise to a condition termed manganism which is characterized by Parkinson disease-like symptoms. Most evaluations of manganese toxicity use poorly defined Mn(II) species, although Mn(III) is known to accumulate preferentially in the brain. Therefore, in this work we proposed a study of oxidative damage and citotoxicity of Mn(III) derivatives of citrate, pyrophosphate and salycilenediamine (respectively, MnCit, MnPPi and EUK8). The species were synthesized and characterized by spectroscopic methods. Their pro-oxidant abilities were assessed over markers of oxidant activity dihydrorhodamine (DHR), tyrosine (Tyr), albumin (BSA) and dopamine (DA). In addition, their effect over granular cerebral cells (CGC) and HeLa cells stressed by ultraviolet irradiation was studied, and treated with ascorbate. Tests with DHR were repeated treating the samples with H2O2 and ascorbate. Pro-oxidant ability tested by both DHR and Tyr fluorescence suggest that ascorbate is antioxidant towards Mn(III)-induced oxidative damage. MnCit and MnPPi (but not EUK8), when in presence of peroxide, are less oxidants. An analogous trend was observed for BSA, although without statistical significance. Evaluation of DA formation by luminescence was inconclusive, but competition studies of DA+DHR mixtures indicated that DA is preferentially oxidized by all the complexes. To CGC, little difference was observed for the toxicities of the complexes. An inverse relationship of toxicity and lipophilicity has been observed. However this was not observed for HeLa cells, to which EUK8 was more toxic. In addition, and in opposition to the DHR solution study, ascorbate was found to be pro-oxidant. A negative synergic effect was observed between complex doses and irradiation. Treatment of the cells with paraaminosalicylate was beneficial only for non-irradiated cells.
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Danos oxidativos promovidos por espécies de Mn(III) sobre biomoléculas e células em situação de estresse / Oxidative damage induced by Mn(III) species over biomolecules and stressed cellsTatiana Araujo Pereira 08 March 2012 (has links)
O manganês é um elemento traço essencial, porém existe uma preocupação com seus potenciais efeitos neurotóxicos associados à exposição a níveis excessivos, podendo provocar uma síndrome conhecida como manganismo, cujos sintomas são semelhantes aos da doença de Parkinson. A maioria dos trabalhos envolvendo manganês usa espécies de Mn(II), mas sabe-se que Mn(III) é acumulado em maior quantidade no cérebro. Nesse sentido, foi feito um estudo dos danos oxidativos e de toxicidade provocados por três complexos de Mn(III): citrato, pirofosfato e salicilenodiamina (respectivamente MnCit, MnPPi e EUK8). Para tanto, as três espécies foram sintetizadas e caracterizadas por métodos espectroscópicos. Em seguida foram determinadas suas capacidades pró-oxidantes sobre os seguintes marcadores: dihidrorodamina (DHR), tirosina (Tyr), albumina (BSA) e dopamina (DA). Finalmente, seu efeito sobre células cerebelares e da cepa HeLa estressada por meio de irradiação UV também foi avaliado, e foi usado ascorbato na tentativa de tratar o dano sobre células HeLa. O teste com a DHR também foi feito em presença de H2O2 e ascorbato. A capacidade pró-oxidante testada por fluorescência da DHR sugere que o ascorbato atua como anti-oxidante. Além disso, MnCit e MnPPi (mas não EUK8), quando na presença de H2O2, são menos oxidantes. O mesmo comportamento foi percebido nas medidas de fluorescência de Tyr. A carbonilação da BSA, verificada pela absorbância do seu marcador (DNPH), seria indício de capacidade oxidante dos complexos, mas não percebeu-se variação significativa de grupos C=O na proteína após tratamento com espécies de Mn(III), mesmo em amostras com H2O2, embora notem-se as mesmas tendências apresentadas pelos complexos com DHR e Tyr. Estudos de oxidação de DA por luminescência tiveram resultados inconclusivos, mas dados mais concretos em testes com medidas de absorbância de soluções de DA e fluorescência de misturas de DA com DHR indicaram que DA é preferencialmente oxidada por todos os compostos. A viabilidade celular de culturas de células neuronais granulares (CGC) mostrou pouca diferença entre as toxicidades dos compostos, mas verifica-se uma relação inversamente proporcional entre as toxicidades e lipofilicidades dos complexos. O mesmo não ocorre nos experimentos com HeLa, cuja viabilidade foi avaliada por contagem de colônias após fixação e coloração das células, pois nesse