El receptor del factor de creixement nerviós TrkA contribueix a la supervivència i a ladiferenciació de diferents poblacions neuronals. Tot i que les principals vies de senyalització imolècules adaptadores activades després de la unió del lligant al receptor estan benestudiades, recentment un creixent nombre de proteïnes que interaccionen amb TrkA hanestat descrites com a nous mecanismes de regulació del receptor. La trans-autofosforilaciódel receptor, a més d'activar les cascades de senyalització rellevants per la diferenciació isupervivència cel·lular, com són les vies de les MAPKs i PI3K-Akt, també indueix un augmenttransitori de la concentració de calci citoplasmàtic. En conseqüència la proteïna sensora deCa2+ calmodulina (CaM) també participa en la senyalització per TrkA. El nostre grup estavainteressat en discernir la relació entre CaM i TrkA, i vàrem descobrir que CaM interaccionadirectament i de manera Ca2+-dependent amb l'extrem carboxi-terminal de TrkA. A partird'aquests resultats ens vàrem plantejar de buscar la posició exacta del domini d'unió acalmodulina en la seqüencia de TrkA. Donat que els programes de predicció no van trobar unaseqüència candidata d'unió a CaM en el domini intracel·lular del TrkA, vàrem centrar-nos en elextrem COOH-terminal del receptor, un domini ric en aminoàcids hidrofòbics en posicionsconservades. Vàrem introduir mutacions en dos aminoàcids del domini candidat, Leu784 iVal790 substituint-los per Ala. Els assajos d'unió van mostrar que els mutants TrkA-L784A iTrkA-L784A-V790A no perdien la unió a CaM, per tant no formaven part del domini d'unió aCaM de TrkA. Tanmateix, vàrem demostrar que aquests aminoàcids hidrofòbics són importantsper a la unió i la regulació de la lligasa d'ubiquitina Nedd4-2. Vàrem observar una fortainteracció dels dos receptors mutants amb Nedd4-2, que es corroborava amb una augmentadaco-localització de les dues proteïnes detectada per immunofluorescència. Com a conseqüèncias'observà una intensa multimonoubiquitinització basal dels receptors mutants mitjançada perNedd4-2. Aquests resultats correlacionen amb un important descens en la quantitat dereceptor a causa d'un direccionament d'aquest cap als endosomes tardans/lisosomes. Totplegat resultava en un increment en la degradació dels receptors mutats. Malgrat la reduccióen la quantitat de receptors de membrana, els receptors TrkA mutats van ser capaçosd'activar vies de senyalització, i fins i tot eren més eficients en promoure l'extensió deneurites que els receptors TrkA normals. Els nostres resultats demostren que la composició del'extrem COOH-terminal de TrkA participa en la regulació de la unió i activitat de Nedd4-2.Així mateix, s'evidencia que la ubiquitinització de TrkA per Nedd4-2 promou el tràficendosomal de TrkA cap als endosomes tardans/lisosomes augmentant d'aquesta manera ladegradació del receptor. Per altra banda, s'observa que la multimonoubiquitinització de TrkAno interfereix en l'activació de les vies de senyalització, tanmateix potencia la senyalització delreceptor conduent a la diferenciació cel·lular. / El receptor del factor de crecimiento nervioso TrkA contribuye a la supervivencia ydiferenciación de varias poblaciones neuronales. A pesar del buen conocimiento de lasprincipales vías de señalización y las proteínas adaptadoras activadas después de la unión delligando al receptor, últimamente se ha descrito un número creciente de proteínas queinteraccionan con el receptor participando en su regulación. La trans-autofosforilación delreceptor, adicionalmente a la activación de vías de señalización relevantes para ladiferenciación y la supervivencia celular, como son las vías de las MAPKs y PI3K-Akt, tambiénconlleva un aumento transitorio del calcio citoplasmático. En consecuencia la proteína sensorade calcio calmodulina (CaM) también participa en la señalización por TrkA. Nuestro grupo teníainterés en estudiar la relación entre CaM y TrkA y descubrió que la CaM interacciona de formadirecta y calcio dependiente con el extremo COOH-terminal del receptor TrkA. A partir deestos resultados nos plantemaos buscar la posición exacta del sitio de unión a calmodulinadentro de la secuencia de TrkA. Puesto que los programas de predicción no encontraronninguna secuencia candidata de unión a calmodulina en el dominio intracelular de TrkA, noscentramos en el extremo COOH-terminal, dominio rico en ácidos hidrofóbicos en posicionesconservadas. Introducimos mutaciones puntuales en el sitio candidato de unión a CaMcambiando la L784 y la V790 por Ala. Los ensayos de unión a CaM realizados mostraron quelos mutantes TrkA-L784A y TrkAL784A-V790A no perdían la unión a CaM, por lo tanto noformaban parte del dominio de unión a CaM de TrkA. Sin embargo, hemos demostrado queestos aminoácidos son importantes para la unión y la regulación de la ligasa de ubiquitinaNedd4-2. . Observamos una mayor interacción de los dos mutantes del extremo COOHterminalcon Nedd4-2, resultado que era corroborado por una mayor colocalización de las dosproteínas detectada por immunofluorescencia. Como consecuencia observamos una intensamultimonoubiquitinización basal de los receptores mutados mediada por Nedd4-2. Estosresultados correlacionan con un importante descenso de la cantidad de receptor a causa deun direccionamiento de este hacia los endosomas tardíos/lisosomas. Todo ello resultaba en unincremento en la degradación de los receptors mutados. A pesar de la reducción en la cantidadde receptor en membrana, los mutantes de TrkA mostraron ser capaces de activar las vías deseñalización e incluso ser más eficientes promoviendo el crecimiento de neuritas comparandocon el receptor normal. Estos resultados demuestran que la composición del extremo COOHterminalde TrkA regula la unión y la actividad de la ligasa de ubiquitina Nedd4-2. Además, laubiquitinización de TrkA mediada por Nedd4-2 promueve el direccionamiento de los receptoresmutados hacia los endosomas