Spelling suggestions: "subject:"bioquímica - angiologia"" "subject:"bioquímica - algiologia""
111 |
Desarrollo de una plataforma de tilling en melón (Cucumis melo L.)González To, Mireia 18 March 2014 (has links)
El trabajo descrito en esta tesis doctoral se enmarca dentro del proyecto MELOGEN (GEN2013‑
20237, 2004‑2007) uno de cuyos objetivos era la construcción de una plataforma de TILLING en
melón.
La disponibilidad de recursos genéticos y genómicos para el melón se ha incrementado a lo largo
de los últimos años e incluso la secuencia del genoma está disponible. Sin embargo, las
herramientas genómicas para determinar la funcionalidad de los genes en esta especie son
todavía limitadas. El TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) es un método de
genética inversa mediante el cual se pueden crear e identificar nuevas mutaciones en genes
candidatos y observar su efecto fenotípico. Además, también se pueden detectar fenotipos de
interés para posteriormente identificar la mutación responsable de los mismos.
En este trabajo se ha desarrollado una población de TILLING en Cucumis melo a partir de la línea
doble haploide del tipo “Piel de Sapo” M62‑113. Aplicando inicialmente el mutágeno químico
EMS (Etil Metano Sulfonato) sobre 17.000 semillas se ha desarrollado una colección de mutantes
compuesta por 3.268 familias M2. A partir de 400 familias M2 se observaron diversos fenotipos
mutantes en las diferentes etapas de crecimiento de la planta. Algunos de estos mutantes se han
descrito con detalle generando un catálogo de los fenotipos observados en cada familia, algunos
de los cuales pueden tener interés comercial.
Para medir la tasa de mutación de la población se han analizado cuatro genes, la fitoeno
desaturasa PDS, los factores de iniciación de la traducción eIF4E y eIF(iso)4E y el receptor de
etileno ETR1. Los mutantes detectados han permitido calcular la tasa de mutación de la
población, una mutación cada 1,5 Mb. En el caso de PDS se ha podido obtener un mutante con
fenotipo albino, demostrando así la efectividad del método TILLING en melón. Además,
paralelamente se analizaron los mismos genes en otra población mutagenizada independiente.
También se realizó un estudio de EcoTILLING con 113 accesiones de melón y se identificaron 19
haplotipos distintos en el gen eIF4E, uno de ellos, con un SNP que provoca un cambio de
aminoácido y que sólo se encuentra en la accesión PI 505602 y dos haplotipos en el gen ETR1, uno
de los cuales también contiene un SNP que provoca un cambio de aminoácido.
El TILLING facilitará los estudios de genética inversa en melón y abre la puerta a futuros
estudios de genómica funcional en un genoma recientemente secuenciado. Este trabajo ha
representado también el primer paso para poder desarrollar nuevas poblaciones de TILLING en
melón con mayores tasas de mutación y en otros fondos genéticos. / The work described in this thesis is part of the MELOGEN project (GEN2013‑20237, 2004‑2007)
one of whose goals was to build a melon TILLING platform.
The availability of genetic and genomic resources in melon has increased over recent years, and
even the sequence of the genome is available. However, genomic tools to determine the
functionality of genes in this species are still limited. TILLING (Targeting Induced Local
Lesions IN Genomes) is a reverse genetics method by which you can create and identify new
mutations in candidate genes and observe their phenotypic effect. Furthermore, it is also
possible to detect phenotypes of interest in order to identify their responsible mutation.
In this project we developed a TILLING population in Cucumis melo L. in the double haploid
M62‑113 line from the ʺPiel de Sapoʺ type. Applying the chemical mutagen EMS (Ethyl methane
sulfonate) over 17,000 seeds we have developed a collection of mutants consisting of 3268 M2
families. Phenotypic mutants were observed in 400 M2 families in different stages of plant
growth during the development of the population. Some mutant phenotypes have been
described and identified in detail by generating a catalogue of phenotypic changes. Some of
these phenotypes may have a commercial interest.
We have analysed four genes to identify the rate of mutation in the population: Phytoene
desaturase (PDS), Eukaryotic translation initiation factors (eIF4E and eIFiso4E) and the Ethylene
receptor (ETR1). Mutants detected allowed to calculate the mutation rate of the population, one
mutation per 1.5 Mb. For PDS we were able to obtain a mutant with an albino phenotype,
demonstrating the effectiveness of TILLING method in melon. Moreover, in parallel the same
genes were analyzed in another independent mutagenized population.
A study of Ecotilling was also performed in 113 melon accessions and 19 different haplotypes in
the eIF4E gene were obtained. One of them contained a SNP that causes an amino acid change
and was only found in the accession PI 505602 and two other haplotypes were found in the
ETR1 gene, one of which also contains a SNP that causes an amino acid change.
TILLING will facilitate reverse genetics studies in melon and opens the possibility of
performing future functional genomics studies in a newly sequenced genome. This work has
also represented the first step to developing new melon TILLING populations with higher rates
of mutation and in other genetic backgrounds.
|
112 |
Contribución al fenotipado molecular de tumores cerebrales preclínicos mediante estudios in vitro e in vivoMartín Sitjar de Togores, Juana 04 November 2013 (has links)
Los tumores del sistema nervioso central (SNC) abarcan menos de un 2 % del total de casos de cáncer diagnosticados cada año a nivel mundial (aproximadamente 175.000) representado entre 0,4 y 25,4 de casos por 100.000 adultos. A pesar de ello, constituyen una fuente importante de mortalidad y discapacidad.
Actualmente los conocimientos que se tienen sobre el desarrollo de los tumores es reducido, porque en la mayor parte de los casos los tumores cerebrales se detectan en estado avanzado de desarrollo (como consecuencia, principalmente, de la aparición de síntomas que llevan al paciente a indagar sobre su estado). Es por esto que se tienen pocos datos de las fases iniciales de desarrollo de estos tumores. Por tanto, es necesario esclarecer el fenotipo molecular de la progresión de tumores cerebrales in vivo, con el objeto de conocer mejor su evolución y poder así mejorar su detección, ya que cuanto más se tarde en alcanzar el diagnóstico correcto, más se reducen las posibilidades de la persona afectada de sobrevivir al tumor.
El trabajo de esta tesis, se ha centrado en intentar comprender los lípidos móviles. Cuando se habla de lípidos móviles (ML, en la abreviatura clásica anglosajona) visibles por espectroscopía de RMN, se hace referencia básicamente a las resonancias provenientes de las cadenas de ácidos grasos de lípidos neutros en triacilgliceroles, apareciendo las más características a 0,9, 1,3, 2,0 y 5,3 ppm. El interés por entender el origen celular de estas resonancias proviene de su aparición en numerosas muestras biológicas, tanto asociadas con malignidad y muerte celular como con procesos benignos como diferenciación y variación de la velocidad de proliferación. Actualmente no se conoce el significado celular de los cambios vistos en espectroscopia de resonancia magnética en los lípidos móviles, aunque se cree que se trata más bien de cambios biofísicos más que bioquímicos, ya que se ha comprobado que su concentración no varía, lo que varía es la detección mediante MRS. Para obtener más información sobre el origen celular de los lípidos móviles, se trabajó con cultivos celulares de células de glioma de rata (C6) que se estudiaron con HR-MAS a diferentes velocidades para estudiar el efecto de dicha velocidad en la “visualización” de dichos lípidos móviles. Así mismo, se desarrollaron modelos in vitro de gotículas celulares y se inmovilizaron dichos modelos para ver cómo afectaba a la “visualización” de lípidos móviles.