caso o EUK8 se mostrou o mais tóxico dos três. Além disso, ao contrário do observado com a DHR, o ascorbato teve ação pró-oxidante, e, aparentemente, houve um efeito sinérgico negativo entre os complexos e a radiação UV. Tratamento com o quelante p-aminossalicilato só foi eficaz na recuperação das culturas para amostras não irradiadas. / Manganese is an essential trace element, however there is considerable concern regarding its neurological effects when in excess, giving rise to a condition termed manganism which is characterized by Parkinson disease-like symptoms. Most evaluations of manganese toxicity use poorly defined Mn(II) species, although Mn(III) is known to accumulate preferentially in the brain. Therefore, in this work we proposed a study of oxidative damage and citotoxicity of Mn(III) derivatives of citrate, pyrophosphate and salycilenediamine (respectively, MnCit, MnPPi and EUK8). The species were synthesized and characterized by spectroscopic methods. Their pro-oxidant abilities were assessed over markers of oxidant activity dihydrorhodamine (DHR), tyrosine (Tyr), albumin (BSA) and dopamine (DA). In addition, their effect over granular cerebral cells (CGC) and HeLa cells stressed by ultraviolet irradiation was studied, and treated with ascorbate. Tests with DHR were repeated treating the samples with H2O2 and ascorbate. Pro-oxidant ability tested by both DHR and Tyr fluorescence suggest that ascorbate is antioxidant towards Mn(III)-induced oxidative damage. MnCit and MnPPi (but not EUK8), when in presence of peroxide, are less oxidants. An analogous trend was observed for BSA, although without statistical significance. Evaluation of DA formation by luminescence was inconclusive, but competition studies of DA+DHR mixtures indicated that DA is preferentially oxidized by all the complexes. To CGC, little difference was observed for the toxicities of the complexes. An inverse relationship of toxicity and lipophilicity has been observed. However this was not observed for HeLa cells, to which EUK8 was more toxic. In addition, and in opposition to the DHR solution study, ascorbate was found to be pro-oxidant. A negative synergic effect was observed between complex doses and irradiation. Treatment of the cells with paraaminosalicylate was beneficial only for non-irradiated cells.
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Bases structurales de la specificite de reconnaissance entre les toxines animales et les canaux ioniquesBernard, Cedric 11 October 2002 (has links) (PDF)
Les canaux ioniques occupent une place primordiale dans les mécanismes du vivant, et leurs dysfonctionnements sont à l'origine de nombreuses pathologies. Dans l'optique d'envisager un traitement efficace de ces maladies, la compréhension des mécanismes de fonctionnement des canaux ioniques constitue un objectif majeur à atteindre. Les toxines animales actives sur les canaux ioniques apparaissent aujourd'hui comme un outil de choix pour mieux comprendre le fonctionnement de ces canaux. Au travers de son introduction bibliographique, ce manuscrit présente les canaux K+, Na+ et Ca2+ et les toxines animales dont ces canaux sont les cibles naturelles. Ces toxines s'organisent majoritairement autour de deux motifs structuraux distincts : le motif CsΑΒ (Cystine stabilized ΑΒ motif), décrit principalement dans les toxines de scorpion actives sur les canaux K+ et Na+, et le motif ICK (Inhibitor Cystine Knot) qui est rencontré dans certaines toxines de cônes et d'araignées actives sur les canaux K+, Na+ ou Ca2+. Le travail effectué au cours de cette thèse est sous-tendu par un objectif, améliorer encore la connaissance et la compréhension de l'interaction d'une toxine et de sa cible, le canal. Les résultats obtenus s'articulent autour de la détermination de la structure RMN de plusieurs toxines. Concernant le motif CsΑΒ, nos résultats montrent que, par conception de protéines chimères, nous pouvons modifier la spécificité et/ou la sélectivité des toxines envers les canaux K+. Concernant le motif ICK, nos résultats pour les toxines actives sur les canaux K+ doivent être confirmés par des études complémentaires puisque la structure indique que ces toxines semblent interagir au niveau du pore du canal, hypothèse en contradiction avec les données biologiques ; pour les toxines actives sur les canaux Ca2+, la spécificité envers les différents types de canaux et l'influence de l'anisotropie de répartition des charges électrostatiques sur l'interaction toxine/canal sont discutées.
