A produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 foi testada em diferentes subprodutos da indústria de alimentos. Farelo de soja foi o meio escolhido para determinar o efeito de três variáveis (temperatura, pH inicial e concentração do substrato) sobre a atividade antimicrobiana pela metodologia de superfície de resposta, utilizando um experimento fatorial 23. Na faixa estudada, temperatura e pH inicial do meio apresentam efeito significativo sobre a produção de atividade antimicrobiana, já a concentração do substrato não teve nenhum efeito significativo. Os dados mostraram produção máxima em pH inicial entre 7,0 e 8,5 e temperatura entre 39 e 42ºC. Nessas condições a produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 em farelo de soja foi comparada com a produção em meio de cultivo comercial (caldo BHI). Os resultados obtidos para os dois meios de cultura foram semelhantes, indicando que o farelo de soja pode ser um substrato de baixo custo para produção de antimicrobianos por Bacillus sp. P11. Para demostrar o efeito da temperatura e do pH na produção de peptídeos antimicrobianos, verificou-se a expressão de sboA (subtilosina A) e ituD (iturina A) em Bacillus sp. P11, utilizando a metodologia de qRT-PCR. A produção de subtilosina A e iturina A foi confirmada por espectrometria de massas. A expressão de sboA e ituD foi fortemente afetada pelo pH e pela temperatura e qRT-PCR provou ser uma poderosa ferramenta para investigar o potencial da cepa em produzir subtilosina A e iturina A. Além disso, a produção de peptídeos antimicrobianos por Bacillus sp. P11 foi investigada na presença de células inativadas termicamente de bactérias e fungos. A cepa exibiu maior atividade antimicrobiana na presença de células inativadas de Staphylococcus aureus ou Aspergillus parasiticus. Nessas condições a expressão de genes essenciais relacionadas com a biossíntese dos peptídeos antimicrobianos surfactina, iturina A, subtilosina A e fengicina foi investigada por qRT-PCR. Os resultados sugerem que o aumento da atividade antimicrobiana foi relacionado com a produção de iturina A, um peptídeo antimicrobiano que mostra forte atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de fungos e pode ser usado no controle biológico de doenças de plantas. Por fim, foram testadas diferentes metodologias para a purificação parcial dos peptídeos antimicrobianos produzidos por Bacillus sp. P11. Os melhores resultados foram obtidos por partição em sistema aquoso bifásico com o sal sulfato de zinco, porém estudos adicionais são necessários. / Production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 was tested in different byproducts of food industry. Soybean meal was the selected medium to determine the effect of three variables (temperature, pH and substrate concentration) on the antimicrobial activity by response surface methodology, using a 23 factorial design. In the range studied, temperature and initial pH of the medium had a significant effect on the production of antimicrobial activity and substrate concentration had no significant effect. The data showed maximum production at initial pH between 7.0 and 8.5 and temperature between 39 and 42°C. Under these conditions the production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 in soybean meal was compared with the commercial medium (BHI). The results for both culture media were similar, indicating that soybean meal can be a low cost substrate for the production of antimicrobial activity of Bacillus sp. P11. To demonstrate the effect of temperature and pH on the production of antimicrobial peptides, we studied the expression of sboA (subtilosin A) and ituD (iturin A) in Bacillus sp. P11, using qRT-PCR methodology. The production of subtilosin A and iturin A was confirmed by mass spectrometry. The expression of sboA and ituD was strongly affected by pH and temperature and qRT-PCR proved to be a powerful tool to investigate the potential of the strain to produce subtilosin A and iturin A. In addition, the production of antimicrobial peptides by Bacillus sp. P11 was investigated in the presence of thermally inactivated cells of bacteria and fungi. The strain exhibited higher antimicrobial activity in presence of inactivated cells of Staphylococcus aureus or Aspergillus parasiticus. Under these conditions the expression of essential genes related to biosynthesis of antimicrobial peptides surfactin, iturin A, subtilosin A and fengycin was investigated by qRT-PCR. The results suggest that the increase in antimicrobial activity was related to the production of iturin A, an antimicrobial peptide that shows strong antimicrobial activity against a broad spectrum of fungi and can be used in biological control of plant diseases. Finally, we tested different methods for partial purification of antimicrobial peptides produced by Bacillus sp. P11. The best results were obtained by partition in aqueous two-phase system with the salt zinc sulfate, but further studies are needed.