Zugl.: Erlangen, Univ., Diss.

Zugl.: Hamburg-Harburg, Techn. Universiẗat, Diss., 1998.

Universiẗat, Diss., 2004--Bielefeld.

This master`s thesis is focused on possibility of use of flue gas as source of CO2 for algae cultivation in bioreactors. The first part of the master`s thesis is devoted to a qualitative and quantitative description of flue gas sources as CO2 source for algae cultivation. In the thesis industry sectors with the largest share of CO2 emissions on a global scale and in the Czech republic are summarized. On the basis of these data it was possible to determine cheap sources of CO2 for algae cultivation producing valuable biomass and other bio-products. The composition of flue gas from these sources was discussed in this section also with given expected outlook within the following years. The next part of the thesis is devoted to the influence of flue gas properties on algae cultivation. The impact of flue gas individual parameters on cell growth rate, quality and composition of biomass is described there. The description and design of the bioreactor is processed in the next part of the thesis. The experimental part of the thesis was performed on a bioreactor with similar properties. The next part of the thesis describes the effect of light on algae cultivation and the design of a regulation scheme for bioreactor light source. The experimental part of the thesis describes methods used to determine the concentrations of flue gas substances that could pass from flue gas into cultivation medium for algae cultivation to measure the changing composition of the flue gas in the closed experimental bioreactor system. The processed data from experimental measurements are presented and are discussed. The change in the composition of the culture medium for algae (without the presence of algae) due to flue gas aeration was monitored in the experimental part. It includes also the measurement of the change in the composition of the flue gas in time. All obtained and collected information are then summarized and discussed in the final part of the master`s thesis.

Kväve har tidigare endast utvunnits ur atmosfären med hjälp av naturligt förekommande kvävefixerande bakterier men i och med uppkomsten av Haber-Bosch processen under tidigt 1900 – tal har det blivit möjligt att utvinna kväve ur atmosfären på kostgjord väg. Detta har lett till en obalans i kvävets naturliga kretslopp. Kväve har, sedan processen kom i bruk, utvunnits i stora kvantiteter för användning som bland annat gödningsmedel i jordbruksindustrin och som komponent i vanligt förekommande sprängmedel.   Kväveformen som används i dessa industrier är nitrat-, (NO3-)-, vilket fungerar som näringsämne åt växter. Då överskott av nitrat lakas ut, löser sig och sprids med vatten, kan det leda till övergödning i sjöar, hav och vattendrag. Ett hav som är hårt drabbat av detta är Östersjön.   Biologiska reningsmetoder har länge använts för att rena vatten från olika vattenlösliga kväveformer som nitrat, nitrit-, (NO2-), och ammonium-, (NH4+). De biologiska reningsmetoderna härstammar från kvävets kretslopp där de förekommer naturligt och innefattar processerna denitrifikation, nitrifikation och anammox. Genom att skapa förhållanden som gynnar de olika biologiska processerna har de effektivt använts för kväverening vid både kommunala reningsverk och för rening av dräneringsvatten från jordbruk. Processerna kan kombineras i olika utformningar eller användas enskilt beroende på vilken kväveform som förekommer i vattnet.   System för rening av nitratutsläpp härstammande från sprängmedel är relativt nytt. Denna rapport beskriver anläggningen och uppföljningen av en passiv denitrifierande bioreaktor med syfte att rena vatten från nitrat härstammande från sprängmedel. Bioreaktorn är den andra i sitt slag i Sverige och utöver dessa två förekommer inga andra bioreaktorer som renar vatten från sprängmedel i Sverige idag.   Rapporten innehåller en utvärdering av bioreaktorns nitratreduktion och jämför metoden med andra vanliga systemutformningar och metoder för nitratrening. Jämförelsen och utvärderingen har gjorts med hjälp av en litteraturstudie och genom kemiska analyser. Den kemiska analysen omfattar analys av nitratkväve, ammoniumkväve, pH, alkalinitet, temperatur och elektrisk konduktivitet.   