tardíos/lysosomas dando lugar a una mayor degradación delreceptor. Por otro lado, se observa que la multimonoubiquitinización de TrkA no interfiere conla activación de las vías de señalización, sino más bien potencia la señalización del receptorque conduce a la diferenciación celular. / The nerve growth factor receptor TrkA contributes to the survival anddifferentiation of several neuronal populations. Although main signaling pathwaysand adaptor molecules activated after ligand binding to the receptor are well studied,recently a growing number of TrkA interacting proteins have been described as novelmechanisms of receptor regulation. Receptor trans-autophosphorylation, additionallyto activating signaling cascades relevant for cell differentiation and survival, such asMAPKs and PI3K-Akt, also induces a transient increase in intracellular calciumconcentration. Therefore, the Ca2+ sensor calmodulin (CaM) also participates in TrkAsignaling. Our group was interested in elucidating the relationship between CaM andTrkA, and discovered that CaM interacts directly with the C-terminal tail of TrkA in aCa2+ dependent manner. Consequently, we sought to find the exact position of thecalmodulin binding site on TrkA sequence. Since available prediction software wasunable to find a putative CaM binding site in TrkA intracellular domain, we focusedon the C-terminal tail, a domain rich in hydrophobic amino acids in conservedpositions. We introduced point mutations on Leu784 and Val790 by switching themto Ala, located on our predicted CaM binding site. However, TrkA-L784A and TrkAL784A/V790A mutants did not lose CaM binding, therefore they were not involved onCaM binding. Nonetheless, we demonstrated that these hydrophobic aminoacids areimportant for the binding and regulation of Nedd4-2 Ub ligase. We observed astronger interaction of both C-terminal mutant receptors with Nedd4-2, corroboratedwith a higher colocalization of both proteins by immunofluorescence. Consequently,we observed an enhanced basal multimonoubiquitination of mutant receptors byNedd4-2. These results correlated with a decrease in TrkA abundance due to a fasterlate endosome/lysosome targeting, leading to a higher degradation rate of mutantreceptors. Despite the reduction in the amount of membrane receptor caused by theC-terminal changes, TrkA mutants were able to activate signaling cascades and wereeven more efficient in promoting neurite outgrowth than the wild-type receptor. Ourresults demonstrate that the C-terminal tail conformation of TrkA regulates Nedd4-2binding and activity. Moreover, TrkA ubiquitination by Nedd4-2 promotes TrkAendosomal trafficking to late endosome/lysosome leading to receptor degradation. Inaddition, TrkA multimonoubiquitination does not interfere with the activation ofsignaling cascades, but rather potentiates receptor signaling leading todifferentiation.

Introducció Existeixen diferències de gènere en la capacitat oxidativa mitocondrial del teixit adipós marró (TAM) i del fetge de rata, que s’atribueixen a la presència de mitocondris més diferenciats i funcionals a les femelles que als mascles. Una situació d’excés de nutrients, com és el cas de l’obesitat dietètica, podria desencadenar un estat d’estrès oxidatiu i alterar el funcionament mitocondrial com a conseqüència de canvis en el procés de biogènesi mitocondrial. Encara que els mecanismes pels quals l’obesitat dietètica modifica el funcionament mitocondrial no estan completament establerts, s’ha suggerit una connexió entre la via de senyalització de la insulina i el procés de biogènesi mitocondrial. Contingut de la investigació L’eix central d’aquesta tesi ha estat l’estudi de la influència del gènere en els efectes que té l’obesitat sobre la funció i biogènesi mitocondrials del TAM i del fetge, i establir la relació amb la sensibilitat tissular a la insulina. Per assolir aquest objectiu, en primer lloc, s’han analitzat els efectes que té l’alimentació crònica amb una dieta hiperlipídica sobre els paràmetres de funció i biogènesi mitocondrials, l’estat redox i els elements claus en la via de senyalització de la insulina al TAM i al fetge de rates d’ambdós gèneres. En segon lloc, s’ha usat un model de rates femella ovariectomitzades per aprofundir en el coneixement de la influència de les hormones ovàriques sobre el procés de biogènesi mitocondrial. Els resultats obtinguts han demostrat que les diferències de gènere en el funcionament mitocondrial poden atribuir-se, en part, a les hormones ovàriques i que els efectes de l’obesitat sobre el funcionament mitocondrial i la sensibilitat a la insulina són dependents del gènere. En comparació amb els mascles, l’alimentació amb la dieta hiperlipídica indueix a les rates femella un major guany de pes corporal, una major acumulació de greix al teixit adipós blanc i un augment de la resistència a la insulina, tant a nivell circulant com en el TAM i del fetge. Per una banda, la pèrdua de sensibilitat a la insulina del TAM de les rates femella pot estar relacionada amb la disminució de la capacitat oxidativa mitocondrial del teixit i amb l’augment del dany oxidatiu. Per altra banda, la incrementada resistència a la insulina en el fetge de les rates femella, i el manteniment d’una major capacitat oxidativa mitocondrial, en comparació als mascles, es poden considerar mecanismes de protecció enfront de la lipotoxicitat hepàtica induïda per la dieta. Conclusió En el seu conjunt, els resultats obtinguts en aquesta tesi demostren que els efectes de l’obesitat sobre el funcionament mitocondrial també depenen del teixit. Mentre que al fetge de les rates d’ambdós gèneres es posen en marxa mecanismes per fer front a l’excés de nutrients que permeten assolir una nova situació d’equilibri i evitar el dany oxidatiu, al TAM només s’observa una resposta compensatòria en els mascles, el que estaria relacionat amb les diferències de gènere observades en el guany de pes corporal.