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2018-01-09T03:17:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349091.pdf: 1400230 bytes, checksum: 70916c9610159fccc7df03f57c2c7804 (MD5) Previous issue date: 2017 / Os pesticidas são compostos amplamente utilizados na agricultura e responsáveis por inúmeros casos de intoxicações em humanos. A exposição a esses compostos ocorre durante a sua aplicação, mas também pelo contato com lavouras tratadas com esses toxicantes ou ainda pela ingestão de alimentos ou água contaminados, bem como exposições intencionais em tentativas de suicídio. Nota-se que os principais casos de intoxicações ocorrem devido a exposição aos pesticidas organofosforados (OFs). O clorpirifós (CPF) é um OF muito utilizado no Brasil, principalmente no meio agrícola. Ele é um composto lipofílico que, ao ser metabolizado, gera um metabólito ativo tóxico e mais potente, o clorpirifós-oxon (CPF-O). O mecanismo principal de toxicidade destes compostos OFs está relacionado à inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE), desencadeando uma variedade de sinais e sintomas que caracterizarão a clássica ?síndrome colinérgica?. Por outro lado, algumas evidências indicam que a intoxicação aguda ou crônica com OFs pode ser caracterizada por efeitos que não são somente atribuídos à inibição da enzima AChE (efeitos denominados não-colinérgicos). De fato, algumas evidências experimentais têm apontado para a toxicidade não-colinérgica induzida por compostos OFs como um fator responsável pelo desenvolvimento de síndromes neurotóxicas. No entanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos moleculares relacionados à neurotoxicidade não-colinérgica induzida por OFs. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi identificar possíveis eventos não-colinérgicos envolvidos na neurotoxicidade do pesticida CPF e do CPF-O em cultivos celulares de neurônios hipocampais de camundongos (HT22). A exposição ao pesticida CPF e ao CPF-O foi capaz de diminuir a viabilidade celular das células HT22 de maneira concentração dependente. De modo interessante, o CPF-O mostrou-se mais tóxico para as células HT22. Esta citotoxicidade não foi protegida pela atropina (um antagonista muscarínico) e pela pralidoxima (um reativador da AChE), indicando que efeitos não colinérgicos poderiam estar envolvidos no mecanismo de toxicidade desses compostos. Foi demonstrado que a exposição das células HT22 ao CPF e ao CPF-O induziu redução dos níveis de glutationa (GSH) e inibição da GSK-3ß, porém somente o CPF foi capaz de ativar as MAPKs, ERK1/2 e p38MAPK. Entretanto, a utilização de inibidores da ERK1/2 e p38MAPK não protegeu as células HT22 da citocixidade induzida pelo CPF e CPF-O. Por outro lado, o pré-tratamento com N-acetilcisteína (NAC) apresentou efeito protetor frente a citotoxicidade induzida por este pesticida. Nossos resultados indicam o envolvimento do estresse oxidativo no mecanismo de toxicidade desses compostos, bem como a ativação de MAPKs e inibição da GSK-3ß como eventos alternativos à superestimulação colinérgica. / Abstract : Pesticides are compounds widely used in agriculture and responsible for innumerable cases of intoxication in humans. Exposure to these compounds occurs during their application, but also by contact with crops treated with these compounds, or by ingestion of contaminated food or water, as well as intentional exposures to suicide attempts. It is noted that the main cases of intoxication occur due to exposure to organophosphorus pesticides (OFs). Chlorpyrifos (CPF) is an OF widely used in Brazil, mainly in the agricultural environment. It is a lipophilic compound that, when metabolized, generates a toxic and more potent active metabolite, chlorpyrifos-oxon (CPF-O). The main mechanism of toxicity of these OFs compounds is related to the inhibition of the enzyme acetylcholinesterase (AChE), triggering a variety of signs and symptoms that characterize the classic "cholinergic syndrome". On the other hand, some evidence indicates that acute or chronic intoxication with OFs may lead to toxic effects that are not only attributed to inhibition of the AChE enzyme (so-called non-cholinergic effects). In fact, experimental evidence has pointed to the non-cholinergic toxicity induced by OFs compounds as a factor responsible for the development of neurotoxic syndromes. However, little is known about the molecular mechanisms related to non-cholinergic neurotoxicity induced by OFs. The aim of this study was to identify possible non-cholinergic events involved in the neurotoxicity of the CPF pesticide and CPF-O in cell cultures of hippocampal neurons of mice (HT22). Exposures to the CPF pesticide and CPF-O were able to decrease the cell viability of HT22 cells in a concentration-dependent manner. Interestingly, CPF-O was shown to be more toxic to HT22 cells. This cytotoxicity was not protected by atropine (a muscarinic antagonist) and by pralidoxime (a AChE reuptake) indicating that non-cholinergic effects could be involved in the mechanism of toxicity of these compounds. In addition, exposure of HT22 cells to CPF and CPF-O induced reduction of glutathione (GSH) levels and GSK-3ß inhibition, but only CPF was able to activate MAPKs, ERK1/2 and p38MAPK. However, the use of ERK1/2 and p38MAPK inhibitors did not protect HT22 cells from CPF and CPF-O induced cytotoxicity. On the other hand, the pre-treatment with N-acetylcysteine (NAC) showed protective effect against this pesticide-induced cytotoxicity. Our results indicate the involvement of oxidative stress in the mechanism oftoxicity of these compounds, as well as the MAPKs activation and GSK-3ß inhibition as alternative events to cholinergic overstimulation.