Vattenprover har tagits under uppstart perioden av bioreaktorn vilket och har omfattat de 36 första dagarna från och med att bioreaktorns driftstart den 2017-06-29 till och med 2017-08-02. Under denna tid har bioreaktorn uppvisat en nitrat- och ammoniumproduktion i kombination med en alkalinitetförbrukning. Alkalinitetförbrukningen har med största sannolikhet uppkommit till följd av nedbrytningen av det organiska materialet och nitrat- och nitratproduktionen kommer av ett lågt C/N förhållande i de träslag som används som kolkälla. Ammoniumproduktionen härstammar förmodligen från en kombination av den förbrukade alkaliniteten och C/N förhållandet i trädslagen. Analysresultaten har på grund av dessa resultat inte kunnat bidra till en utvärdering av bioreaktorn. Litteraturstudien visar dock att den denitrifierande bioreaktorn är det reningssystem som är mest lämpat för nitratrening med hänsyn till de förhållanden som råder avseende den omgivande miljön och vattnets kemiska innehåll. Studien visar även att ett antal förändringar i utformningen av bioreaktorn skulle kunna öka bioreaktorns driftsäkerhet. / Nitrogen has previously only been extracted from the atmosphere by naturally occurring nitrogen-fixing bacteria, but with the development of the Haber-Bosch process in the early 1900s it has been made possible to extract nitrogen from the atmosphere artificially. This has led to an imbalance in nitrogen’s natural cycle. Nitrogen has, since the process has been put in use, been extracted in large quantities for the use as a fertilizer in the agricultural industry and as a component of commonly used explosives.   The nitrogen form used in these industries is nitrate, (NO3-), which acts as a nutrient to plants. As excess nitrate dissolves and spreads with water it can lead to eutrophication in lakes, seas and streams. A sea largely affected by this is the Baltic Sea.    Biological treatment methods have long been used to purify water from various water-soluble nitrogen forms such as nitrate, nitrite, (NO2-), and ammonium, (NH4+). The biological purification methods are derived from the nitrogen cycle where they occur naturally and they include the processes of denitrification, nitrification and anammox. By creating conditions that benefit the various biological processes, they have effectively been used for removing nitrogen in both municipal wastewater treating plants and for drainage water from agriculture. The processes can be combined in different designs or used individually depending on the nitrogen form present in the water.   Systems for purifying water from nitrate originating from explosives are a relatively new. This report describes the construction and follow-up of a passive denitrifying bioreactor used to purify water from nitrate derived from explosives. The bioreactor is the second of its kind in Sweden and in addition to these two there are no other bioreactors that treat water impacted by explosives in Sweden today.   The report contains an evaluation of the bioreactors nitrate reduction and compares the method with other commonly used system designs and methods for nitrate purification. The comparison and evaluation has been made using a literature study and through chemical analyses. The chemical analyses include analysis of nitrate, ammonia, pH, alkalinity, temperature and electrical conductivity.   Water samples have been collected during the start-up period of the bioreactor which includes the first 36 days from the day the bioreactor was put in operation, 2017-06-29 through 2017-08-02. During this time the bioreactor has demonstrated a nitrate- and ammonia production in combination with alkalinity consumption. The alkalinity consumption is most likely do to the degradation of the organic material and the nitrate production comes from a low C/N ratio in the woods used as source for carbon. Ammonia production is likely to derive from a combination of the alkalinity consumption and the C/N ratio in the woods. Because of these results, the results of the analysis have not been able to contribute to the evaluation of the bioreactor. However, the literature study shows that the denitrifying bioreactor is the most suitable purification system for nitrate purification, taking into consideration the environmental conditions and the waters chemical content. The study also shows that a number of changes in the design of the bioreactor could increase the bioreactors reliability.