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón (¹H MRS) se presenta como una posible alternativa para la caracterización de tumores cerebrales, ya que es una técnica que permite obtener información, de forma no invasiva, de la presencia de algunos productos del metabolismo celular. Con estos datos se pretende esclarecer el fenotipo molecular de tumores cerebrales in vivo, lo que nos permitiría reconocer patrones que nos ayuden a identificar los diferentes tipos de tumores cerebrales. Siguiendo este objetivo, en esta tesis se trabajó con modelos preclínicos de ratón con glioblastoma, oligodendroglioma de grado II y III y parénquima cerebral sano y se desarrollaron cuatro clasificadores de tipo y grado tumoral nuevos para tumores cerebrales preclínicos en ratón mediante el uso del programa Spectra Classifier aplicado a matrices de datos de imagen espectroscópica (IERM). / Central nervous system tumors (CNS) represent less than 2% of all cases of cancer diagnosed each year worldwide (approximately 175,000), which means between 0.4 and 25.4 cases per 100,000 adults. Despite this, they constitute an important source of mortality and disability.
Current knowledge about the etiology of these tumors is scarce, because in most cases they are detected when they are already in an advanced state, when symptoms appear. Due to this fact, there is not much information about the early stages of development of those tumors. Therefore, it is necessary research on the progression of the molecular phenotype of brain tumors in vivo, in order to better understand their evolution and improve their detection, because the time spent to achieve the correct diagnosis may reduce the survival possibilities of the person afflicted by the pathology.
Work in this thesis has mostly focused on mobile lipids. Mobile lipids (ML), visible by NMR spectroscopy, are resonances from fatty acyl chains of neutral lipids in triacylglycerols, the most characteristic of them resonating at frequencies of 0.9, 1.3, 2.0 and 5.3 ppm. The interest in understanding the cellular origin of those resonances arises from their presence in many biological tissues, associated with malignancy and cell death, as well as with benign processes such as differentiation or with changes in the proliferation rate.
Currently, the cellular meaning of the changes observed with magnetic resonance spectroscopy in ML remains unknown. One hypothesis is that it could be associated to biophysical rather than biochemical changes, since it is not the concentration of ML that changes, but their detectability by MRS. In order to obtain more information about the cellular origin of ML, the work of this thesis was performed on rat glioma cells (C6) and High-resolution, Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR spectroscopy, at different spinning rates, to evaluate how such spinning rate affects the "visualization" of ML. Also, an in vitro model of artificial liipid droplets was developed. These artificial lipid droplets were than immobilized into a solid support to see how this would perturbate their NMR "visibility".
Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (¹ H MRS) in vivo, is also a feasible alternative for the preoperative characterization of brain tumors, since it is a technique that allows to obtain information, in a non-invasive way, about the presence of products of cellular metabolism. In vivo ¹ H MRS data were also used in this thesis to clarify the molecular phenotype of brain tumors in vivo, thus allowing to recognize patterns that may be of help to identify the different types of brain tumors. To reach this goal, magnetic resonance spectroscopic imaging data from preclinical mouse models with glioblastoma, grade II and III oligodendroglioma and healthy brain parenchyma were used to develop four tumor type and grade classifiers using the program Spectra Classifier.
|
113 |
Structural modeling and functional characterization of mammalian cytosolic carboxypeptidases 2 and 3Tort Regàs, Olívia 15 October 2014 (has links)
Aquesta
tesis
s’emmarca
en
el
camp
de
les
carboxipeptidases
citosòliques
de
mamífers,
centrant-‐se
particularment
en
els
membres
2
i
3
d’aquesta
subfamília
de
metalocarboxipeptidases.
Aquest
treball
constitueix
el
primer
estudi
sobre
la
funció
d’aquests
enzims
a
través
d’aproximacions
in
silico,
in
vitro
i
in
vivo.
Aquesta
tesis
consta
de
les
parts
descrites
a
continuació.
El
primer
capítol
introdueix
el
camp
de
les
matalocarboxipeptidases,
els
microtúbuls,
les
modificacions
post-‐traduccionals
de
la
tubulina
i
estableix
els
objectius
de
la
tesi.
El
segon
capítol
és
una
compilació
dels
procediments
experimentals
i
materials
utilitzats
en
el
treball
experimental.
El
tercer
capítol
presenta
la
caracterització
funcional
de
la
carboxipeptidasa
citosòlica
3
humana.
Els
resultats
d’aquest
estudi
han
estat
la
base
pel
quart
capítol,
on
es
descriu
la
funció
de
la
CCP2.
Ambdues
CCP2
i
CCP3
isoformes
de
ratolí
s’estudien
mitjançant
enginyeria
de
proteïnes
i
utilitzant
els
models
de
ratolí
knockout
de
CCP2
i
CCP3.
Els
capítols
III
i
IV
es
subdivideixen
en
un
resum
del
capítol,
els
resultats
que
descriuen
el
detall
dels
descobriments
i
una
discussió.
A
continuació
es
presenta
una
discussió
general
sobre
CCP2
i
CCP3,
el
seu
rol
en
la
cèl·∙lula
i
en
el
context
de
la
subfamília
de
carboxipeptidases
que,
en
mamífers,
consta
de
sis
gens
codificants
per
enzims
amb
activitat
deglutamilasa.
La
tesis
finalitza
amb
un
resum
de
les
conclusions.
El
capítol
IV
juntament
amb
els
experiments
de
modelat
estructural
del
capítol
III
són
la
base
de
la
següent
publicació
científica:
Tort
O,
Tanco
S,
Rocha
C,
Bièche
I,
Seixas
C,
Bosc
C,
Andrieux
A,
Moutin
MJ,
Avilés
FX,
Lorenzo
J,
Janke
C.
The
cytosolic
carboxypeptidases
CCP2
and
CCP3
catalyze
posttranslational
removal
of
acidic
amino
acids.
MBoC.
doi:10.1091/mbc.E14-‐06-‐1072 / This
thesis
is
situated
in
the
field
of
the
mammalian
cytosolic
carboxypeptidases,
particularly
focusing
in
members
2
and
3
from
this
subfamily
of
metallocarboxypeptidases.
This
work
gives
insight
for
the
first
time
into
the
role
of
those
enzymes
by
in
silico,
in
vitro
and
in
vivo
approaches.
The
thesis
is
divided
in
parts
as
described
below.
The
first
chapter
introduces
the
fields
of
metallocarboxypeptidases,
microtubules,
tubulin
posttranslational
modifications
and
settle
the
objectives
of
the
thesis.
The
second
chapter
is
a
compilation
of
the
experimental
procedures
and
materials
used
for
the
experimental
work.
The
third
chapter
presents
the
functional
characterization
of
human
cytosolic
carboxypeptidase
3.
The
results
from
this
study
were
the
basis
for
chapter
four,
where
the
function
of
CCP2
is
described
and
both
CCP2
and
CCP3
mouse
isoforms
are
studied
by
protein
engineering
and
using
CCP2
and
CCP3
knock-‐out
mouse
models.