Metilmercúrio (MeHg), a forma orgânica do mercúrio, é um dos poluentes de maior risco ao ambiente. MeHg é uma potente neurotoxina, principalmente durante o desenvolvimento do sistema nervoso central. A neurotoxicidade induzida pelo MeHg no período pré-natal pode causar desordens mentais, paralisia cerebral e convulsões. Nós investigamos o imunoconteúdo de S100B no fluído cerebroespinal (FCE) e no tecido encefálico, uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada pelos astrócitos, na qual tem uma atividade trófica e tóxica, dependendo da sua concentração. Ratas grávidas foram expostas ao MeHg (5 mg/kg/dia) no 12°, 13° e 14° dias de gestação. O fluído cerebroespinal e o tecido encefálico (mais especificamente hipocampo, córtex cerebral e cerebelo) foram obtidos dos neonatos no 1°, 15° e 30° dia pós-natal. O acúmulo de MeHg foi medido do tecido encefálico após o nascimento e aos 30 dias de vida. Um aumento da S100B no FCE foi observado aos 15 dias de vida pós-natal, mas desapareceu aos 30 dias. No tecido hipocampal mostrou um aumento da S100B (e redução da proteína ácida fibrilar glial) imediatamente após nascimento, mas não posteriormente. Nenhuma mudança foi observada no teste cognitivo (labirinto aquático) desses ratos em idade adulta. Nossos resultados reforçam o envolvimento glial na neurotoxicidade induzida pelo MeHg. As mudanças no hipocampo ao nascimento, poderiam estar relacionadas com as desordens cognitivas e epilépticas atribuídas ao MeHg. O aumento da S100B no FCE reforça a hipótese de que o aumento da S100B está relacionado a danos no sistema nervoso central. Embora, o mecanismo celular envolvido no aumento do conteúdo da S100B no FCE seja desconhecido, os resultados sugerem que a S100B possa ser usada como um marcador periférico na injúria induzida pelo MeHg.

Esta pesquisa desenvolve uma análise da formação de grupos educacionais que se estabeleceram fora do espaço instituído das faculdades de educação e passaram a ocupar um lugar nos institutos ou departamentos de bioquímica, configurando, desta forma, um novo lugar de saber que passou a ser chamado de Educação em Bioquímica. A proposta de análise é a busca de condições históricas para emergência desses grupos, bem como um entendimento de como essa formação se deu dentro das Sociedades que congregam os pesquisadores em bioquímica e, para operacioná-la, partiu-se de uma perspectiva pós-estruturalista e pós-moderna de investigação, inspirada nos entendimentos de história, ciências e educação de dois pensadores sociais que são Jean-François Lyotard e Michel Foucault. Em função da produtividade crescente no novo campo de saber da Educação em Bioquímica e das diferentes abordagens percebidas nas apresentações em eventos da comunidade de bioquímicos, passou-se a investigar três desses grupos no seu movimento diário de pesquisa, procurando perceber as estratégias de validação do conhecimento de cada grupo, suas semelhanças e diferenças no campo da Educação Bioquímica, seus possíveis embates e, principalmente, suas positividades em termos de produção do saber num campo de conhecimentos que se organiza entre dois estabelecidos e distintos campos de conhecimento: das ciências educacionais e das ciências da vida. Uma das questões importantes nas perspectivas pós-modernas e pós-estruturalistas em educação é a possibilidades de ler textos que estão visibilizados de outras formas que não as da fala e da escrita. A possibilidade de mostrar como os lugares podem dizer de seus ocupantes e das suas relações, também, é uma abordagem que esse trabalho de pesquisa evidencia, bem como, traz à discussão as diferenças das linguagens características de um fazer científico e de um fazer educacional tendo como pano de fundo as falas da Educação em Bioquímica. Pretende-se mostrar que as linguagens dos campos de origem - bioquímica e educação – conformam e determinam um modo de literatura que oscila entre esses dois saberes e que de alguma forma reproduz em microescala uma discussão maior que acontece entre as ciências da vida e as ciências humanas. Enfim, procurou-se mapear a emergência histórica, a produção e a produtividade de alguns grupos importantes na área, as formas de legitimação e os processos de construção e sobrevivência desses grupos que trabalham nos limiares do saber.