L'apoptosi s'ha considerat un factor important en el control del balanç entre proliferació cel·lular, diferenciació i mort durant el desenvolupament. La regulació de l'apoptosi és un factor clau per aconseguir aquest balanç, eliminant cèl·lules innecessàries o malmeses que, d'altra manera, podrien tenir efectes adversos per l'organisme. Durant la darrera dècada, molts treballs han demostrat que la senyalització per apoptosi té una funció vital per la morfogènesi del cor. Malgrat això, existeix controvèrsia sobre la implicació de les caspases en la mort dels cardiomiòcits en l'individu adult. Així, l'anàlisi de la regulació de l'apoptosi des d'una perspectiva de desenvolupament podria millorar el nostre coneixement sobre la funció de l'apoptosi al cor. Per tant, els nostres principals objectius han estat caracteritzar la regulació de l'expressió dels gens apoptòtics durant el desenvolupament cardíac i la identificació de les vies alternatives implicades al dany del teixit cardíac. Vàrem analitzar l'expressió de proteïnes implicades al control de la via de mort cel·lular dependent de caspases en teixits provinents de rates de diferents edats entre l'embrió i l'estadi adult. Els gens implicats en l'activació de l'apoptosi es troben fortament silenciats al cor adult i, la major part d'ells, també al cervell, però no al fetge. Les excepcions varen ser Caspasa-2, l'expressió de la qual es reprimeix a tots els teixits estudiats durant la fase embrional, i Bax i Bak, que es silencien en tots els teixits durant el període perinatal. L'expressió de la caspasa iniciadora Caspasa-9 i les caspases executores Caspasa-3 i Caspasa-7 es troba reprimida al cor i cervell postnatals. En relació amb els gens anti-apoptòtics, Bcl-2 es silencia al cor i el cervell durant el desenvolupament i no es va detectar al fetge, mentre que Bcl-XL s'expressa a tots els teixits fins l'estadi adult. Mitjançant l'anàlisi per RT-PCR semiquantitativa vàrem poder observar que la reducció en l'abundància de les proteïnes apoptòtiques durant el desenvolupament té lloc de forma paral·lela amb la reducció en els nivells dels seus mRNA. Durant la isquèmia experimental o el tractament amb la droga pro-apoptòtica estaurosporina, l'activació de la caspasa executora Caspasa-3 va observar-se només als cardiomiòcits embrionaris, però no als cardiomiòcits postnatals o adults. A més a més, la isquèmia va induir fragmentació de l'ADN que no es va poder evitar afegint inhibidors de caspases a cardiomiòcits postnatals en cultiu, que ja expressen nivells molt baixos d'aquests gens. Per continuar amb la investigació sobre la mort dels cardiomiòcits postnatals i el canvi d'una via dependent de caspases a una via independent de caspases durant el desenvolupament del cor, vàrem analitzar el possible rol de diverses DNAses que podrien estar implicades al dany a l'ADN durant la isquèmia. La repressió experimental en cultiu del gen Endonucleasa G (EndoG), que codifica per una nucleasa mitocondrial, va bloquejar la degradació de l'ADN durant la isquèmia, demostrant que EndoG té una funció molt important en aquest esdeveniment, de forma independent a les caspases. La sortida d'EndoG del mitocondri és un pas important per a la fragmentació de l'ADN als cardiomiòcits. Hem demostrat que Bcl -XL és capaç de bloquejar i Bnip3 contribueix a l'alliberament d'EndoG del mitocondri i, així, tenen efectes contraposats en la fragmentació de l'ADN durant la isquèmia als cardiomiòcits diferenciats. També vàrem iniciar l'anàlisi dels mecanismes que controlen l'expressió i silenciament dels gens apoptòtics al cor. Vàrem analitzar la contribució de dos candidats, E2F i les proteïnes d'unió a tractes de polipirimidines (PTB). Al cor, l'expressió d'E2F i PTB es redueix durant el desenvolupament, de forma paral·lela als gens apoptòtics. Malgrat això, l'anàlisi de l'expressió de gens apoptòtics a ratolins deficients per E2F1, E2F2 o tots dos gens no va mostrar cap canvi en relació amb els nivells d'expressió als seus respectius animals control ni durant l'estadi embrional ni durant el desenvolupament postnatal. Aquests resultats varen descartar que E2F tinguin una funció rellevant en el control de l'expressió dels gens apoptòtics al cor, a diferència del que s'ha observat en línies cel·lulars tumorals. D'altra banda, vàrem trobar que, en cardiomiòcits neonatals, que expressen nivells molt baixos de PTB, la sobrexpressió de PTB1 o PTB4 va induir la reexpressió de molts gens apoptòtics, incloent Apaf-1, les caspases-9 i -3, i Bid. A més a més, els cardiomiòcits sobre-expressors de PTB varen patir major dany a l'ADN durant la isquèmia que els cardiomiòcits control i aquest increment podia ser inhibit mitjançant inhibidors de caspases fins a nivells similars als de cèl·lules no sobreexpressores. Això suggereix que la recuperació de l'expressió de PTB, probablement implicant l'increment de l'expressió de gens apoptòtics, va induir un canvi a un mecanisme implicant les caspases. La re-expressió de PTB va induir un increment en la quantitat de proteïnes apoptòtiques sense afectar els nivells dels seus respectius mRNA. Els assaigs luciferasa (Luc) en cardiomiòcits normals i sobre-expressors de PTB, utilitzant plàsmids bicistrònics en els quals es va integrar la regió 5'-no codificant (5'-UTR) dels transcrits d'Apaf-1 o Caspasa-3 entre LucRenilla i LucFirefly, varen demostrar un increment en l'activitat LucFirefly quan qualsevol de les dues 5'-UTR es trobava present, comparat amb els nivells control. Aquests resultats suggereixen que PTB indueixen traducció per la via Internal Ribosolmal Entry Site (IRES), que requereix certes seqüències a les regions 5'-UTR dels gens implicats.

Els nutrients són els factors tràfics més importants per al llevat, i la sevalimitació provoca una aturada del cicle en la fase G1. Aquesta resposta d'adaptació alscanvis nutricionals del medi assegura la màxima viabilitat de la cèl·lula, i permet l'inicide diferents processos de diferenciació segons les condicions nutricionals.El cicle cel·lular de Saccharomyces cerevisiae està regulat en diferents puntsper mecanismes de control intern que asseguren la proliferació sense cap anomalia enels diferents processos cel·lulars. Al final de fa fase G1, si les condicions nutricionalssón òptimes, es dóna el compromís de continuar el cicle fins a la propera fase G1. Lavia de senyalització de la limitació de nutrients essencials com la font de nitrogenencara no havia estat determinada. Hem estudiat la regulació de les ciclines de faseG1 en el model de limitació de font de nitrogen, i hem demostrat que la proteïna Cln3està regulada post-transcripcionalment de dues formes diferents: una majorinestabilitat que depèn de la via de la ubiquitina, i una inhibició traduccional queprovoca la total desaparició de Cln3, causant així la repressió de gens dependents deSBF i MBF en la següent fase G1. La presència de Sic1, l'inhibidor de complexesClb/Cdc28, permet explicar en termes moleculars l'aturada en G1.En condicions de limitació nutricional les cèl·lules diploides també s'aturen enG1, però inicien un procés diferenciador anomenat meiosi, que implica la replicado delDNA, dues divisions meiòtiques i la formació d'espores com a unitats de resistència acondicions adverses. La proteïna Ime1 és la principal inductora de tots els processosde meiosi i activa l'expressió del primer grup de gens que participen en la replicadopremeiòtica del DNA. En aquest treball mostrem que, en les condicions nutricionals enque es dóna la meiosi, les ciclines G1 desapareixen ràpidament, però d'altra banda esprodueix una alta expressió de CLB5 que depèn d'Imel. Els nivells de Sic1disminueixen, de manera també dependent d'Imel, el que indica un mecanisme deregulació d'entrada en la fase S premeiòtica molt semblant al cicle mitòtic, però induitper Ime1 enlloc de Cdc28/Cln3. En mutants cln la meiosi pot iniciar-se en medi ric, elque implica a les ciclines G1 com a mediadores d'un senyal nutricional sobre l'inici dela meiosi. Les ciclines G1 inhibeixen la via Ime1 mitjançant dos controls negatius:repressió transcripcional d'IMEI, i inhibició de l'acumulació en el nucli d'Imel,reprimint així l'expressió del gens meiòtics. Aquests resultats demostren l'existènciad'un control negatiu dels activadors clau de la mitosi sobre els de la meiosi, fent queaquestes dues opcions del cicle cel·lular siguin incompatibles.