Chapters
III
and
IV
are
subdivided
into
a
summary
of
the
chapter,
the
results
describing
the
findings
in
detail
and
a
discussion.
The
following
chapter
sets
a
general
discussion
on
CCP2
and
CCP3,
their
role
in
the
cell
and
in
the
context
of
a
family,
in
mammals,
of
six
genes
coding
deglutamylating
enzymes.
A
final
section
includes
a
summary
of
the
conclusions.
Chapter
IV
together
with
the
modeling
experiments
form
Chapter
III
is
the
basis
of
the
following
scientific
paper:
Tort
O,
Tanco
S,
Rocha
C,
Bièche
I,
Seixas
C,
Bosc
C,
Andrieux
A,
Moutin
MJ,
Avilés
FX,
Lorenzo
J,
Janke
C.
The
cytosolic
carboxypeptidases
CCP2
and
CCP3
catalyze
posttranslational
removal
of
acidic
amino
acids.
MBoC.
doi:10.1091/mbc.E14-‐06-‐1072
|
114 |
Nous reguladors en la via de WntVinyoles i Vergés, Meritxell 10 October 2014 (has links)
La via canònica de Wnt és essencial pel desenvolupament embrionari i per la proliferació cel·lular. A més, la desregulació d’aquesta via causa diferents malalties, com per exemple el càncer. La unió del lligand Wnt als receptors específics promou la fosforilació de Dvl-2 per una quinasa directament associada a p120-catenina, la CK1ε, i indueix una cascada d’activació que inhibeix l’activitat de la quinasa GSK-3 sobre la β-catenina. Com a resultat, la β-catenina s’estabilitza i es transloca al nucli on activa l’expressió de gens diana.
Els nostres resultats expliquen com la CK1ε és activada ràpidament en Wnt i permet els diferents esdeveniments que acumulen la β-catenina. Prèviament s’havia descrit que la CK1ε presenta un domini autoregulador que inhibeix l’activitat quinasa de la CK1ε quan aquest està fosforilat, suggerint que es necessita una fosfatasa encara no descrita perquè s’activi la senyalització de Wnt. En aquest treball es mostra que la PP2A permet la defosforilació de la CK1ε en Wnt, i també s’ha identificat la PR61ε com la subunitat reguladora de la PP2A que controla l’activació de CK1ε. A més, la PR61ε interacciona directament amb el receptor Fz i s’associa al complex LRP5/6-p120-catenina-CK1ε després de l’activació de Wnt. En global, aquests resultats suggereixen que la PR61ε regula específicament la defosforilació de la CK1ε mediada per la PP2A, i té un paper essencial en la senyalització de Wnt.
Un altre pas determinant de l’activació de la via de Wnt és la inhibició de l’activitat de la GSK-3, tot i que el mecanisme pel qual s’inactiva la quinasa encara és matèria de debat. S’han proposat dos models per explicar-ho, un dependent del reclutament de la GSK-3 al correceptor LRP5/6 fosforilat, que crea un lloc d’inhibició, i l’altre basat en el segrest de la quinasa dins de cossos multivesiculars (MVBs).
Degut a que el nostre grup ha descobert una connexió directa entre les cadherines i la p120-catenina (dues proteïnes involucrades en les unions adherents) amb el correceptor LRP5/6, es va hipotetitzar que les cadherines podrien estar involucrades en l’endocitosi de la GSK-3 dependent dels factors Wnt.
Els nostres resultats demostren que el complex receptor de Wnt que conté la GSK-3, s’internalitza dins de MVBs, i que aquesta endocitosi depèn de la dissociació prèvia de la p120-catenina-cadherina del correceptor LRP5/6. La disrupció de la interacció cadherina-LRP5/6 és regulada per la fosforilació de la cadherina i requereix de la separació prèvia de la p120-catenina. D’aquesta manera, mutants de la p120-catenina i de la cadherina que no es dissocien del complex bloquegen el segrest de la GSK-3 dins de MVBs. Aquests mutants inhibeixen l’acumulació de β-catenina, tot i que no de forma total.
Aquests resultats expliquen com es segresta la GSK-3 dins dels MVBs i suggereixen que aquest mecanisme d’internalització, juntament amb la inhibició de la GSK-3 per la interacció directa amb l’LRP5/6 fosforilat, són necessaris per la completa estabilització de la β-catenina en Wnt. / Canonical Wnt signalling is essential for embryonic development and cell proliferation. Deregulation of this pathway leads to some diseases, such as cancer. Binding of extracellular Wnt ligands to specific receptors induces the phosphorylation of Dvl-2 protein by CK1ε- associated-p120-catenin kinase, and a cascade of events that inhibit the activity of GSK3 kinase on β-catenin. As a result, β-catenin is stabilized and translocated to the nucleus where it activates the expression of target genes.
Our results explain how CK1ε is quickly activated in Wnt signalling, allowing the cascade of events that accumulate β-catenin. It was previously described that CK1ε presents an autoregulation domain which strongly inhibits CK1ε kinase activity when it is phosphorylated, suggesting that a phosphatase is required to activate Wnt signalling. However, which phosphatase dephosphorylates CK1ε in Wnt and how this phosphatase regulates the pathway were not clear. In this study, we have described that PP2A permits the dephosphorylation of CK1ε upon Wnt, and we have also identified PR61ε as the regulatory subunit of PP2A that controls this CK1ε activation. PR61ε directly interacts with Fz receptor, and associates with LRP5/6-p120-catenin-CK1ε complex upon Wnt activation. Taken together, these results suggest that PR61ε specifically regulates PP2A-mediated CK1ε dephosphorylation and plays an essential role in Wnt signaling.
Another key step in the pathway is the local inhibition of GSK3 activity on β-catenin, although the mechanism of this inactivation remains unclear. Two models have been proposed, one dependent on the recruitment and subsequent block of GSK3 by phosphorylated LRP5/6 coreceptor that creates an inhibitory site, and another one based on its sequestration into multivesicular bodies (MVBs).
Since our group has uncovered a physical link between cadherins and p120-catenin (two proteins involved in adherens junctions) with the Wnt coreceptor LRP5/6, we wonder whether cadherins may be involved in the endocytosis of GSK3 triggered by Wnt factors.
Our results demonstrate that Wnt receptor complexes containing GSK3 are internalized into multivesicular bodies and this endocytosis depends on the previous dissociation of p120-catenin and cadherin from LRP5/6 coreceptor. Thus, disruption of cadherin-LRP5/6 interaction is regulated by cadherin phosphorylation and requires the previous release of p120-catenin. Accordingly, p120-catenin and cadherin mutants unable to dissociate from the complex block GSK3 sequestration into MVBs. These mutants substantially inhibit, but do not completely prevent, the β-catenin accumulation caused by Wnt.