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Régulation UV-dépendante des gènes de la pigmentation. Implication du facteur de transcription USF-1 (Upstream Stimulating Factor 1)Corre, Sébastien 09 December 2005 (has links) (PDF)
La peau constitue la première barrière de défense de l'organisme face aux agressions physiques, chimiques et biologiques de l'environnement. Le rôle protecteur de la peau face aux rayonnements solaires ultraviolets, qui constituent la source majeure de dommages de l'ADN des cellules de l'épiderme, est généralement obtenu par la synthèse de la mélanine. La réponse pigmentaire repose ainsi sur la coopération cellulaire observée principalement entre les mélanocytes et les kératinocytes avoisinants. Les mécanismes moléculaires mis en jeu font intervenir les voies classiques de la pigmentation constitutive, déterminant le phototype propre à chaque individu ainsi qu'une voie de signalisation spécifique de la réponse UV. L'implication de la voie de signalisation p38, stress-dépendante, et du facteur de transcription USF-1 dans la régulation de l'expression du gène Tyrosinase, nous a conduit à étudier le rôle du facteur de transcription dans la réponse pigmentaire (Galibert et al., EMBO, 2001). Un ensemble d'expériences (RT-PCR-Quantitative, Immuno-Précipitation de la chromatine, Transfection transitoire...) réalisé in vitro et in vivo (culture cellulaire ou biopsies humaines) et complété d'une approche génétique utilisant une lignée mélanocytaire invalidé pour le gène USF-1, nous a permis d'établir un modèle de régulation de la pigmentation UV induite (Corre et al., JBC, 2004 ; Corre et al., soumis). Enfin, la mise en évidence d'une nouvelle modification post-traductionnelle de la protéine USF-1 en réponse à un stress, dose et temps dépendant, permet d'envisager un nouveau mode de régulation des gènes régulés par USF- 1 (Corre et Galibert, PCR, 2005 ; Corre et al, en préparation). L'ensemble des données obtenues au cours de ma thèse complètent et précisent la fonction du facteur de transcription USF-1 dans la réponse aux stress et suggère un rôle dans le processus tumoral des mélanomes.
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Régulation tissulaire de l'épissage alternatif : Caractérisation fonctionnelle d'une séquence activatrice de la maturation d'un exon 3' terminalAnquetil, Vincent 02 October 2009 (has links) (PDF)
La maturation des ARN pré-messagers est le fruit d'un ensemble de processus nucléaires interconnectés qui sont soumis à de nombreuses régulations. L'épissage alternatif des exons 3' terminaux joue un rôle majeur dans l'expression des gènes car il permet de réguler qualitativement et quantitativement leur expression. Nous étudions les déterminants de la régulation tissulaire de l'épissage et de la polyadénylation en utilisant comme modèle le gène de la tropomyosine α de xénope. Ce gène contient, dans sa région 3' terminale, un exon composite interne/3' terminal nommé 9A9' qui est utilisé comme exon 3' terminal dans les somites et est sauté dans les tissus non musculaires dans l'embryon de xénope. L'utilisation de minigènes contenant une portion de la région 3' terminale du gène de la tropomyosine α placée sous le contrôle de promoteurs tissuspécifiques a permis d'identifier deux éléments introniques régulant l'utilisation de l'exon 9A9'. L'un nommé 150PY est répresseur, l'autre appelé UTE est activateur. L'élément 150PY réprime l'utilisation de l'exon 9A9' dans les cellules non musculaires. Des approches biochimiques et in vivo ont montré que la protéine PTB se fixe sur cet élément et inhibe les réactions d'épissage et de clivage/polyadénylation de l'exon 9A9'. Afin de caractériser la fonction de l'élément activateur UTE, nous avons bloqué son accessibilité dans les embryons à l'aide d'oligonucléotides morpholinos antisens. Nos résultats montrent que l'UTE active l'utilisation de l'exon 9A9' en tant qu'exon 3' terminal en favorisant la reconnaissance du site 3' d'épissage, du signal de polyadénylation et du point de branchement. Ces résultats suggèrent que l'UTE favorise la fixation de la snRNPU2 sur le point de branchement qui à son tour stabilise la liaison du complexe de clivage/polyadénylation sur le signal de