El llevat S.cerevisiae és un dels models eucariotes més adequats per l'estudi dels diversos mecanismes implicats en la supervivència cel.lular en resposta a estrès oxidatiu. Les espècies reactives d'oxigen (ROS) com els radicals hidroxil, l'anió superòxid o el peròxid d'hidrogen generen estrès oxidatiu, causant important danys intracel.lulars davant els quals la cèl.lula a desenvolupat una sèrie de mecanisme per fer-hi front. Grx3 i Grx4 són dues glutaredoxines monotiòliques de S.cerevisisae que formen part dels sistemes enzimàtics que regulen l'estat redox de les proteïnes en resposta a estrès oxidatiu. No obstant, fins ara es desconeixen els mecanismes amb els quals Grx3 i Grx4 participen en la detoxificació d'aquestes ROS i en l'adaptació cel.lular en condicions oxidatives. En el primer Capítol es caracteritza el paper funcional de Grx3 i Grx4 en la regulació de l'homeòstasi del ferro intracel.lular mitjançant la regulació del factor transcripcional Aft1, encarregat de regular la transcripció de gens que formen part del sistema d'alta afinitat de captació de ferro. A més a més, es caracteritza el paper funcional dels dominis glutaredoxina (GRX) de Grx3 i Grx4 en l'exportació nuclear d'Aft1, com a mecanisme regulador de l'estrès oxidatiu generat per un augment en els nivells de ferro intracel.lulars. En el segon Capítol hem aconseguit donar una funció específica per Grx3 i Grx4 en la regulació de la via d'integritat cel.lular o la via PKC1- MAP quinasa en resposta a estrès oxidatiu. A més a més, demostrem que són els dominis tioredoxina (TRX) de Grx3 i Grx4 qui dessarrollen el paper protagonista en l'activació de la quinasa Slt2 en resposta a estrès oxidatiu i en la repolarització del citoesquelet d'actina en condicions normals i en resposta a estrès oxidatiu. També demostrem que Grx3, Grx4 i Slt2 estàn relacionades genètica i funcionalment amb els procesos implicats en l'organització del citoesquelet d'actina en resposta a estrès oxidatiu i en la biogènesi vacuolar en condicions normals. / La levadura S.cerevisiae es uno de los modelos eucariotas más adecuados para el estudio de los diferentes mecanismos implicados en la supervivencia celular en respuesta a estrés oxidativo. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) como los radicales hidroxilo, el anión superóxido o el peróxido de hidrógeno generan estrés oxidativo, induciendo importantes daños intracelulares frente a los cuales la célula tiene que desarrollar una serie de mecanismos para hacerles frente. Grx3 i Grx4 son dos glutaredoxinas monotiólicas de S.cerevisiae que forman parte de los sistemas enzimáticos que regulan el estado redox de las proteínas en respuesta a estrés oxidativo. No obstante, hasta hoy se desconocen los mecanismos mediante los cuales Grx3 i Grx4 participan en la detoxificación de estos ROS y en la adaptación celular frente a condiciones oxidativas. En el primer Capítulo se caracteriza el papel funcional para Grx3 y Grx4 en la regulación de la homeóstasis del hierro intracelular mediante el factor transcripcional Aft1, el cual se encarga de regular la transcripción de genes que forman parte del sistema de alta afinidad de captación de hierro. Además, se caracteriza el papel funcional de los dominios GRX de Grx3 y Grx4 en la exportación nuclear de Aft1, como mecanismo regulador del estrés oxidativo generado por un aumento en los niveles de hierro intracelulares. En el segundo Capítulo hemos logrado dar una función específica a Grx3 y Grx4 en la regulación de la vía de integridad celular o vía PKC1-MAP quinasa en respuesta a estrés oxidativo. Además, tras diseccionar los dominios glutaredoxina (GRX) y tioredoxina (TRX) de Grx3 y Grx4, hemos concluido que son los dominios TRX de ambas glutaredoxinas quienes poseen un papel protagonista en la activación de la quinasa Slt2 en respuesta a estrés oxidativo y en la reorganización del citoesqueleto de actina en condiciones normales y oxidantes. También se demuestra que Grx3, Grx4 y Slt2 están relacionados genética y funcionalmente en los procesos implicados en la organización del citoesqueleto d'actina en respuesta a estrés oxidativo y en la biogénesis vacuolar en condiciones normales. / The yeast S.cerevisiae is one of the most suitable eukaryotic models to study several mechanisms involved in cell survival in the response to oxidative stress. Reactive oxygen species (ROS) such as hydroxyl radicals, superoxide anions or hydrogen peroxide provoque oxidative stress and cause important cell damage. As a consequence of that, cells need to develop a series of mechanisms in order to repair their structures. Grx3 and Grx4 are two monothiol glutaredoxins of S.cerevisiae potentially involved in enzymatic systems to regulate the redox state of proteins in front of oxidative stress. Nevertheless, actually is unknown the mechanisms where Grx3 and Grx4 participate in ROS detoxification and in the cellular adaptation to oxidative conditions. In the first chapter, we characterize a functional role for both Grx3 and Grx4 in the maintenance of iron homeostasis through the regulation of Aft1, a transcription factor involved in the transcriptional regulation of a subset of genes which integrate the high affinity iron uptake system. In addition, we have characterized the functional role for both GRX domains of Grx3 and Grx4 in the nuclear export of Aft1 as a mechanism that regulates the oxidative stress generated by high levels of intracellular iron. In the second chapter, it is characterized a specific function for Grx3 and Grx4 in the regulation of the cell integrity pathway or PKC1-MAP kinase pathway in response to oxidative stress. Moreover, we described the functional role for both TRX domains of Grx3 and Grx4 in the Slt2 activation in response to oxidative stress and in the reorganization of the actin cytoskeleton in normal and oxidant conditions. We also demonstrated the genetic and the functional relationship between Grx3, Grx4 and Slt2 in the mechanisms involved in the actin cytoskeleton organization in response to oxidative stress and in the vacuolar biogenesis in normal conditions.