Gonorrhea is the second most common sexually transmitted infection worldwide and is caused by Gram-negative, human-specific diplococcus Neisseria gonorrhoeae. It colonizes the mucosal surface of the female reproductive tract and the male urethra. A rapid increase in antibiotic resistance makes gonorrhea a serious threat to public health worldwide. Since N. gonorrhoeae is a human-specific pathogen, animal infection models are not able to recapitulate all the features of infection. Therefore, a realistic in vitro cell culture model is urgently required for studying the gonorrhea infection. In this study, we established and characterized three independent 3D tissue models based on the porcine small intestinal submucosa (SIS) scaffold by co-culturing human dermal fibroblasts with human colorectal carcinoma, endometrial epithelial, and male uroepithelial cells. The histological, immunohistochemical, and ultra-structural analysis showed that the 3D SIS scaffold-based models closely mimic the main characteristics of the site of gonococcal infection in the human host including the formation of epithelial monolayer, underlying connective tissue, mucus production, tight junction (TJ), and microvilli. In addition, functional analysis such as transepithelial electrical resistance (TEER) and barrier permeability indicated high barrier integrity of the cell layer. We infected the established 3D tissue models with different N. gonorrhoeae strains and derivatives presenting various phenotypes regarding adhesion and invasion. The results showed disruption of TJs and growing the interleukins production in response to the infection, which depends on the type of strain and cell. In addition, the 3D tissue models supported bacterial survival, which provided an appropriate in vitro model for long-term infection study. This could be mainly because of the high resilience of the 3D tissue models based on the SIS scaffold to the infection in terms of alteration in permeability, cell destruction, and bacterial transmigration. During gonorrhea infection, a high level of neutrophils migrates to the site of infection. The studies also showed that N. gonorrhoeae can survive or even replicate inside the neutrophils. Therefore, studying the interaction between neutrophils and N. gonorrhoeae is substantially under scrutiny. For this purpose, we generated a 3D tissue model by triple co-culturing of human primary fibroblast cells, human colorectal carcinoma cells, and human umbilical vein endothelial cells. The tissue model was subsequently infected by N. gonorrhoeae. A perfusion-based bioreactor system was employed to recreate blood flow in the side of endothelial cells and consequently study human neutrophils transmigration to the site of infection. We observed neutrophils activation upon the infection. Furthermore, we demonstrated the uptake of N. gonorrhoeae by human neutrophils and reverse transmigration of neutrophils to the basal side carrying N. gonorrhoeae. In summary, the introduced 3D tissue models in this research represent a promising tool to investigate N. gonorrhoeae infections under close-to-natural conditions. / Tripper ist die zweithäufigste sexuell übertragbare Krankheit weltweit und wird durch Gram negative, humanspezifische Diplokokken Neisseria gonorrhoeae verursacht. Das human Pathogen besiedelt die Schleimhautoberfläche des weiblichen Fortpflanzungstraktes und der männlichen Harnröhre. Die rasante Zunahme der Antibiotikaresistenzen macht Gonorrhö zu einer ernsthaften Bedrohung für die öffentliche Gesundheit weltweit. Da N. gonorrhoeae ein humanspezifischer Erreger ist, ist es nicht möglich alle Merkmale einer Infektion in Tiermodellen nachzustellen, daher ist ein realistisches In-vitro-Zellkulturmodell für die Untersuchung der Gonorrhö-Infektion dringend erforderlich. In dieser Studie haben wir drei unabhängige 3D- Gewebemodelle etabliert und charakterisiert, die auf dem Gerüst der Schweine-Submukosa (SIS) basieren, indem wir menschliche dermale Fibroblasten mit menschlichen Darmkrebs-, Endometrialepithel- und männlichen Uroepithelzellen kultivieren. Die histologischen, immunhistochemischen und ultrastrukturellen Analysen zeigten, dass die 3D SIS-Gerüstmodelle die Hauptmerkmale der Stelle der Gonokokken Infektion im menschlichen Wirt genau nachahmen, indem sich Epithelien Monoschichten ausbildeten, unter denen sich Bindegewebe erstrechte. Zudem wiesen die Zellen enge Zell-Zell Kontakte auf und es kam zur Produktion von einer Mukosaschicht sowie Mikrovilli in den Modellen. Darüber hinaus zeigten Funktionsanalysen wie die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) und