polyadénylation permettant ainsi la définition de l'exon 9A9' en tant qu'exon terminal. La PTB prévient l'utilisation de l'UTE dans les cellules non musculaires à l'inverse de certaines protéines SR qui favorisent la sélection de l'exon 9A9' de manière dépendante de cette séquence. Pour caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la fonction de l'UTE nous avons recherché les facteurs recrutés sur cette séquence. Ces expériences montrent que la protéine ESRP2 est spécifiquement recrutée sur un ARN contenant l'UTE en présence de PTB. ESRP2 est exprimée uniquement dans les cellules épithéliales et pourrait participer avec la PTB à la spécificité tissulaire de la répression de l'exon 9A9'. L'ensemble de ces résultats suggèrent que la régulation tissulaire de l'exon 9A9' est basée sur une compétition de fixation entre des facteurs activateurs et inhibiteurs sur la séquence régulatrice UTE.
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Binding & Release of Biomolecules from Hyaluronic Acid Macrogels with Cetylpyridinium Chloride as a Model SurfactantSandell, Sara January 2011 (has links)
The purpose of this master thesis project was to investigate the penetration ofbiomolecules into hyaluronic acid (HA) macrogels. The investigations were performedboth in the presence and in the absence of the non-biodegradable surfactantcetylpyridinium chloride (CPC), which earlier has proved to form a micelle-rich shellat the gel surface. In this work investigations were performed to see if properties ofthe biomolecules used, such as size and charge, had any impact on the binding to theHA gels both with and without CPC. The biomolecules used were the proteinscytochrome c, lysozyme, hemoglobin and myoglobin and the polysaccharide dextranof different molecular weights and labeled with fluorescein isothiocyanate.Cetylpyridinium chloride was used as a non-biodegradable model surfactant for abiodegradable betaine ester surfactant. The cetylpyridinium chloride was thereforeserving well when performing control studies for the biodegradable betaine ester,because the two possesses similar properties. Investigations involving the betaineester surfactant was not included in this master thesis project. Also release studiesinvolving the labeled dextran and some of the proteins were performed in thepresence and absence of cetylpyridinium chloride.The binding of CPC to HA was investigated briefly as well as the microstructure ofHA gels saturated with CPC by means of small-angle X-ray scattering, SAXS, atdifferent salt concentrations. The microstructure-investigations indicated that at 10mM NaCl a cubic ordered phase with space group Pm3n was achieved. When the saltconcentration was increased to 40 mM the microstructure was altered to a clearface-centered cubic (FCC) structure. When increasing the NaCl concentrationfurther, to 150 mM, indication of an unordered micellar phase could be seen.Cytochrome c and lysozyme transport into HA gels, to which CPC had bound in anearlier step, could be registered using UV-VIS spectrophotometry. Indications showedthat CPC and cytochrome c was distributed to different parts of the gel frommicroscope pictures taken of the cross-section of gel samples at different time.From release experiments performed with fluorescein isothiocyanate-dextran noconclusions could be drawn on how the different molecular weights of dextranaffected the rate and extent of the amount substance released. Neither could theinfluence of CPC be elucidated. This since the extent of released amounts exceeded100 % for many samples and the duplicate samples investigated showed differentbehavior.The transport of cytochrome c, myoglobin and hemoglobin into HA gels with andwithout beforehand treatment with CPC was evaluated qualitatively. The transportinto gels treated with CPC was successful and complete with cytochrome c andmyoglobin at lower degree of binding but was limited for the bigger proteinhemoglobin. When investigating the release of cytochrome c, myoglobin andhemoglobin from HA gels the extent of released substance was lower with CPCpresent in the solution compared without CPC present. Also some indicationsshowed that the bigger size of hemoglobin affected the rate of release from the gel.