La calcificació vascular és un fenòmen freqüent en pacients amb malalties renals cròniques (MRC). A més a més, aquests pacients presenten una disminució dels nivells de vitamina D (1,25 (OH) 2D3) responsables del desenvolupament del hipeparatiroïdisme secundari. Per aquesta raó, és una pràctica comú el tractament d´aquests pacients amb vitamina D (Calcitriol) o anàlegs, com el Paricalcitol. Els pacients amb MRC presenten a més a més nivells de fòsfor sèric elevats associats amb un increment de la mortalitat i morbilitat.Per a comprovar l´eficàcia i els efectes de ambdós tractaments i de la urèmia es va utilitzar com a model rates sotmeses a nefrectomía subtotal i tractades amb Calcitriol o Paricalcitol. Per analitzar l´influència del fòsfor sobre la calcificació vascular i altres afectacions fisiològiques es van utilitzar rates sanes alimentades amb dietes amb diferents continguts en fòsfor, amb i sense l´adicció d´un quelant, el carbonat de lantà. En els experiments in vitro es va treballar amb cèl-lules de múscul llis vascular (CMLV) procedents d´explants d´aortes de rates sotmeses a diferents condicions.Tant el tractament amb Calcitriol com el de Paricalcitol presenten una eficàcia similar a l´hora de disminuir els nivells sèrics de PTH, però el de Calcitriol i no el de Paricalcitol incrementa la calcificació de les cèl-lules de múscul llis vascular (CMLV), in vitro e in vivo, independentment dels nivells de calci i fòsfor. Aquest augment de la calcificació és paral-lel a l´increment de la expressió RANKL/ osteoprotegerina (OPG). La calcificació vascular és un procés actiu, en el qual s´expressen marcadors osteogènics, com RANKL. RANKL és un lligand de RANK (receptor activador de NF-κB) que s´expressa fonamentalment en osteoblasts. Aquest lligand provoca la calcificació de las CMLV de forma dosis dependent. Aquest efecte de RANKL en la calcificació vascular és bloquejat per OPG. És la unió de RANKL al seu RANK i l´activació de la via alternativa de NF-kB la que desencadena l´augment en l´expressió de bone morphogeneticprotein 4 (BMP4), responsable de la calcificació de las CMLV.La urèmia provoca un augment de la calcificació vascular que està relacionada amb la desregulació dels enzims del metabolisme de la vitamina D. Es produeix un augment a nivell de l´arteria dels nivells de 1,25 (OH)2D3, que estimula l´expressió de RANKL en les CMLV induint la seva calcificació. El tractament amb Calcitriol potencia aquest efecte. Aquesta desregulació té lloc a nivell arterial, però no s´observa a nivell renal. Una dieta alta en fòsfor en animals amb funció renal normal no provoca un augment significatiu de les calcificacions vasculars a curt plaç. Tot i així produeix un increment dels nivells sèrics de PTH, que impliquen un augment de sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona amb el seu conseqüent augment en la pressió arterial.Per tant, la calcificació vascular és un procés complexe afectat per múltiples factors que estableixen entre sí multitud de connexions. El bloqueig de RANKL i el control dels nivells sèrics de fòsfor, semblen ser de gran importància a l´hora d´actuar sobre les afectacions cardiovasculars que pateixen els pacients amb MRC. / La calcificación vascular es un fenómeno frecuente en pacientes con enfermedad renal crónica (ERC). Además, estos pacientes presentan una disminución de los niveles de vitamina D (1,25 (OH)2D3) responsables del desarrollo de hiperparatiroisdimo secundario. Por esta razón, es una práctica común el tratar a estos pacientes con vitamina D (Calcitriol) o análogos, como el Paricalcitol. Los pacientes con ERC presentan además niveles de fósforo sérico elevados asociados con un incremento de la mortalidad y morbilidad.Para comprobar la eficacia y efectos de ambos tratamientos y de la uremia se utilizó como modelo ratas sometidas a nefrectomía subtotal y tratadas con Calcitriol o Paricalcitol. Para analizar la influencia del fósforo sobre la calcificación vascular y otras afectaciones fisiológicas se emplearon ratas sanas alimentadas con dietas con diferente contenido en fósforo, con y sin la adicción de un quelante, el carbonato de lantano. En los experimentos in vitro se trabajó con células de músculo liso vascular (CMLV) procedentes de explantes de aortas de ratas sometidas a distintas condiciones.Tanto el tratamiento con Calcitriol como con Paricalcitol presentan una eficacia similar a la hora de disminuir los niveles séricos de PTH, pero el Calcitriol, y no el Paricalcitol incrementa la calcificación de las CMLV, in vitro e in vivo, independientemente de los niveles de calcio y fósforo. Este aumento de la calcificación es paralelo al incremento de la expresión RANKL/ osteoprotegerina (OPG). La calcificación vascular es un proceso activo, en el cual se expresan marcadores osteogénicos, como RANKL. RANKL es el ligando de RANK (receptor activador de NF-κB) que se expresa fundamentalmente en osteoblastos. Este ligando provoca la calcificación de las CMLV de manera dosis dependiente. Este efecto de RANKL en la calcificación vascular es bloqueado por OPG. Es la unión de RANKL a su RANK y la activación de la vía alternativa de NF-κB la que desencadena el aumento en la expresión de bone morphogenetic protein 4 (BMP4), responsable de la calcificación de las CMLV.La uremia provoca un aumento de la calcificación vascular que está relacionada con la desregulación de los enzimas del metabolismo de la vitamina D. Se produce una elevación a nivel de la arteria de los niveles de 1,25(OH)2D3, que estimulan la expresión de RANKL en las CMLV induciendo su calcificación. El tratamiento con Calcitriol potencia este efecto. Esta desregulación tiene lugar a nivel arterial, pero no se observa a nivel renal.Una dieta alta en fósforo en animales con función renal normal no provoca un aumento significativo de las calcificaciones vasculares a corto plazo. Sin embargo produce un aumento de los niveles séricos de PTH, que implican una elevación de sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona con su consecuente aumento en la presión arterial.Por lo tanto, la calcificación vascular es un proceso complejo afectado por múltiples factores que establecen entre si multitud de conexiones. El bloqueo de RANKL y el control de los niveles séricos de fósforo, parecen ser de gran importancia a la hora de actuar sobre las afectaciones cardiovasculares que sufren los pacientes con ERC. / Vascular calcification is a common process in patients with chronic kidney disease (CKD). Furthermore, these patients have reduced levels of vitamin D (1,25 (OH)2D3) responsible for the development of secondary hyperparatiroidism. For this reason, it is common practice to treat these patients with vitamin