These results elucidate how GSK3 is sequestered into MVBs and suggest that this mechanism of internalization together with the inhibition of GSK3 by direct interaction with phosphorylated LRP5/6, are both required for complete β-catenin stabilization upon Wnt stimulation.
|
115 |
Estudi de la relació estructura-funció de les metal·lotioneïnes en sistemes polimòrfics d’animals (eriçó de mar) i de plantes (soja i gira-sol)Tomàs i Giner, Mireia 23 May 2014 (has links)
Les metal·lotioneïnes (MT) constitueixen una superfamília de metal·loproteïnes de baix pes molecular que es caracteritzen pel seu elevat contingut en residus Cys, els quals els confereixen les seues propietats coordinants i reductores. És com a conseqüència d’aquestes propietats que se’ls atribueixen funcions d’homeòstasi i destoxicació de metalls, així com de regulació i protecció en processos redox. Les MT són ubíqües i les seues seqüències són molt diverses. En la present Tesi Doctoral hem tractat d’ampliar els coneixements actuals sobre aquestes metal·loproteïnes i aprofundir en la seua relació estructura-funció. Així, d’una banda s’han analitzat les preferències metàl·liques envers metalls mono- i divalents de les dues isoformes de MT presents en l’eriçó de mar (Strongylocentrotus purpuratus), SpMTA i SpMTB, les quals presenten patrons de Cys alineables. S’ha determinat que SpMTA mostra millors habilitats per a coordinar Zn(II) i Cd(II) que SpMTB i que, en canvi, SpMTB mostra millors propietats per a coordinar Cu(I) que SpMTA. Aquestes preferències metàl·liques s’han relacionat amb una diferenciació funcional en l’organisme. D’altra banda, s’han estudiat els sistemes MT de les plantes de soja (Glycine max) i gira-sol (Helianthus annuus), les quals s’ha vist que sintetitzen representants de les quatre subfamílies en què es divideix la família de les MT de planta, que presenten patrons de Cys no alineables. Així, s’ha determinat que les MT1 i MT2 de gira-sol estudiades (HaMT1 i HaMT2) presenten una major capacitat de coordinació de Cd(II) que les MT1 i MT2 de soja (GmMT1 i GmMT2), probablement a causa del seu major contingut en Cys. A més, s’ha vist que les His C-terminals que ambdues MT3 (GmMT3 i HaMT3) contenen i que es troben semiconservades en la subfamília participen en l’enllaç al Cd(II). MT4 de soja (GmMT4) presenta la mutació natural His54Tyr que trenca amb el patró de Cys i His conservat en la subfamília MT4, la qual s’ha demostrat que suposa una disminució en la capacitat de coordinació de Zn(II). En canvi, tant GmMT4 com MT4 de gira-sol (HaMT4), que presenta el patró típic de Cys i His, presenten capacitats de coordinació de Cd(II) anàlogues, donat que cap de les seues His no participa en l’enllaç al Cd(II). A més, l’estudi de capacitats antioxidants i/o de captadors de radicals lliures de les quatre MT de soja ha permés proposar que la llargària de l’espaiador (regió lliure de Cys) és determinant per a la protecció enfront de l’oxidació de les Cys provocada per l’exposició a peròxid d’hidrogen, així com que Zn-GmMT1 és el complex que ha mostrat les millors propietats per a protegir les cèl·lules davant l’atac de les espècies reactives d’oxigen. / Metallothioneins (MT) constitute a low molecular weight metalloprotein superfamily characterised by their high Cys residue content, which confers them their coordinative and reducing properties. As a result of these properties, MTs are proposed to be involved in homeostasis and metal detoxification functions, as well as in regulation and protection during redox processes. MTs are ubiquitous and their sequences are extremely variable. In this PhD Thesis we have tried to expand the current knowledge about these metalloproteins and to deepen into their structure-function relationship. Thus, on the one hand, the metallic preferences towards mono- and divalent metal ions of the two MT isoforms present in sea urchin (Strongylocentrotus purpuratus), SpMTA and SpMTB, which display alignable Cys patterns, have been analysed. It has been determined that SpMTA shows better Zn(II)- and Cd(II)-binding abilities than SpMTB, and that, on the contrary, SpMTB shows better Cu(I)-binding abilitites than SpMTA. These metallic preferences have been related to a functional differentiation within the organism. On the other hand, the MT systems from the soybean (Glycine max) and sunflower (Helianthus annuus) plants have been studied, which have been proven to synthesise representatives of the four subfamilies in which the plant MT family is divided, and that show non-alignable Cys patterns. Thus, it has been shown that sunflower MT1 and MT2 (HaMT1 and HaMT2) display a greater Cd(II)-binding capacity than MT1 and MT2 from soybean (GmMT1 and GmMT2), probably due to their higher Cys content. In addition, it has been shown that the C-terminal His present in both MT3 (GmMT3 and HaMT3), which are semiconserved within this subfamily, are involved in Cd(II) coordination. Soybean MT4 (GmMT4) presents the natural His54Tyr mutation that breaks the highly conserved Cys and His pattern in MT4 subfamily, which has been shown to provoke a decrease in its Zn(II)-binding capacity. However, both GmMT4 and sunflower MT4 (HaMT4), which presents the typical MT4 Cys and His pattern, show analogous Cd(II) coordination capacities, since none of their His are involved in Cd(II) binding. In addition, the study of the antioxidant and/or free radicals scavenging capacities of the four soybean MTs has allowed to propose that the length of the spacer (Cys-free region) is crucial to protect Cys from the oxidation caused by hydrogen peroxide exposure, and that the Zn-GmMT1 complex has been the best suited to protect the cells against the attack by reactive oxygen species.
|
116 |
Friends or foes in virus-host interactions: Cell regulation of HIV-1 replicationRuiz de Andrés, Alba 05 December 2014 (has links)
El VIH és un patogen intracel·lular obligat i per tant està totalment subjecte als recursos intracel·lulars disponibles. El tractament antiretroviral actual suprimeix la replicació viral però no evita la persistència i la proliferació de les cèl·lules infectades de forma latent, posant en evidència la necessitat de desenvolupar noves estratègies que aconsegueixin eliminar de forma definitiva el virus. El descobriment de nous factors cel·lulars del VIH pot aportar noves dianes per al desenvolupament d’aquestes estratègies. Diversos estudis de cribatge i d’identificació de gens han identificat un número molt elevat de factors cel·lulars del VIH. Per poder traslladar el coneixement científic a la clínica cal un estudi més acurat que defineixi els mecanismes funcionals i la regulació de cadascun d’aquests factors. Partint de l’estudi sobre la dependència del VIH al complex proteic Mediator (MED) i per altra banda de la restricció del VIH mitjançada pel factor antiviral SAMHD1, en aquesta tesi demostro com en les interaccions virus-hoste sovint hi ha un comú denominador en quant a la seva implicació en el metabolisme cel·lular. Aquest tret comú suggereix que els factors cel·lulars del VIH, tot i que en la seva relació estreta amb el virus el potenciïn o l’inhibeixin, alhora sempre són modulats per mecanismes complexes associats a la regulació cel·lular que finalment són els què governen la replicació viral. S’inclou una avaluació de l’activitat MED sobre la replicació del VIH amb la identificació de 9 sobre 28 proteïnes del complex MED que de forma significativa afecten la replicació del VIH, sempre en una etapa posterior a la integració. D’entre les subunitats MED identificades algunes tenen un rol predominant en la transcripció de gens virals inicials i d’altres en la generació de transcrits virals més tardans, però totes comprometen la transcripció del VIH que és induïda per la proteïna viral Tat. Els assaigs de coimmunoprecipitació, a més, han suggerit que aquesta dependència passa per una interacció física entre MED i Tat.