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Double point contact single molecule absorption spectroscopyHoward, John Brooks 24 August 2009 (has links)
The generation of high-frequency current oscillations when a constant voltage is applied across an insulating tunnel gap separating two superconductors was one of the fundamental theoretical predictions made by Brian Josephson, which earned him a share of the 1973 Nobel Prize in physics. Our primary objective is to utilize superconducting transport through microscopic objects to both excite and analyze the vibrational degrees of freedom of various molecules of a biological nature. The technique stems from a Josephson junction's ability to generate radiation that falls in the terahertz gap ( 10THz) and consequently can be used to excite vibrational modes of simple and complex molecules. Analysis of the change in IV characteristics coupled with the differential conductance ( ) allows determination of both the absorption spectra and the vibrational modes of biological molecules.
Presented here are both the theoretical foundations of superconductivity relevant to our experimental technique and the fabrication process of our samples. Comparisons between our
technique and that of other absorption spectroscopy techniques are included as a means of providing a reference upon which to judge the merits of our novel procedure. This technique is meant to improve not only our understanding of the vibrational degrees of freedom of
useful biological molecules, but also these molecule's structural, electronic and mechanical properties.
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Biosynthèse de caroténoïdes aromatiques hydroxylés<br />par des bactéries non photosynthétiques :<br />Des carotènes aux xanthophylles.Savy, Stephanie 04 February 2005 (has links) (PDF)
Ces travaux portent sur la production de caroténoïdes aromatiques par des bactéries non photosynthétiques. Les trois bactéries retenues pour cette étude sont Brevibacterium linens, Streptomyces mediolani et Mycobacterium aurum. Ces bactéries sont connues pour produire les mêmes caroténoïdes aromatiques à savoir l'isoréniératène et ses dérivés hydroxylés. La voie de biosynthèse de ces pigments est décrite jusqu'au stade isoréniératène, l'étape ultérieure permettant la formation de caroténoïdes hydroxylés constitue le sujet de cette étude.<br />Dans un premier temps, les pigments produits par ces bactéries sont étudiés par HPLC et LCMS. Ces études ont montré que B. linens et S. mediolani synthétisent majoritairement du 3,3'-di-hydroxy-isoréniératène. Elles ont également révélé l'absence de ce composé chez M. aurum. Contrairement à ce qui est décrit dans la littérature cette bactérie accumule un caroténoïde de masse moléculaire supérieure à celle du di-hydroxy-isoréniératène. Une purification a été entreprise pour une analyse en RMN mais les faibles quantités obtenues n'ont pas permis la détermination de la structure. <br />Dans un second temps, la réaction d'hydroxylation, dernière étape dans la biosynthèse de ces caroténoïdes a été étudiée. On cherche à identifier le type d'enzyme et le substrat de cette étape. L'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de cytochrome P450 dans les cultures bactériennes se traduit par l'accumulation d'isoréniératène et la disparition des formes hydroxylées chez B. linens et S. mediolani. Ces résultats montrent l'implication d'un cytochrome P450 dans l'hydroxylation de l'isoréniératène pour ces bactéries. <br />Le cluster de la caroténogénèse a été récemment séquencé et identifié chez les trois bactéries étudiées. Seul le cluster de B. linens comporte un gène (orf 10) pouvant coder une hydroxylase qui présente un motif caractéristique d'un cytochrome P450, cependant son implication dans l'hydroxylation des caroténoïdes aromatiques n'est pas précisée. <br />Une série de mutagénèse aléatoire par