Orientador : Prof. Dr. Thales Ricardo Cipriani / Co-orientadora : Profª. Drª. Ana Helena Grachen / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 18/03/2015 / Inclui referências / Resumo: A heparina é um glicosaminoglicano altamente sulfatado que tem grande importância clínica como agente anticoagulante e antitrombótico, principalmente, por se ligar à antitrombina (AT) e ao cofator II da heparina (HCII), acelerando a taxa com que estes inibidores de serino proteases inativam enzimas da coagulação, como a !- trombina e o fator Xa. Embora eficaz, a heparina pode causar, entre outros efeitos adversos, sangramento e trombocitopenia, além de ser obtida a partir do intestino suíno e pulmão bovino, gerando grande preocupação com contaminação por patógenos animais. Na busca por agentes anticoagulantes e antitrombóticos alternativos à heparina e de origem não animal, uma glicoglucuronomanana extraída da goma de exsudato de Vochysia thyrsoidea (VTh; MW = 92.500 g/mol) foi hidrolisada (Ph-VTh; MW = 58.250 g/mol) e quimicamente sulfatada (VThS e Ph- VThS). O grau de substituição por grupos sulfato (DS) foi determinado para VThS (0,20) e Ph-VThS (0,24). Esses baixos valores de DS resultaram em pouca diferença nos espectros de RMN dos polissacarídeos antes e após a sulfatação. A análise de metilação indicou que a sulfatação ocorreu, preferencialmente, na posição O-5 de unidades de arabinose no polissacarídeo nativo, e na posição O-6 de unidades de manose no polissacarídeo hidrolisado. Teste de aPTT mostrou que os polissacarídeos sulfatados apresentam atividade anticoagulante (8,59 UI/mg - VThS e 2,67 UI/mg - Ph-VThS), e que esta atividade pode ser inibida por protamina. Na avaliação do mecanismo de anticoagulação, VThS e Ph-VThS mostraram uma resposta do tipo serpino-dependente, conseguindo inibir a !-trombina e o fator Xa apenas na presença de AT e HCII. No modelo in vivo de trombose venosa, VThS e Ph-VThS reduziram a formação do trombo em aproximadamente 50%, na dose de 40 UI/kg, alcançando resultados estatisticamente similares aos da heparina em todas as concentrações testadas. A administração dos polissacarídeos em ratos por via subcutânea, seguida de avaliação do aPTT 2 e 3 VTh após, mostrou que Ph- VThS é absorvido por esta via e que o efeito anticoagulante diminuiu da segunda para a terceira hora, sugerindo sua biodegradação e/ou excreção. Os resultados obtidos demonstram que os polissacarídeos obtidos a partir da goma de exsudato de V. thyrsoidea, quando sulfatados, são promissores agentes anticoagulantes e antitrombóticos. Palavras chave: Glicoglucuronogmanana, sulfatação química, atividade anticoagulante, atividade antitrombótica. / Abstract: Heparin is a highly sulfated glycosaminoglycan that has great clinical importance as an anticoagulant and antithrombotic agent, mainly by binding to antithrombin (AT) and heparin cofactor II (HCII), accelerating the rate at which these inhibitors of serine proteases inactivate enzymes of the coagulation cascade, such as !-thrombin and factor Xa. Although effective, heparin can cause, among other adverse effects, bleeding and thrombocytopenia, as well as being obtained from bovine lungs and porcine intestines, generating great concern about contamination with animal pathogens. In the search for anticoagulant and antithrombotic agents from a nonanimal source, as alternatives to heparin, a glycoglucuronomannan from the gum exudate of Vochysia thyrsoidea (VTh; MW = 92,500 g/mol) was hydrolyzed (Ph-VTh; MW = 58,250 g/mol) and chemically sulfated (VThS and Ph-VThS). The degree of substitution (DS) was determined for VThS (0.20) and Ph-VThS (0.24). These low DS values resulted in little differences in the NMR spectra of the polysaccharides before and after sulfation. Methylation analysis indicated that sulfation occurred preferentially at the O-5 position of arabinose units in the native polysaccharide, and at the O-6 position of mannose units in the hydrolyzed polysaccharide. aPTT test showed that sulfated polysaccharides have anticoagulant activity (8.59 IU/mg - VThS and 2.67 IU/mg - Ph-VThS), and this activity can be inhibited by protamine. In the evaluation of anticoagulation mechanism, VThS and Ph-VThS showed a serpindependent response, inhibiting !-thrombin and factor Xa only in the presence of AT and HCII. In in vivo model of venous thrombosis, VThS and Ph-VThS reduced thrombus formation approximately 50% at a dose of 40 IU/kg, reaching statistically similar results to heparin in all concentrations tested. The administration of the polysaccharides in rats by subcutaneous route, followed by aPTT evaluation 2 and 3 hours later, showed that Ph-VThS is absorbed by this route and that the anticoagulant effect decreased from the second to the third hour, suggesting their degradation and/or excretion. The results showed that polysaccharides obtained from the gum exudate of V. thyrsoidea, when sulfated, are promising anticoagulant and antithrombotic agents. Keywords: Glycoglucuronomannan, chemical sulfation, anticoagulant activity, antithrombotic activity.

A produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 foi testada em diferentes subprodutos da indústria de alimentos. Farelo de soja foi o meio escolhido para determinar o efeito de três variáveis (temperatura, pH inicial e concentração do substrato) sobre a atividade antimicrobiana pela metodologia de superfície de resposta, utilizando um experimento fatorial 23. Na faixa estudada, temperatura e pH inicial do meio apresentam efeito significativo sobre a produção de atividade antimicrobiana, já a concentração do substrato não teve nenhum efeito significativo. Os dados mostraram produção máxima em pH inicial entre 7,0 e 8,5 e temperatura entre 39 e 42ºC. Nessas condições a produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 em farelo de soja foi comparada com a produção em meio de cultivo comercial (caldo BHI). Os resultados obtidos para os dois meios de cultura foram semelhantes, indicando que o farelo de soja pode ser um substrato de baixo custo para produção de antimicrobianos por Bacillus sp. P11. Para demostrar o efeito da temperatura e do pH na produção de peptídeos antimicrobianos, verificou-se a expressão de sboA (subtilosina A) e ituD (iturina A) em Bacillus sp. P11, utilizando a metodologia de qRT-PCR. A produção de subtilosina A e iturina A foi confirmada por espectrometria de massas. A expressão de sboA e ituD foi fortemente afetada pelo pH e pela temperatura e qRT-PCR provou ser uma poderosa ferramenta para investigar o potencial da cepa em produzir subtilosina A e iturina A. Além disso, a produção de peptídeos antimicrobianos por Bacillus sp. P11 foi investigada na presença de células inativadas termicamente de bactérias e fungos. A cepa exibiu maior atividade antimicrobiana na presença de células inativadas de Staphylococcus aureus ou Aspergillus parasiticus. Nessas condições a expressão de genes essenciais relacionadas com a biossíntese dos peptídeos antimicrobianos surfactina, iturina A, subtilosina A e fengicina foi investigada por qRT-PCR. Os resultados sugerem que o aumento da atividade antimicrobiana foi relacionado com a produção de iturina A, um peptídeo antimicrobiano que mostra forte atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de fungos e pode ser usado no controle biológico de doenças de plantas. Por fim, foram testadas diferentes metodologias para a purificação parcial dos peptídeos antimicrobianos produzidos por Bacillus sp. P11. Os melhores resultados foram obtidos por partição em sistema aquoso bifásico com o sal sulfato de zinco, porém estudos adicionais são necessários. / Production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 was tested in different byproducts of food industry. Soybean meal was the selected medium to determine the effect of three variables (temperature, pH and substrate concentration) on the antimicrobial activity by response surface methodology, using a 23 factorial design. In the range studied, temperature and initial pH of the medium had a significant effect on the production of antimicrobial activity and substrate concentration had no significant effect. The data showed maximum production at initial pH between 7.0 and 8.5 and temperature between 39 and 42°C. Under these conditions the production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 in soybean meal was compared with the commercial medium (BHI). The results for both culture media were similar, indicating that soybean meal can be a low cost substrate for the production of antimicrobial activity of Bacillus sp. P11. To demonstrate the effect of temperature and pH on the production of antimicrobial peptides, we studied the expression of sboA (subtilosin A) and ituD (iturin A) in Bacillus sp. P11, using qRT-PCR methodology. The production of subtilosin A and iturin A was confirmed by mass spectrometry. The expression of sboA and ituD was strongly affected by pH and temperature and qRT-PCR proved to be a powerful tool to investigate the potential of the strain to produce subtilosin A and iturin A. In addition, the production of antimicrobial peptides by Bacillus sp. P11 was investigated in the presence of thermally inactivated cells of bacteria and fungi. The strain exhibited higher antimicrobial activity in presence of inactivated cells of Staphylococcus aureus or Aspergillus parasiticus. Under these conditions the expression of essential genes related to biosynthesis of antimicrobial peptides surfactin, iturin A, subtilosin A and fengycin was investigated by qRT-PCR. The results suggest that the increase in antimicrobial activity was related to the production of iturin A, an antimicrobial peptide that shows strong antimicrobial activity against a broad spectrum of fungi and can be used in biological control of plant diseases. Finally, we tested different methods for partial purification of antimicrobial peptides produced by Bacillus sp. P11. The best results were obtained by partition in aqueous two-phase system with the salt zinc sulfate, but further studies are needed.