D (Calcitriol) or analogues, as Paricalcitol. CKD patients also have elevated serum phosphorus levels associated with increased mortality and morbidity.To check the effects of the treatments and the uraemia, we used uremic rats (subjected to subtotal nephrectomy) and treated them with Paricalcitol or Calcitriol. To analyze the influence of phosphorus on vascular calcification and other physiological affectations we used healthy rats fed with diets with different phosphorus content, with and without the addition of a phosphate binder, lanthanum carbonate. In vitro experiments we used vascular smooth muscle cells (VSMC) obtained from explants of aortas of rats subjected to various conditions.Calcitriol and Paricalcitol treatments present similar efficacy to decrease serum PTH, but Calcitriol, and not Paricalcitol, increase the calcification of VSMC in vitro and in vivo independently of the calcium and phosphorus levels. This increase in calcification is parallel to increased expression RANKL / osteoprotegerin (OPG). Vascular calcification is an active process, which are expressed osteogenic markers, such as RANKL. RANKL is the ligand of RANK (receptor activator of NF-κB) which is expressed primarily in osteoblasts. This ligand causes calcification of VSMC in a dose-dependent manner. This effect of RANKL in vascular calcification is blocked by OPG. The bind of RANKL to RANK and its activation of the alternative pathway of NF-κB triggers the increased expression of bone morphogenetic protein 4 (BMP4), that is the responsible for VSMC calcification.Uraemia promotes an increased in vascular calcification that is associated with deregulation of the enzymes of metabolism of vitamin D. The elevation of arterial levels of 1,25 (OH)2D3 stimulates the expression of RANKL inducing VSMC calcification. Calcitriol treatment enhances this effect. This deregulation happens in arteries, but is not observed in the kidneys.Diets with high phosphorus content do not cause a significant increase in vascular calcifications in short-term in animals with normal renal function. But it produces an increase in serum PTH, resulting in an elevation of renin-angiotensin-aldosterone system with the consequent increase in blood pressure.Thus, vascular calcification is a complex process affected by multiple factors that establish many connections between them. The blockade of RANKL and the control of serum phosphorus levels could be very important to minimized cardiovascular damages in patients with CKD

El present estudi s'ha plantejat per aprofundir en la influència de l'equilibri redox en aspectes de la biologia tumoral com són el metabolisme oxidatiu i el creixement cel·lular; a més a més, d'avaluar la importància de les espècies reactives d'oxigen en l'eficàcia de la quimioteràpia i establir la rellevància de la intensitat de l'estrès oxidatiu en la superació de la quimioresistència a fàrmacs convencionals. Els nostres resultats mostren que les diferències en l'estrès oxidatiu s'expressen segons el grau de diferenciació cel·lular i entre regions d'un mateix tumor. L'estat redox cel·lular, així com la resposta immediata al desequilibri oxidatiu generat, són factors determinants tant del creixement de la cèl·lula cancerosa com de l'eficàcia d'alguns agents antitumorals.En conclusió, els moduladors redox capaços de potenciar l'acció pro-oxidant de fàrmacs anticancerosos podrien tenir un potencial benefici per controlar el creixement de les cèl·lules canceroses i sensibilitzar-les novament a l'acció d'agents antitumorals clàssics

Ret és el Receptor Tirosina Quinasa (RTK) per als factors neurotrófics de lafamília de GDNF, que promouen supervivència, diferenciació, migració o creixementcel·lulars, entre altres efectes biològics, durant el desenvolupament i la vida delsorganismes superiors. El desenvolupament de diverses subpoblacions de neuronesderivades de precursors de la Cresta Neural requereixen la senyalització inducida peraquests i altres factors neurotrófics (com NGF) per a proliferar, migrar, diferenciar-se,sobreviure i créixer durant la organogénesis embrionària i/o després del naixement. ElsRTKs s'encarreguen de transportar la informació química de les neurotrofines cap al'interior de la cèl·lula per mitjà d'una varietat de rutes de senyalització molecular, queulteriorment desemboquen en la modulació de l'expressió de diversos gens al nuclicel·lular, donant lloc a determinats efectes biològics. Així, hem estudiat els efectes de lasenyalització de GDNF/Ret para la supervivència de neurones simpàtiques en cultiuprimari, obtingudes de diferents línies de ratolins transgènics que portaven mutacions enresidus específics de tirosina de Ret necessaris per a la iniciació de les diferentscascades de transducció de senyals. En particular, ens vam enfocar a esbrinar quinesvies de senyalització eren necessàries i suficients per al manteniment de les nostresneurones simpàtiques. Els nostres experiments no només van llançar llum sobre quinssón les funcions de les diferents cascades de senyalització activades per Ret, sinó quetambé ens van permetre establir que la supervivència d'aquestes cèl·lules, induïda perGDNF i per NGF, ocorre a través d'un nou mòdul de transducció mai abanscaracteritzat, en el qual l'activació de Tyr1062 de Ret (residu necessari per a l'activacióde les cascades PI3K/Akt i Ras-ERK/MAPK) promouria la viabilitat neuronal a travésde l'activació directa del complex IKKs per B-Raf, en un procés que és independent tantde l'activació de MEKs/ERKs com de la via PI3K/Akt.Alternativament, vam analitzar el paper de les proteïnes de la família de Sprouty,específicament de Spry1, en la regulació de l'activitat de Ret, tant en el model desupervivència de neurones simpàtiques, com en altres paradigmes en els quals larellevància d'aquestes proteïnes ja s'ha posat de manifest anteriorment, com són eldesenvolupament del Sistema Nerviós Entèric i l'organogènesi del tracte Gènito-Urinari. Valent-nos d'un model in vivo amb ratolins nuls per al gen Sprouty1, vamdesenvolupar una nova línia de ratolins doblement mutantes, portant, a més d'aquesta última modificació, el gen de Ret amb la mutació Tyr1062Phe. En aquest context, vampoder determinar que tant en el Sistema Nerviós Simpàtic com en el Entèric, l'absènciade Spry1 no tenia cap efecte significatiu. Más encara, aquesta mutació no mostrava capconseqüència sobre els defectes característics de la mutació Tyr1062Phe en Ret enaquests sistemes. No obstant això, durant el desenvolupament renal, les alteracionsfenotípicas de la mutació de Ret (agènesis o hipodisplasia renal) eren revertits a unfenotip normal per l'eliminació concomitant de Spry1. Aquest sorprenent efecte enspermet hipotetitzar