rayonnement U.V. a été entreprise sur B. linens. Elle a permis d'obtenir un mutant noté BLMJ. Les analyses HPLC et LCMS des pigments produits par BLMJ montrent qu'il accumule très majoritairement de l'isoréniératène. Le système responsable de l'hydroxylation de l'isoréniératène de BLMJ apparaît défectueux. L'analyse de la séquence de l'ORF 10 de BLMJ révèle la présence d'une mutation au niveau de l'acide aminé 84 où la phénylalanine est remplacée par une sérine. Après comparaison avec des structures 3D de P450 connus il semblerait que cet acide aminé soit important dans la stabilisation du groupement prosthétique de l'enzyme. Sa mutation entraînerait donc une perte d'activité de l'enzyme. <br />Pour s'assurer de l'implication de l'ORF 10 dans l'hydroxylation de l'isoréniératène chez B. linens, nous avons électroporé B. linens avec l'orf 10 muté de BLMJ. Un mutant (noté BLE7J) accumulant majoritairement de l'isoréniératène a pu être isolé. L'analyse de la séquence de l'ORF 10 de BLE7J révèle la présence d'une mutation au niveau de l'acide aminé 267 où l'acide glutamique est remplacé par une glutamine. Après comparaison de séquences, il apparaît que cet acide aminé appartient à un motif conservé dans les séquences de P450 car impliqué dans la stabilisation du groupement prosthétique de l'enzyme. Sa mutation entraînerait donc une perte d'activité de l'enzyme.<br />Les mutants BLMJ et BLE7J montrent que le P450 responsable de l'hydroxylation de l'isoréniératène en 3,3'-di-hydoxy-isoréniératène est codé par l'orf 10 du cluster crt de B. linens.
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Identification et caractérisation des sites de transport de CadA, l'ATPase-cadmium de Listeria Monocytogenes.Wu, Chen-Chou 20 January 2005 (has links) (PDF)
Les ATPases de type P1 assurent le transport d'ions métalliques lourds tels que le Cu+, le<br />Cd2+ ou le Zn2+ à travers une membrane. Ce transport, qualifié d'actif parce que s'exerçant<br />en sens inverse du gradient électrochimique de l'ion transporté, utilise l'énergie libérée lors<br />de l'hydrolyse de l'ATP. Une étude accomplie en 1992 indique que 36% des Listeria<br />monocytogenes sont résistantes à de hautes concentrations de Cd2+. Cette résistance est<br />associée à la présence de plasmides, parmi lesquels pLm74 qui présente une séquence de<br />2136 paires de bases codant pour un polypeptide de 711 acides aminés nommé CadA. Ce<br />polypeptide possède les 3 séquences signatures des ATPases de type P, les motifs DKTGT,<br />MxTGD et TGDGxNDxP et les 2 séquences signatures des ATPases de type P1, les motifs<br />CXXC et CPC. L'objectif de cette thèse était la recherche des acides aminés constituant la<br />voie de passage du Cd2+ au sein du domaine transmembranaire de CadA. Ce travail a<br />nécessité l'expression de CadA dans la levure Saccharomyces cerevisiae et la<br />caractérisation du phénotype de sensibilité au Cd2+ induit par la présence de CadA. Il a aussi<br />nécessité une étude enzymatique de CadA au cours de laquelle nous avons montré que le<br />Cd-ATP pouvait remplacer le Mg-ATP dans le cycle enzymatique de la protéine. Quatre<br />hélices transmembranaires (3, 4, 6 et 8) constitueraient la voie de passage du Cd2+ dans<br />CadA. Au sein de ces hélices, les acides aminés M149, C354 et T684 pourraient faire partie<br />du site de liaison tandis que E164 et C356 pourraient être importants dans le processus de<br />dissociation du métal. P355 et D692 seraient nécessaires à la phosphorylation de l'enzyme.<br />L'étude des domaines cytoplasmiques N (liaison des nucléotides) et P (phosphorylation) de<br />CadA a été aussi abordée au cours de cette thèse. La caractérisation fonctionnelle<br />d'ATPases chimériques a mis en évidence la possibilité d'échanger le domaine de<br />phosphorylation entre différentes ATPases de type P.
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