Tese (doutorado) - Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2008. / Submitted by Allan Magalhães (allanout@gmail.com) on 2011-07-01T22:06:55Z No. of bitstreams: 1 2008_WaleriaRodovalho.pdf: 6769419 bytes, checksum: b890debd0eff31ccefdb61989c1c7194 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-07-08T14:46:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_WaleriaRodovalho.pdf: 6769419 bytes, checksum: b890debd0eff31ccefdb61989c1c7194 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-08T14:46:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_WaleriaRodovalho.pdf: 6769419 bytes, checksum: b890debd0eff31ccefdb61989c1c7194 (MD5) / A biotina (1), uma vitamina pertencente ao complexo B, tem sido um alvo sintético atrativo devido a sua atividade biológica e aplicações em diferentes áreas como imunologia, radioterapia e bioanalítica. Nessa tese comunicamos alguns resultados experimentais para uma síntese alternativa da biotina, utilizando a hidantoína (146) como material de partida. Os compostos N-benzilado e N,N-dibenzilado, 147a e 147b, bem como os derivados 147c, 147d e 147e foram obtidos pela alquilação e acilação, respectivamente, da hidantoína. Os intermediários 147a-147e foram submetidos à condensação aldólica cruzada com 6-oxo-hexanoato de metila (148), mediada por t-BuOK 1M em THF a 0 ºC. Essas reações ocorreram somente com os compostos 147c-e, que foram convertidos no isômero Z 150a. A reatividade e influência dos grupos protetores de 147a-e e de respectivos enolatos 147a`-f` foram estudados pelo método quantum de DFT, o qual se tornou uma ferramenta útil para predizer o comportamento, em condições experimentais, desses compostos na condensação aldólica. A adição 1,4 de tioglicolato de metila (166) aos compostos 150a e 150d (protegido com Boc) foram realizadas com Et3N e a base quiral cinchonina. Para o derivado 150a, a adição conjugada com ambas as bases produziu uma mistura isomérica de 151a. Resultados similares foram obtidos para 150d usando Et3N nas mesmas condições experimentais. No entanto, a reação conjugada com esse derivado, promovida pelo alcalóide cinchonina, formou provavelmente o diastereoisômero SS 151d, confirmado pelos dados espectroscópicos (RMN 1H). As tentativas de ciclização de 151a e 151d para gerar o anel tetra-hidrotiofênico da biotina (1) não forma bem sucedidas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biotin (1), a member of the vitamin B complex group, has been an attractive synthetic target due to its biological activity and its applications in different fields such as immunology, radiotherapy and bioanalytical chemistry. In this thesis we report some experimental results for an alternative biotin synthesis, using hydantoin (146) as starting material. The N-benzylated and N,N-dibenzylated compounds, 147a and 147b, as well as the derivatives 147c, 147d and 147e were obtained by alkylation and acylation, respectively, from hydantoin. The intermediates 147a-147e were submitted to crossed aldol condensations with methyl 6-oxo-hexanoate (148), mediated by 1M of tert butoxide of potassium. These reactions occurred only with the compounds 147c-e which were converted into the Z isomer 149a. The reactivity and influence of the protective groups of 147a-e and of respective enolate ions 147a´-f´ were studied by DFT quantum method, which showed to be a useful tool for predicting the experimental behavior of such compounds undergoing an aldol condensation. The 1,4-addition of methyl thioglycolate (166) to the compounds 150a and 150d (protected with Boc) were accomplished with triethylamine and the chiral base cinchonine. For the derivative 150a, the conjugated addition with both bases produced an isomeric mixture of 151a. Similar result for 150d was obtained using triethylamine under same experimental conditions. However, the conjugated reaction with this derivative, promoted by the alkaloid cinchonine, probably formed the SS diastereomer 151d, confirmed by spectroscopic data (1H NMR). However, the cyclization step for 151a and 151d did not to lead to the desired tetrahydrothiophenic ring of biotin (1).

A produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 foi testada em diferentes subprodutos da indústria de alimentos. Farelo de soja foi o meio escolhido para determinar o efeito de três variáveis (temperatura, pH inicial e concentração do substrato) sobre a atividade antimicrobiana pela metodologia de superfície de resposta, utilizando um experimento fatorial 23. Na faixa estudada, temperatura e pH inicial do meio apresentam efeito significativo sobre a produção de atividade antimicrobiana, já a concentração do substrato não teve nenhum efeito significativo. Os dados mostraram produção máxima em pH inicial entre 7,0 e 8,5 e temperatura entre 39 e 42ºC. Nessas condições a produção de atividade antimicrobiana por Bacillus sp. P11 em farelo de soja foi comparada com a produção em meio de cultivo comercial (caldo BHI). Os resultados obtidos para os dois meios de cultura foram semelhantes, indicando que o farelo de soja pode ser um substrato de baixo custo para produção de antimicrobianos por Bacillus sp. P11. Para demostrar o efeito da temperatura e do pH na produção de peptídeos antimicrobianos, verificou-se a expressão de sboA (subtilosina A) e ituD (iturina A) em Bacillus sp. P11, utilizando a metodologia de qRT-PCR. A produção de subtilosina A e iturina A foi confirmada por espectrometria de massas. A expressão de sboA e ituD foi fortemente afetada pelo pH e pela temperatura e qRT-PCR provou ser uma poderosa ferramenta para investigar o potencial da cepa em produzir subtilosina A e iturina A. Além disso, a produção de peptídeos antimicrobianos por Bacillus sp. P11 foi investigada na presença de células inativadas termicamente de bactérias e fungos. A cepa exibiu maior atividade antimicrobiana na presença de células inativadas de Staphylococcus aureus ou Aspergillus parasiticus. Nessas condições a expressão de genes essenciais relacionadas com a biossíntese dos peptídeos antimicrobianos surfactina, iturina A, subtilosina A e fengicina foi investigada por qRT-PCR. Os resultados sugerem que o aumento da atividade antimicrobiana foi relacionado com a produção de iturina A, um peptídeo antimicrobiano que mostra forte atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de fungos e pode ser usado no controle biológico de doenças de plantas. Por fim, foram testadas diferentes metodologias para a purificação parcial dos peptídeos antimicrobianos produzidos por Bacillus sp. P11. Os melhores resultados foram obtidos por partição em sistema aquoso bifásico com o sal sulfato de zinco, porém estudos adicionais são necessários. / Production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 was tested in different byproducts of food industry. Soybean meal was the selected medium to determine the effect of three variables (temperature, pH and substrate concentration) on the antimicrobial activity by response surface methodology, using a 23 factorial design. In the range studied, temperature and initial pH of the medium had a significant effect on the production of antimicrobial activity and substrate concentration had no significant effect. The data showed maximum production at initial pH between 7.0 and 8.5 and temperature between 39 and 42°C. Under these conditions the production of antimicrobial activity by Bacillus sp. P11 in soybean meal was compared with the commercial medium (BHI). The results for both culture media were similar, indicating that soybean meal can be a low cost substrate for the production of antimicrobial activity of Bacillus sp. P11. To demonstrate the effect of temperature and pH on the production of antimicrobial peptides, we studied the expression of sboA (subtilosin A) and ituD (iturin A) in Bacillus sp. P11, using qRT-PCR methodology. The production of subtilosin A and iturin A was confirmed by mass spectrometry. The expression of sboA and ituD was strongly affected by pH and temperature and qRT-PCR proved to be a powerful tool to investigate the potential of the strain to produce subtilosin A and iturin A. In addition, the production of antimicrobial peptides by Bacillus sp. P11 was investigated in the presence of thermally inactivated cells of bacteria and fungi. The strain exhibited higher antimicrobial activity in presence of inactivated cells of Staphylococcus aureus or Aspergillus parasiticus. Under these conditions the expression of essential genes related to biosynthesis of antimicrobial peptides surfactin, iturin A, subtilosin A and fengycin was investigated by qRT-PCR. The results suggest that the increase in antimicrobial activity was related to the production of iturin A, an antimicrobial peptide that shows strong antimicrobial activity against a broad spectrum of fungi and can be used in biological control of plant diseases. Finally, we tested different methods for partial purification of antimicrobial peptides produced by Bacillus sp. P11. The best results were obtained by partition in aqueous two-phase system with the salt zinc sulfate, but further studies are needed.