que Sprouty1 és capaç de modular l'activitat de Ret en absència de laseva Tyr1062, plantejant noves possibles vies de senyalització intracel·lular sobre lesquals Spry1 actuaria durant el desenvolupament embrionari dels ronyons. / Ret es el Receptor Tirosina Quinasa (RTK) para los factores neurotróficos de lafamilia de GDNF, que median supervivencia, diferenciación, migración o crecimientocelulares, entre otros efectos biológicos, durante el desarrollo y la vida de losorganismos superiores. El desarrollo de diversas subpoblaciones de neuronas derivadasde precursores de la Cresta Neural requieren la señalización mediada por estos y otrosfactores neurotróficos (como NGF) para proliferar, migrar, diferenciarse, sobrevivir ycrecer durante la organogénesis embrionaria y/o tras el nacimiento. Los RTKs seencargan de transportar la información química de las neurotrofinas hacia el interior dela célula por medio de una variedad de rutas de señalización molecular, queulteriormente desembocan en la modulación de la expresión de diversos genes en núcleocelular, dando lugar a efectos biológicos determinados. Así, hemos estudiado los efectosde la señalización de GDNF/Ret para la supervivencia de neuronas simpáticas en cultivoprimario, obtenidas de diferentes líneas de ratones transgénicos que portabanmutaciones en residuos específicos de tirosina de Ret necesarios para la iniciación delas diferentes cascadas de transducción de señales. En particular, nos enfocamos endeterminar qué vías de señalización eran necesarias y suficientes para el mantenimientode nuestras neuronas simpáticas. Nuestros experimentos no sólo arrojaron luz sobrecuáles son las funciones de las diferentes cascadas de señalización activadas por Ret,sino que también nos permitieron establecer que la supervivencia de estas células,mediada por GDNF y por NGF, ocurre a través de un novedoso módulo de transducciónnunca antes caracterizado, en el cual la activación de Tyr1062 de Ret (residuo necesariopara la activación de las cascadas PI3K/Akt y Ras-ERK/MAPK) mediaría la viabilidadneuronal a través de la activación directa del complejo IKKs por B-Raf, en un procesoque es independiente tanto de la activación de MEKs/ERKs como de la vía PI3K/Akt.Alternativamente, analizamos el papel de las proteínas de la familia de Sprouty,específicamente de Spry1, en la regulación de la actividad de Ret, tanto en el modelo desupervivencia de neuronas simpáticas, como en otros paradigmas en los que larelevancia de dichas proteínas se ha puesto de manifiesto anteriormente, como son eldesarrollo de Sistema Nervioso Entérico y la organogénesis del tracto Génito-Urinario.Valiéndonos de un modelo in vivo con ratones nulos para el gen Sprouty1,desarrollamos una nueva línea de ratones doblemente mutantes, portando, además de esta última modificación, el gen de Ret con la mutación Tyr1062Phe. En este contexto,pudimos determinar que tanto en el Sistema Nervioso Simpático como en el Entérico, laausencia de Spry1 no tenía ningún efecto significativo. Más aún, dicha mutación nomostraba ninguna consecuencia sobre los defectos característicos de la mutaciónTyr1062Phe en Ret en estos sistemas. No obstante, durante el desarrollo renal, lasalteraciones fenotípicas de la mutación de Ret (agénesis o hipodisplasia renales) eranrevertidas a un fenotipo normal por la eliminación concomitante de Spry1. Estesorprendente efecto nos permite hipotetizar que Sprouty1 es capaz de modular laactividad de Ret en ausencia de su Tyr1062, planteando nuevas posibles vías deseñalización intracelular sobre las que Spry1 actuaría durante el desarrollo embrionariode los riñones. / Ret is the Receptor Tirosine Kinase (RTK) for the neurotrophic factors from theGDNF family of ligands (GFLs), which mediate cellular survival, differentiation,migration or growth, among other biological effects, during development and life ofsuperior organisms. The development of diverse subpopulations of neurons derivedfrom precursors of the Neural Crest requires the signalling mediated by these and otherneurotrophic factors (like NGF) for their proliferation, migration, differentiation,survival and growth during the embryonic organogenesis and/or after the birth. TheRTKs transport the chemical information from neurotrophins towards the interior of thecell by means of a variety of molecular pathways, that later end by modulating theexpression of diverse genes in the cellular nucleus, giving rise to determined biologicaleffects. Thus, we have studied the effects of the signalling by GDNF/Ret for thesurvival of sympathetic neurons in primary culture, obtained from different lines oftransgenic mice that carried mutations in specific tyrosine residues in Ret, which arenecessary for the initiation of different transduction signals. Particularly, we focused indetermining which signalling routes are required and sufficient for the maintenance ofour sympathetic neurons. Our experiments not only clarified on which are the functionsfor the different signalling cascades activated by Ret, but also allowed us to establishthat the GDNF- and NGF-induced survival of these cells takes place through a so farunknown transduction module, in which the activation of Ret's Tyr1062 (necessary forthe activation of the PI3K/Akt and ERK/MAPK cascades) mediates neuronal viabilitythrough the direct activation of the IKKs complex by B-Raf, independentlyMEKs/ERKs and PI3K/Akt activation.Alternatively, we analyzed the role that the Sprouty family of proteins play,specifically Spry1, in the regulation of Ret, as much in the model of survival ofsympathetic neurons, like in other paradigms in which the relevance of these proteinshas been shown previously, as it is the case for the development of the Enteric NervousSystem and the organogenesis of the Genito-Urinary Tract. By taking advantage of anin vivo model of null-mice for the Sprouty1 gene, we developed new line of doublymutant mice, carrying, in addition to this mentioned modification, a Tyr1062Phemutation in Ret. In this context, we determined that either in the Sympathetic or in theEnteric Nervous Systems, the absence of Spry1 did not show any significant effect.Moreover, this mutation did not show any consequence on the characteristic defects ofthe Tyr1062Phe mutation in Ret for both systems. However, during the renaldevelopment, the phenotypic alterations due to Ret mutation (renal agenesis orhypodisplasia) were reverted to a normal phenotype by the concomitant elimination ofSpry1. This surprising effect allowed us to hypothesize that Sprouty1 is able tomodulate the activity of Ret in absence of its Tyr1062, rising new possible signallingroutes on which Spry1 could act during the embryonic development of kidneys.