die der Barriere Durchlässigkeit eine hohe Barriere Integrität der Zellschicht. Wir haben die etablierten 3D- Gewebemodelle mit verschiedenen N. gonorrhoeae-Stämmen und Derivaten infiziert, die verschiedene Phänotypen bezüglich der Adhäsion und der Invasion aufwiesen. Die Ergebnisse zeigten eine Unterbrechung der engen Zellverbindungen und eine Zunahme der Interleukin Produktion als Reaktion auf die Infektion, dessen Ausprägung allerdings stark von der Art des Stammes und des verwendeten Zelltyps abhängig ist. Darüber hinaus unterstützten die 3D- Gewebemodelle das bakterielle Überleben, was ein geeignetes In-vitro-Modell für Langzeit- Infektionsstudien liefert. Dies könnte vor allem auf die hohe Widerstandsfähigkeit der SIS- Gerüstmodelle gegen Infektionen in Bezug auf Veränderung der Permeabilität, Zellzerstörung und Bakterienwanderung zurückzuführen sein. Während der Gonorrhoe-Infektion wandert ein hoher Anteil an Neutrophilen an den Ort der Infektion. Die Studie zeigte auch, dass N. gonorrhoeae in den Neutrophilen überleben konnten oder sich sogar in diesen vermehren konnten. Deshalb wurde besonderes die Interaktion zwischen Neutrophilen und N. gonorrhoeae näher betrachtet. Zu diesem Zweck haben wir ein 3D-Gewebemodell mit Hilfe einer dreifache Co-Kultivierung von menschlichen primären Fibroblasten Zellen, menschlichen kolorektalen Karzinomzellen und menschlichen Nabelvenenendothelzellen erstellt. Das Gewebemodell wurde anschließend mit N. gonorrhoeae infiziert. Ein perfusionsbasiertes Bioreaktorsystem wurde eingesetzt, um den Blutfluss auf der Seite der Endothelzellen nachzuahmen und somit konnte die Auswanderung menschlicher Neutrophile zur Infektionsstelle untersucht werden. Darüber hinaus konnte mit diesem Modell die Aufnahme von N. gonorrhoeae in menschliche Neutrophilen und deren Rückwanderung in den Blutfluss beladen mit N. gonorrhoeae nachgewiesen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Forschung vorgestellte 3D-Gewebemodell ein vielversprechendes Instrument zur Untersuchung von N. gonorrhoeae-Infektionen unter naturnahen Bedingungen darstellt.

Ziel der Dissertation ist die Entwicklung eines Perfusionsbioreaktors, um physiologische Zellnischen nachzuahmen und damit 3-dimensionale (3D) Knochenkonstrukte mit knochenähnlichen Eigenschaften zu erzeugen. Zukünftig sollen diese Konstrukte das klinische Ergebnis der Knochendefektheilung verbessern und die biomechanische Belastbarkeit wiederherstellen. Dazu sind neue 3D-Tissue-Engineering-Entwicklungen notwendig, weil die existierenden Zellkultivierungsgefäße übermäßig vereinfacht und nicht hinreichend sind.. Folglich werden in dieser Arbeit mehrere Technologien kombiniert, um physiologische Nischen zu schaffen und klinisch anwendbare Knochenkonstrukte in vitro abzuleiten.

År 2010 fanns enligt Länsstyrelsen (2011) 80 000 platser som misstänktes vara förorenad och har uppskattats kosta 45 miljarder kronor att åtgärda och ta 40 år. Fastigheten Brynäs 19:7 i Gävle, där Cloetta och tidigare verksamheter har bedrivits, är förorenad med bland annat PAH, PCB, metaller och petroleumkolväten. Fastigheten ska bli ett bostadsområde men behöver först genomgå någon typ av saneringsåtgärd. För att välja den mest hållbara saneringstekniken är multikriterieanalys (MKA) ett bra verktyg. Inom MKA finns nu SCORE som är specifikt framtagen för förorenad mark, efterbehandling och beslutsfattande. Syftet med detta arbete är att ta fram åtgärdsförslag åt Gävle kommun för omhändertagandet av förorenad mark på Brynäsområdet 19:7. Målsättningen är att utreda för lämpliga efterbehandlingsmetoder och välja den bästa genom en utförd MKA. Under kapitlet Metod beskrivs hur studien kom till, tillvägagångssättet för litteraturundersökningen och MKA:n, samt viktiga val. Litteraturundersökningen består av information om Brynäs 19:7, bland annat om föroreningssituationen och en allmän områdesbeskrivning. Sedan följer en litteraturundersökning om de valda efterbehandlingsmetoderna; Biosan, Bioreaktor, Daramend, Jordtvätt, Termisk behandling och Vakuum extraktion. Biosan, Bioreaktor och Daramend är biologiska metoder och jordtvätt en fysikalisk metod. Efterbehandlingsmetoderna innehåller främst en processbeskrivning, typ av föroreningar den kan behandla och reningsgraden. Resultatet har sammanställts i ett antal stapeldiagram, varav samtliga presenteras ur ett hållbarhetsperspektiv där alla tre hållbarhetsdomäner har inkluderats. Det har framgått från resultatet att Vakuum extraktion är det mest hållbara alternativet. Diskussionen innefattar bland annat problemen kring fyllnadsmassorna på