D’entre l’ampli grup de proteïnes cel·lulars que modulen el VIH, només algunes inhibeixen el virus. SAMHD1 ho aconsegueix bloquejant l’enzim del VIH transcriptasa inversa. La seva regulació sobre els nivells de dNTPs intracel·lulars s’investiga al llarg del segon capítol. L’activitat de SAMHD1 influencia la potència dels inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs a nucleòtids, de manera que una reducció intracel·lular dels nivells de SAMHD1 porta a una disminució significativa de la sensibilitat del VIH enfront els inhibidors anàlegs a Timidina. Un estudi molecular més extens ha permès identificar que en els limfòcits T CD4+ proliferants i en els macròfags s’expressa una forma fosforilada de SAMHD1 que correspon amb la susceptibilitat a la infecció. Específicament s’ha identificat CDK6 i ciclina D3 com un complex regulador de CDK2, que alhora controlaria la progressió a cicle cel·lular i la fosforilació de SAMHD1 per tal d’inactivar-lo en cèl·lules T i en macròfags, fent-los susceptibles a la infecció. La inhibició de CDKN1A (ó p21) porta a un alleujament en la restricció de VIH modulada per SAMHD1, generant més replicació viral. L’inhibidor de CDK6 palbociclib confirma la via de senyalització proposada ja que bloqueja efectivament la fosforilació de SAMHD1, els nivells intracel·lulars de dNTP, la transcripció inversa i l’activació de CDK2. En els propers anys l’estudi acurat del factors cel·lulars del VIH-1 permetrà el desenvolupament d’estratègies terapèutiques “anti-VIH” basades en fer diana a l’hoste més que en el virus, donant noves propostes que facin front a les limitacions del tractament antiretroviral. / HIV is an obligate intracellular pathogen and its replication is entirely reliant on intracellular resources, depending on its capacity of recruitment and utilization of a wide array of host proteins to complete the viral life cycle. Current antiretroviral treatments generally suppress viral replication but do not avoid persistence and proliferation of latently infected cells over time, thus not curing HIV/AIDS and evidencing the need to develop new strategies that may finally converge in eliminating the virus. The discovery of human cellular factors could provide new targets for the development of these strategies. Previous siRNA-based screenings and whole-genome studies published a high amount of alleged HIV-1 host factors but their functional mechanisms need to be addressed to translate scientific knowledge into the clinic. By studying both the HIV dependency on a protein complex from the cellular transcriptional machinery called Mediator (MED) and the HIV restriction mediated by the antiviral factor SAMHD1 whose mechanism of regulation is still under debate, I show how viral-host interactions usually converge in their implication on cell metabolism, suggesting that identified host factors that either enhance or inhibit HIV-1 are in turn modulated by cell regulation-associated mechanisms that finally govern viral replication. Concretely, we provide an evaluation of the MED complex activity on HIV replication identifying nine out of 28 human MED proteins significantly affecting HIV replication, all pointing at a post-integration step. Moreover, the identified MED proteins modulating the generation of new viral transcripts were differentially affecting early or late stages of HIV-1 transcription, apart from compromising particularly the HIV transcription induced by the HIV-1 protein Tat. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments also suggested physical interaction between MED and Tat.
Among the high number of cellular proteins modulating HIV, only a few actively inhibit viral replication. SAMHD1 achieves it by blocking the viral reverse transcriptase. Here, the regulation modulating the intracellular dNTP levels is investigated. The influence of SAMHD1 activity on nucleoside reverse transcriptase inhibitors was demonstrated, showing that a reduction of SAMHD1 levels significantly decreased HIV sensitivity solely on thymidine-analogue inhibitors. Proliferating primary CD4+ T cells or macrophages were then observed to express a phosphorylated form of SAMHD1 that corresponded with susceptibility to infection in cell culture and that was not present in non-cycling cells. Identified phosphorylation sites in cycling cells are mainly driven by cyclin-dependent kinases (CDK). In fact, we identified CDK6 and cyclin D3 as an upstream regulator of CDK2 induces SAMHD1 phosphorylation in primary T cells and macrophages. CDK2 is strongly linked to cell cycle progression and coordinates SAMHD1 phosphorylation and inactivation. Knockdown of the cellular CDK2 inhibitor CDKN1A (p21) led to a relief of the SAMHD1 restriction, increasing virus replication. The CDK6 inhibitor palbociclib blocked SAMHD1 phosphorylation, intracellular dNTP levels, HIV-1 reverse transcription and reduced CDK2 activation and its antiviral activity was lost when SAMHD1 was degraded by Vpx. Altogether, our results reinforce the idea that in the following years the deeper study of HIV-1 cellular factors will probably raise the possibility of a new class of “anti-HIV” therapeutics targeting the host rather than the virus, collectively giving new proposals to the unresolved challenge of curing HIV infection and AIDS.
|
117 |
El mecanisme de vigilància de la fase S estabilitza els nivells de la ciclina Clb6 en resposta a estrès genotòxicPalou Marín, Gloria 18 June 2009 (has links)
Les cèl·lules eucariotes estan constantment exposades a dany al DNA i a estrès replicatiu (estrès genotòxic), font d'inestabilitat genòmica. L'anomenat mecanisme de vigilància (checkpoint) de la fase S detecta la presència d'estrès genotòxic i genera una resposta que inclou l'aturada preventiva de la replicació i del cicle cel·lular, per tal de donar temps a la superació del problema, i la protecció de la replicació dels cromosomes. Quan els elements centrals d'aquest mecanisme de control estan mutants, les cèl·lules esdevenen genèticament inestables i, en humans, predisposa al càncer. Malgrat el seu paper crític en la preservació de la integritat del genoma, es desconeix la manera com el mecanisme de vigilància de la fase S executa bona part de la seva resposta. Els elements i vies que constitueixen el checkpoint estan conservats evolutivament. El nostre treball s'ha centrat en el llevat de gemmació Saccharomyces cerevisiae. En aquest organisme la proteïna quinasa efectora principal és Rad53. Amb l'objectiu de descobrir dianes a través de les quals Rad53 regula la fase S, s'han assajat en una reacció quinasa in vitro diferents proteïnes candidates a ser substrat de Rad53. Això ha permès la identificació de la ciclina de fase S Clb6 com a substrat de Rad53 in vitro.Les ciclines són les subunitats activadores de la quinasa dependent de ciclina Cdc28/Cdk1, que promou la progressió del cicle cel·lular. Cdc28/Cdk1 és activada per diferents ciclines específiques de les diferents fases del cicle cel·lular, que li confereixen especificitat de substrat. Clb6 és una de les dues ciclines de fase S (junt amb Clb5), que promouen la replicació del DNA. Mentre que Clb5 és present des del final de la fase G1 fins a anafase, Clb6 és eliminada durant la primera meitat de la fase S. Per tal d'estudiar si Clb6 és diana de Rad53 in vivo, s'ha estudiat el seu comportament en resposta a estrès genotòxic. Interessantment, en una fase S compromesa els nivells de Clb6 es mantenen estables, i aquesta estabilització és dependent de Rad53. Experiments amb l'inhibidor de la traducció proteica cicloheximida mostren que l'estabilització de Clb6 requereix síntesi de novo. Donat que en un cicle cel·lular no pertorbat Clb6 és expressada exclusivament en fase G1, sota el control del factor de transcripció MBF. Els nostres resultats indiquen que MBF es reactiva en una fase S compromesa: la subunitat transactivadora Swi6, exclosa del nucli en una fase S no pertorbada, és nuclear en una fase S compromesa; per altra banda, la sobreexpressió d'una forma hiperestable del repressor d'MBF Nrm1 dóna lloc a la desaparició de Clb6 malgrat la presència continuada d'estrès genotòxic i una resposta checkpoint funcional. Fins ara MBF era considerat un factor de transcripció exclusiu de la fase G1.Per últim hem explorat el paper de l'estabilització de Clb6 en una fase S compromesa. El mutant nul clb6 no presenta cap fenotip detectable, suggerint que Clb6 pot operar en forma redundant dins de la resposta a estrès genotòxic. Per aquest motiu hem optat pel plantejament complementari: estudiar