Metilmercúrio (MeHg), a forma orgânica do mercúrio, é um dos poluentes de maior risco ao ambiente. MeHg é uma potente neurotoxina, principalmente durante o desenvolvimento do sistema nervoso central. A neurotoxicidade induzida pelo MeHg no período pré-natal pode causar desordens mentais, paralisia cerebral e convulsões. Nós investigamos o imunoconteúdo de S100B no fluído cerebroespinal (FCE) e no tecido encefálico, uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada pelos astrócitos, na qual tem uma atividade trófica e tóxica, dependendo da sua concentração. Ratas grávidas foram expostas ao MeHg (5 mg/kg/dia) no 12°, 13° e 14° dias de gestação. O fluído cerebroespinal e o tecido encefálico (mais especificamente hipocampo, córtex cerebral e cerebelo) foram obtidos dos neonatos no 1°, 15° e 30° dia pós-natal. O acúmulo de MeHg foi medido do tecido encefálico após o nascimento e aos 30 dias de vida. Um aumento da S100B no FCE foi observado aos 15 dias de vida pós-natal, mas desapareceu aos 30 dias. No tecido hipocampal mostrou um aumento da S100B (e redução da proteína ácida fibrilar glial) imediatamente após nascimento, mas não posteriormente. Nenhuma mudança foi observada no teste cognitivo (labirinto aquático) desses ratos em idade adulta. Nossos resultados reforçam o envolvimento glial na neurotoxicidade induzida pelo MeHg. As mudanças no hipocampo ao nascimento, poderiam estar relacionadas com as desordens cognitivas e epilépticas atribuídas ao MeHg. O aumento da S100B no FCE reforça a hipótese de que o aumento da S100B está relacionado a danos no sistema nervoso central. Embora, o mecanismo celular envolvido no aumento do conteúdo da S100B no FCE seja desconhecido, os resultados sugerem que a S100B possa ser usada como um marcador periférico na injúria induzida pelo MeHg.

Esta pesquisa desenvolve uma análise da formação de grupos educacionais que se estabeleceram fora do espaço instituído das faculdades de educação e passaram a ocupar um lugar nos institutos ou departamentos de bioquímica, configurando, desta forma, um novo lugar de saber que passou a ser chamado de Educação em Bioquímica. A proposta de análise é a busca de condições históricas para emergência desses grupos, bem como um entendimento de como essa formação se deu dentro das Sociedades que congregam os pesquisadores em bioquímica e, para operacioná-la, partiu-se de uma perspectiva pós-estruturalista e pós-moderna de investigação, inspirada nos entendimentos de história, ciências e educação de dois pensadores sociais que são Jean-François Lyotard e Michel Foucault. Em função da produtividade crescente no novo campo de saber da Educação em Bioquímica e das diferentes abordagens percebidas nas apresentações em eventos da comunidade de bioquímicos, passou-se a investigar três desses grupos no seu movimento diário de pesquisa, procurando perceber as estratégias de validação do conhecimento de cada grupo, suas semelhanças e diferenças no campo da Educação Bioquímica, seus possíveis embates e, principalmente, suas positividades em termos de produção do saber num campo de conhecimentos que se organiza entre dois estabelecidos e distintos campos de conhecimento: das ciências educacionais e das ciências da vida. Uma das questões importantes nas perspectivas pós-modernas e pós-estruturalistas em educação é a possibilidades de ler textos que estão visibilizados de outras formas que não as da fala e da escrita. A possibilidade de mostrar como os lugares podem dizer de seus ocupantes e das suas relações, também, é uma abordagem que esse trabalho de pesquisa evidencia, bem como, traz à discussão as diferenças das linguagens características de um fazer científico e de um fazer educacional tendo como pano de fundo as falas da Educação em Bioquímica. Pretende-se mostrar que as linguagens dos campos de origem - bioquímica e educação – conformam e determinam um modo de literatura que oscila entre esses dois saberes e que de alguma forma reproduz em microescala uma discussão maior que acontece entre as ciências da vida e as ciências humanas. Enfim, procurou-se mapear a emergência histórica, a produção e a produtividade de alguns grupos importantes na área, as formas de legitimação e os processos de construção e sobrevivência desses grupos que trabalham nos limiares do saber.