- Introducció: Actualment, hi ha una elevada prevalença d'obesitat en les societats desenvolupades. A causa d'aquest fet, neix un creixent interès per dur a terme una alimentació òptima; així com, de disposar d'adequats biomarcadors robustos de salut/malaltia que ens ajudin a predir si un individu està predisposat a patir una malaltia, com l'obesitat, abans que aquesta es desenvolupi. De manera que, amb aquesta informació es puguin posar en marxa certes estratègies nutricionals per a la seva prevenció. - Contingut de la investigació: L'estudi que s'aborda en aquesta tesi pretén contribuir a identificar i caracteritzar potencials biomarcadors predictius d'obesitat i/o alteracions metabòliques associades. S'ha desenvolupat un model animal basat en la suplementació materna amb leucina durant la lactància, basant-se en la hipòtesi que la suplementació amb leucina podria incrementar els nivells de leptina en llet materna. En aquest context, resultats previs del grup han demostrat el paper protector enfront de l'obesitat de la ingesta de quantitats òptimes de leptina en rates lactants mascles i, en relació a la leucina, encara que hi ha certa controvèrsia en si és beneficiosa o perjudicial, s'ha associat amb l'obesitat i resistència a la insulina. Els resultats indiquen que la suplementació de la dieta estàndard amb leucina (2%) en rates, promou un augment de la leptina en llet i això s'associa al desenvolupament d'una progènie masculina protegida, en certa mesura, enfront del desenvolupament d'obesitat induïda per dietes hipercalòriques. No obstant això, té l'efecte contrari en la progènie femenina, que mostra major propensió a l'obesitat i també resistència a l'acció de la insulina. És interessant destacar que els efectes adversos observats sobre la progènie femenina es contraresten si la suplementació amb leucina es manté la resta de la vida, mentre que a la progènie masculina, això resulta en hiperinsulinèmia. - Conclusió: S'han identificat un conjunt de biomarcadors, dels quals se seleccionen els següents pel seu potencial interès en l'àmbit de l'obesitat i per a la seva validació en altres models experimentals i humans: a) de major susceptibilitat a obesitat en femelles: menor expressió de leptina, adiponectina i UCP2 en teixit adipós; b) de millor control glucèmic en femelles: major proporció de linoleic i menor de oleic i mirístic en plasma; c) de protecció enfront de l'obesitat en mascles: lactància amb llet enriquida en leptina i PUFAs; d) de control glucèmic inadequat en mascles: nivells plasmàtics baixos de linolènic i elevats de linoleic. / - Introducción: Actualmente, existe una elevada prevalencia de obesidad en las sociedades desarrolladas. Debido a este hecho, nace un creciente interés por llevar a cabo una alimentación óptima; así como, de disponer de adecuados biomarcadores robustos de salud/enfermedad que nos ayuden a predecir si un individuo está predispuesto a padecer una enfermedad, como la obesidad, antes de que ésta se desarrolle. De manera que, con esta información se puedan poner en marcha ciertas estrategias nutricionales para su prevención. - Contenido de la investigación: El estudio que se aborda en esta tesis pretende contribuir a identificar y caracterizar potenciales biomarcadores predictivos de obesidad y/o alteraciones metabólicas asociadas. Se ha desarrollado un modelo animal basado en la suplementación materna con leucina durante la lactancia, basándose en la hipótesis de que la suplementación con leucina podría incrementar los niveles de leptina en leche materna. En este contexto, resultados previos del grupo han demostrado el papel protector frente a la obesidad de la ingesta de cantidades óptimas de leptina en ratas lactantes machos y, en relación a la leucina, aunque hay cierta controversia en si es beneficiosa o perjudicial, se ha asociado con la obesidad y resistencia a insulina Los resultados indican que la suplementación de la dieta estándar con leucina (2%) en ratas, promueve un aumento de la leptina en leche y ello se asocia al desarrollo de una progenie masculina protegida, en cierta medida, frente al desarrollo de obesidad inducida por dietas hipercalóricas. Sin embargo, tiene el efecto contrario en la progenie femenina, que muestra mayor propensión a la obesidad y también resistencia a la acción de la insulina. Es interesante destacar que los efectos adversos observados sobre la progenie femenina se contrarrestan si la suplementación con leucina se mantiene el resto de la vida, mientras que en la progenie masculina, ello resulta en hiperinsulinemia. - Conclusión: Se han identificado un conjunto de biomarcadores, de los cuales se seleccionan los siguientes por su potencial interés en el ámbito de la obesidad y para su validación en otros modelos experimentales y humanos: a) de mayor susceptibilidad a obesidad en hembras: menor expresión de leptina, adiponectina y UCP2 en tejido adiposo; b) de mejor control glucémico en hembras: mayor proporción de linoleico y menor de oleico y mirístico en plasma; c) de protección frente a la obesidad en machos: lactancia con leche enriquecida en leptina y PUFAs; d) de control glucémico inadecuado en machos: niveles plasmáticos bajos de linolénico y elevados de linoleico. / - Introduction: Currently, there is a high prevalence of obesity in developed societies. Due to this fact, there is a growing interest for optimal nutrition and, for adequate and robust biomarkers of health/disease to help in the prediction of health outcome, to know whether an individual is predisposed to a disease, such as obesity, before it develops. So, this information can contribute to the implementation of nutritional strategies for prevention. - Research content: The study addressed in this Thesis aims to contribute to the identification and characterization of potential predictive biomarkers of obesity and/or associated metabolic disturbances. We have developed an animal model based on maternal leucine supplementation during lactation, based on the hypothesis that leucine supplementation might increase levels of leptin in breast milk. In this context, previous results of our research group demonstrated the protective role against obesity associated with the intake of optimal amounts of leptin in lactating male rats; and in relation to leucine, although there is some controversy whether beneficial or detrimental, it has been associated with obesity and insulin resistance. The results indicate that supplementation of standard diet with leucine (2%) in rats, promotes an increase in milk leptin, which is associated to the development of a male offspring protected, to some extent, against the development of obesity induced by high energy dense diets. However, it has the opposite effect on the female progeny, showing greater propensity for obesity and resistance to insulin action. Interestingly, the adverse effects on female offspring were counteracted by chronic leucine supplementation, while in the male offspring, this resulted in hyperinsulinemia. - Conclusion: A set of biomarkers have been identified, of which the following are selected for their potential interest in the field of obesity and for validation in other experimental models and humans: a) of increased susceptibility to obesity in females: lower expression of leptin, adiponectin and UCP2 in adipose tissue; b) better glycemic control in females: higher proportion of linoleic acid and lower of oleic and myristic acids in plasma; c) protection against obesity in males: leptin- and PUFA-enriched milk; d) of inadequate glycemic control in males: low plasma levels of linolenic acid and high plasma linoleic acid.

No description available.