l'efecte de mantenir la presència de Clb6 en una fase S no pertorbada (i per tant en absència de la resta de la resposta checkpoint). En aquestes condicions les cèl·lules repliquen el seu DNA amb aparent normalitat, però queden aturades en un estadi previ a anafase. Aquests resultats suggereixen que Clb6 pot ser un element efector de la branca S-M del mecanisme de vigilància de la fase S, que estaria constituïda per diversos punts de control solapat. Aquest paper justificaria que Clb6 hagi de ser eliminada de forma avançada respecte a Clb5. / Eukaryotic cells are permanently exposed to DNA damage and to replication stress (genotoxic stress), a source of genomic instability. A surveillance mechanism, the S phase checkpoint, detects and responds to genotoxic stress, and elicits a response that includes the arrest of cell cycle progression -to give time to overcome the insult- and the protection of chromosome replication. When the checkpoint central elements are mutated cells become genetically unstable, which in humans results in a high frequency of cancer.Despite such critical role to preserve genomic integrity, much remains unknown about the way how the S phase checkpoint executes its response. Because the checkpoint elements and pathways are conserved, our work has been carried out in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. In this organism Rad53 is the S phase checkpoint effector kinase. To identify novel Rad53 targets, we carried out an in vitro kinase assay with different potential substrate proteins involved in cell cycle control. This approach identified the S phase cyclin Clb6 as an in vitro Rad53 substrate.Cyclins are the activatory subunits for Cdc28/Cdk1, the cyclin dependent kinase that drives cell cycle progression in budding yeast. Cdc28/Cdk1 is activated by different cell cycle phase specific cyclins, that also confer substrate specificity to the kinase. Clb6 and Clb5 are the S phase cyclins, promoting the onset of DNA replication. Interestingly, whereas the presence of Clb5 spans from late G1 to anaphase, Clb6 is eliminated earlier, during S phase.To study whether Clb6 is a target of Rad53 in vivo, we explored the effect of genotoxic stress on the cyclin. When cells are exposed to replication stress or to DNA damage during S phase, the presence of Clb6 is stabilized, and such stabilization depends on Rad53.Experiments with the inhibitor of protein translation cycloheximide show that the stabilization of Clb6 requires de novo synthesis. In an unperturbed cell cycle Clb6 is expressed only during G1 phase, under the control of the transcription factor MBF. Our results show that MBF is reactivated in a compromised S phase: the transactivatory subunit Swi6, excluded from the nucleus in an unperturbed S phase, shows nuclear localization during a compromised S phase; in addition, the overexpression of a hyperstable form of the MBF repressor Nrm1 results in Clb6 elimination, despite the continued presence of genotoxic stress and a functional checkpoint response. To date, MBF was considered a transcription factor operating solely and characteristically during G1 phase.Finally we have explored the role of Clb6 stabilization in response to genotoxic stress. The clb6 null mutant does not present a detectable phenotype, which is compatible with a redundant role in the response to genotoxic stress. We therefore chose to address the question the other way round, and study the effect of keeping the levels of Clb6 stable during an otherwise unperturbed S phase (and therefore in the absence of the vast checkpoint response that could mask the specific role of Clb6). Under such conditions cells replicate normally, but arrest in a stage previous to anaphase. These results suggest that Clb6 may be an effector element in the S-M branch of the S phase checkpoint. One such role would explain why Clb6 must be eliminated in S phase, ahead of Clb5 during mitosis.
|
118 |
Mecanismes implicats en la diferenciació de les cèl·lules progenitores endotelials durant el remodelat vascular pulmonarDiez Cuñado, Marta 28 September 2010 (has links)
Les cèl·lules progenitores endotelials (EPC) derivades de la medul·la òssia tenen capacitat per diferenciar-se a cèl·lula endotelial (EC), contribuint així a la reparació endotelial, no obstant també poden diferenciar-se a altres tipus cel·lulars perpetuant lesions vasculars. En artèries pulmonars de pacients amb malaltia pulmonar obstructiva crònica (MPOC) s'ha relacionat un increment en el nombre de les EPC amb un engruiximent de la capa íntima d'aquestes. L'engruiximent d'aquesta està constituït principalment per cèl·lules musculars llises (SMC), així, aquest treball s'ha centrat en investigar la capacitat de les EPC per diferenciar-se a SMC, i per tant en contribuir en el remodelat vascular i en els mecanismes moleculars que hi intervenen. El factor de creixement transformant beta 1 (TGFß1) modula la migració i la diferenciació de EC a un fenotip mesenquimal mitjançant un procés anomenat "endothelial-to-mesenchymal transition" (EnMT). Per tant, el primer objectiu de l'estudi va ser avaluar la plasticitat de les EPC per diferenciar-se a SMC o EC. I el segon, investigar els mecanismes moleculars, relacionats amb la via del TGFß1, que podrien intervenir en la diferenciació i la migració d'aquestes. Per avaluar la plasticitat de las EPC, es van realitzar co-cultius amb EC i SMC in vitro i per una altra banda es van injectar les cèl·lules progenitores dins d'artèries pulmonars humanes aïllades. El fenotip de les cèl·lules es va caracteritzar morfològicament, per immunofluorescència i mitjançant microscopia electrònica. Per avaluar els mecanismes de diferenciació de les EPC, els co-cultius d'aquestes amb EC o SMC es van tractar amb inhibidors de la via del TGFß1 i es van analitzar per citometria de flux i immunofluorescència. També es va avaluar l'expressió gènica de marcadors endotelials i mesenquimals i l'expressió de factors de transcripció relacionats amb el procés d'EnMT. La migració de les EPC es va avaluar mitjançant assaigs en transweells en les mateixes condicions. Els resultats d'aquest treball mostren en primer lloc la capacitat de les EPC per diferenciar-se a EC, facilitant la reparació de l'endoteli vascular, però també per migrar a la capa íntima de les artèries pulmonars i diferenciar-se a SMC, contribuint així al remodelat vascular d'aquestes. Per últim, els resultats també demostren que les EPC es poden diferenciar a SMC i adquirir un fenotip migratori seguint un procés similar al de EnMT, que pot estar mediat pel factor TGFß1. / Bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPC) have shown in vitro and in vivo their ability to differentiate into endothelial cells (EC) and repair the endothelium. However, some evidences suggest that the plasticity of these cells to differentiate into other cell types might contribute to perpetuate vascular lesions. Studies in pulmonary arteries (PA) of patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) suggest that bone marrow-derived EPC may infiltrate the intima and differentiate into smooth muscle cells (SMC). This study is aimed to evaluate the plasticity of EPC to differentiate into SMC and EC in both cell culture and human isolated PA. The study is also addressed to evaluate whether genes involved in the endothelial-to-mesenchymal transition (EnMT) may contribute to mesenchymal phenotype acquisition of EPC and whether transforming growth factor ß1 (TGFß1) is involved in this process. The in vitro studies demonstrated EPC may acquire the morphology and phenotype of the cells they were co-cultured with. EPC co-incubated with human isolated PA were able to migrate into the intima and differentiate into SMC. The results also show that co-culture of EPC with smooth muscle cells (SMC) increases the expression of the mesenchymal cell markers and decreases the expression of the endothelial cell markers. In the same conditions, we also observed an increase in the gene expression of the EnMT-related transcription factors. Inhibition of TGFß receptor I (TGFßRI) partially blocked the differentiation of EPC into SMC and facilitated their differentiation into endothelial cell lineage.This study provides evidences of plasticity of EPC to differentiate into both EC and SMC, reinforcing the idea of their potential role in remodeling process of PA in COPD. Finally, the results also indicate that EPC may differentiate into SMC-like cells through an EnMT-like process and that TGFß1 plays an important role in the fate of EPC.
|
119 |
Caracterización funcional de mutantes de peroxidasas implicadas en la biosíntesis de ligninas en arabidopsis thalianaFernández Pérez, Francisco 27 March 2015 (has links)
La lignificación de la pared de las células del xilema es un proceso extremadamente complejo, sometido a un estrecho control hormonal cuya función principal es la de conferir rigidez e impermeabilidad al sistema vascular. La lignificación es una secuencia de reacciones en cadena que conducen desde un metabolito primario, la fenilalanina, hasta los precursores inmediatos de las ligninas, los alcoholes hidroxicinamílicos (p-cumarílico, coniferílico y sinapílico). Estos alcoholes son oxidados, finalmente, por las peroxidasas para dar lugar a sus correspondientes radicales, que se ensamblan en la pared celular generando un polímero hidrofóbico y fuertemente polidisperso, que da rigidez e impermeabiliza la pared celular, constituyendo uno de los mayores sumideros metabólicos del CO2 fijado durante la fotosíntesis. Las peroxidasas siringilo son las enzimas responsables de la oxidación del alcohol sinapílico, lo que conduce a la formación de monómeros siringilo (S) que se incorporan al polímero de lignina. Estas enzimas han sido descritas como peroxidasas básicas que no presentan restricciones estéricas que impidan la entrada de alcohol sinapílico en el centro catalítico. Hasta el momento, las peroxidasas más estudiadas a nivel estructural han sido la ATP A2 de Arabidopsis y HRP A2 de rábano, las cuales son peroxidasas guaiacilo incapaces de oxidar el alcohol sinapílico. La peroxidasa siringilo mejor caracterizada hasta el momento es la de Zinnia elegans (ZePrx). En el genoma de Arabidopsis existen 73 peroxidasas pero ninguna de ellas ha sido identificada como una peroxidasa de tipo siringilo. Estudios previos buscaron en el genoma de A. thaliana peroxidasas que presentan una gran homología de secuencia con ZePrx, así como de estructura, carga superficial, punto isoeléctrico y regulación de su expresión. Teniendo en cuenta estos criterios se seleccionaron las peroxidasas AtPrx4, AtPrx52, y AtPrx72. En esta tesis, se muestra cómo la supresión de dichas peroxidasas en diferentes líneas mutantes de Arabidopsis afecta al contenido y a la composición de ligninas. En general, todas las líneas mutantes mostraron una disminución en el contenido de ligninas, medido con bromuro de acetilo, entre un 17 y un 37%. Además, la relación S/G, obtenida por tioacidolisis, indica una disminución en las unidades de S en todos los mutantes. Además, como se deduce de las tinciones de Wiesner y de Mäule, esta reducción en el contenido de monómeros S parece estar restringida a las fibras interfasciculares, pero no afecta a los vasos del xilema. Para analizar si este cambio en la composición de lignina era dependiente de la edad de la planta, también se realizaron análisis cualitativos y cuantitativos de ligninas en tallos en diferentes etapas de desarrollo. Nuestros resultados mostraron diferencias significativas en el contenido y la composición de ligninas entre plantas mutantes y WT solamente en las últimas etapas del desarrollo. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el tamaño de las plantas mutantes en comparación con el WT. Los análisis mediante qPCR revelaron que los genes implicados en la biosíntesis de ligninas, así como en la formación de la pared celular secundaria, redujeron su expresión en las plantas mutantes. Por otro lado, la expresión de genes implicados en la biosíntesis de ésteres sinapato y de flavonoides se incrementó en las plantas mutantes con respecto al WT lo cual indica que hay una reorientación de los esqueletos carbonados de la ruta de biosíntesis de las ligninas hacia otras rutas del metabolismo fenilpropanoide. En conjunto, nuestros resultados sugieren que AtPrx4, AtPrx52 y AtPrx72 son peroxidasas siringilo implicados en la síntesis de unidades S en las fibras interfasciculares y además, su represión afecta a toda la ruta fenilpropanoide y puede ser suficiente para alterar el metabolismo de la planta. / The lignification of xylem cell walls is an extremely complex process, under strict hormonal control, whose main function is to confer rigidity and impermeability to the vascular system. Lignification is the result of several reactions from a primary metabolite, phenylalanine, until the immediate precursors of lignin, the hydroxycinnamyl (p-coumaryl, coniferyl and sinapyl) alcohols. These alcohols are finally oxidized by peroxidases to give their corresponding radicals, which will be further assembled in the cell wall, generating a hydrophobic polymer (lignin) which gives rigidity and waterproof cell wall. Lignin constitutes a major metabolic sink for the CO2 fixed during photosynthesis. Syringyl peroxidases are the enzymes responsible for sinapyl alcohol oxidation that eventually lead to syringyl monomers formation. They have been described as basic peroxidases which show no steric restrictions that hinder the entry of sinapyl alcohol into the catalytic centre. So far, the most studied peroxidases at the structural level, such as ATP A2 from Arabidopsis and HRP A2 from horseradish, are guaiacyl peroxidases, unable to oxidize sinapyl alcohol. Unfortunately, little is known regarding structure and catalytic properties of syringyl peroxidases. The best characterized is ZePrx from Zinnia elegans. Since such a peroxidase similar to ZePrx has not been identified in Arabidopsis, a search through A. thaliana genome was performed, in order to identify the peroxidases which showed the highest homology to ZePrx. Based on several structural and molecular characteristics, AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 were determined to be the most likely homologous to ZePrx in Arabidopsis. In this thesis, we show how the suppression of AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 in different mutant lines of Arabidopsis affects lignin content and composition. Overall, all the mutant lines showed a decreased in lignin content, measured with acetyl bromide, ranging from 17 to 37%. Furthermore, the S/G ratio, obtained by both nitrobenzene oxidation and thioacidolysis, indicated a decrease in S units in all the mutants. As deduced from Wiesner and mainly Mäule stainings, this reduction in S monomers content seems to be restricted to the interfascicular fibers, but it does not affect xylem vessels. To assay whether this shift in lignin composition was age-dependent, we also performed qualitative and quantitative analyses of lignins in stems at different stages of development. Our results showed significant differences in both content and composition only in late stages of development of mutant plants. However, no significant differences were found regarding mutant size in comparison with WT when plants reached maturity. qPCR revealed that genes involved in lignin biosynthesis as well as in secondary cell wall formation were down-regulated in mutant plants. On the other hand, expression of genes involved in sinapate esters and flavonoid biosynthesis was up-regulated in mutant plants, which indicates a reallocation of carbon from lignin biosynthetic pathway to other routes of phenylpropanoid metabolism. Taken together, our results indicate that AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 may be syringyl peroxidases involved in the synthesis of S units in interfascicular fibers. Moreover, the suppression of the last step of syringyl lignins biosynthesis affects the whole phenylpropanoid pathway and may be sufficient to alter plant metabolism.
|
120 |
Estudio del papel de IR/IGF‐1R y GLP‐1R en el desarrollo de la enfermedad de alzheimer. Estrategias de terapia génica para reducir la sintomatología del modelo 3xTgADSánchez Osuna, Ángela 08 July 2015 (has links)
La Enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa cuyos síntomas incluyen
no sólo la pérdida de memoria de los pacientes, sino también problemas en la función ejecutiva, cambios de
personalidad, etc. Se trata de una enfermedad compleja, son numerosos los factores de riesgo que pueden
estar implicados en su desarrollo y se observan también alteraciones a diferentes niveles, tanto neurohistológicas,
como genéticas, metabólicas, etc.
En los últimos años, se ha estudiado extensamente la implicación de la Diabetes Mellitus y la Resistencia
a la Insulina como factores de riesgo para el desarrollo de la AD. Así, numerosos estudios demuestran
que la administración de insulina es capaz de mejorar la memoria tanto en personas sanas como en pacientes
de AD. También se ha demostrado que los péptidos IGF‐1 y GLP‐1, estrechamente relacionados con la vía
de señalización de la insulina, pueden actuar como factores de crecimiento y neuroprotección a nivel del
Sistema Nervioso Central. Además, los niveles de expresión de los receptores de insulina, IGF‐1 y GLP‐1, así
como su capacidad de activación se encuentran significativamente reducidos en el cerebro de pacientes de
AD y esto correlaciona con el avance de la enfermedad, especialmente con el avance de la patología amiloide.
En esta tesis doctoral, demostramos que los niveles de mRNA de IGF‐1R aumentan significativamente
en animales 3xTgAD de 9 meses, pero los niveles del receptor proteico total y activado se encuentran
reducidos en animales 3xTgAD de 9 y 12 meses. Esta reducción coincide en el tiempo con el cambio en la
acumulación de los péptidos desde una localización intraneuronal a una localización extraneuronal, y ambos
fenómenos podrían estar relacionados.
Para demostrar la implicación de IR/IGF‐1R y GLP‐1R en el correcto funcionamiento neuronal y en el
desarrollo de los síntomas de la AD, hemos diseñado dos vectores adenoasociados (AAV) que expresan un
shRNA‐IGF1R y un shRNA‐IR, respectivamente, y los hemos inyectado conjuntamente en el hipocampo de
hembras 3xTgAD de 2 meses de edad. Este silenciamiento de la vía IR/IGF‐1R provocó un aumento en la
acumulación intraneuronal de Aβ a los 4 meses de edad en comparación con la encontrada en hembras inyectadas
con un shRNA‐scrambled.
Por otra parte, también diseñamos dos vectores AAV para sobreexpresar el cDNA de IGF‐1R y GLP‐1R en el
hipocampo y córtex prefrontal de animales 3xTgAD de 5 meses de edad. De esta manera hemos demostrado que la
sobreexpresión de GLP‐1R, pero no la de IGF‐1R, consigue corregir los síntomas neuropsichiátricos asociados a la
demencia (BPSD), así como la flexibilidad cognitiva de los machos 3xTgAD de 12 meses de edad. Esto correlaciona con
una reducción en la acumulación de Aβ en el hipocampo, así como una reducción de la neuroinflamación y de la pérdida
neuronal en el córtex cerebral.
En las hembras, ambos tratamientos tienen efectos moderados sobre los BPSD, pero sólo la sobreexpresión de
IGF‐1R consigue mejorar la capacidad de aprendizaje y memoria espacial de las hembras 3xTgAD de 12 meses de edad.
Esto correlaciona con una reducción en la neuroinflamación en hipocampo y amígdala, una menor acumulación de la
proteína tau fosforilada, así como una reducción de la pérdida neuronal en el córtex. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose symptoms include not only
memory loss, but also executive function problems, personality changes, etc. It is a complex disease,
there are many risk factors implicated in its development and impairment in many aspects can be observed,
as neurohistology, metabolism, genetics, etc.
Diabetes Mellitus and Insulin Resistance have emerged in the late years as a risk factor for AD,
as several studies demonstrate that insulin administration is able to improve memory in healthy patients
as well as in AD patients, and the related peptides IGF‐1 and GLP‐1 can act as growth and neuroprotection
factors in the Central Nervous System. Moreover, expression levels of IR, IGF‐1R, GLP‐1R, as
well as their activation ability after binding of insulin, IGF‐1 and GLP‐1 to their corresponding receptors
are impaired in brains of AD patients and this correlates to the stage of the disease, specially to the
amyloid pathology.
In this study, we demonstrate that IGF‐1R mRNA levels are significantly elevated in 3xTgAD animals
when compared to WT at 9 months‐old, but there is a reduction at protein level and activation of
IGF‐1R in 9 and 12 months‐old 3xTgAD animals. This reduction could be related to the change from an
intra to an extraneuronal accumulation of Aβ peptides.
To demonstrate the implications of IR/IGF‐1R and GLP‐1R for a correct neuronal function and in
the developments of AD symptoms, we designed two AAV vectors expressing a shRNA‐IGF1R and a
shRNA‐IR respectively, and we jointly injected them in the hippocampus of 2 months‐old 3xTgAD females.
This IR/IGF‐1R silencing caused an increase in the intraneuronal Aβ accumulation at 4 months‐old
when compared to females injected with a shRNA‐scrambled.
We also designed two AAV vectors for the overexpression of IGF‐1R and GLP‐1R in the hippocampus
and prefrontal cortex of 5months‐old 3xTgAD animals. We demonstrate that the overexpression
of GLP‐1R, but not IGF‐1R, correct Behavioral and Psychiatric Symptoms associated to Dementia (BPSD)
and cognitive flexibility in 12 months‐old 3xTgAD males, and this correlates with a reduction of Aβ accumulation
in hippocampus, as well as with a reduction of neuroinflammation in amygdala and neuronal
loss in cortex.
In females, both treatments have moderate effect on BPSD, but only IGF‐1R overexpression
improves spatial learning performance and spatial memory in 12 months‐old 3xTgAD females. This correlates
with a reduction of neuroinflammation, accumulation of phosphorylated tau and neuronal loss in
cerebral cortex.
|
Page generated in 0.0878 seconds