området, Off-site kriterier och resultatet. Slutsatsen är Vakuum extraktion är den mest hållbara av alternativen vid en sanering av fastigheten Brynäs 19:7 och det rekommenderas att metoden används, alternativt termisk behandling. Metoderna skulle även kunna kombineras för att minska deras svagheter och få en effektiv rening av de föroreningar som kräver sanering. De begränsningar som funnits har främst varit tidsbrist på grund av den omfattande multikriterieanalysen. Brist på information om Brynäs 19:7 och om de olika saneringsteknikerna har även till viss del varit en begränsande faktor. / In 2010, there was according to the County Administrative Board (2011) 80 000 sites suspected of being contaminated, and has been estimated to cost 45 billion to fix and take 40 years. The property Brynäs 19:7 in Gävle, where Cloetta and past operations have been conducted, is contaminated with mostly PAHs, PCBs, metals and petroleum hydrocarbons. The property will be a residential area but need to first undergo some type of remediation action. In order to choose the most sustainable remediation technology, a multi-criteria analysis (MCA) is a fitting tool to use. Within MCA is now SCORE, a specifically designed program for contaminated land, remediation and decision making. The purpose of this work is to develop and present proposals for actions to take to Gävle municipality, for disposal of contaminated soil at Brynäs 19:7. The goal is to determine the appropriate treatment methods and choose the best one by doing an MCA. In the methodology chapter it is described how the study came to be, the approach of the literature review, the MCA and important choices. The literature review consists of information on Brynäs 19: 7, including the pollution situation and a general description of the area. Then follows a literature review on the selected remediation methods; BioSan, Bioreactor, Daramend, Soil Washing, Thermal processing and Vacuum extraction. BioSan, Bioreactor and Daramend are biological methods, and soil washing a physical method. The remediation methods mainly contain a process description, type of pollution it can process and purification degree. The results have been compiled in a number of bar graphs, all of which are presented from a sustainability perspective, where all three sustainability domains have been included. The result shows that Vacuum extraction is the most viable option. The discussion includes the problems surrounding the filling material of the area, Off-site criteria and results. The conclusion is that the Vacuum extraction is the most sustainable of the alternatives to a clean-up of the property Brynäs 19: 7 and it is recommended that the method is used, alternatively Thermal processing. The methods could be combined to reduce their weaknesses and get an effective removal of the contaminants that require remediation. The limitations that existed have been mainly lack of time because of the extensive MCA. Lack of some information on Brynäs 19: 7 and about the various remediation techniques have to some extent been a limiting factor.

Summary Juliane Schneevoigt „Investigation of time- and pressure-dependent expression of different components of the extracellular matrix by chondrocytes in vitro” Institute of Anatomy, Histology and Embryology of the University of Leipzig Submitted in June 2015 98 pages, 34 figures, 41 tables, 153 references keywords: cartilage, chondrocytes, hydrostatic pressure, bioreactor, qPCR Introduction Hyaline cartilage maintains the basic function of transmitting articular pressure load within synovial joints and therefore provides the basis for the movements of an organism. Being a small coverage of the joint surface, it shows a composition designed to match this function specifically. A high amount of proteoglycans and its associated water determines the elastic formability of the hyaline cartilage which allows the absorbance of pressure and shear forces. These proteoglycans, mainly based on aggrecan as core-protein, are embedded into a meshwork of collagen fibres, primarily formed of collagen type II. This composition is not to be understood as a static construct; moreover it is exposed to biophysical forces that permanently require a dynamic adaptation. This adaptation of the extracellular matrix formed by proteoglycans and collagen type II is organised by a small number of embedded chondrocytes, the cells of the hyaline cartilage. As chondrocytes are post-mitotic cells and due to the lack of vascularisation within hyaline cartilage, there is hardly any chance for regeneration of defects in order to maintain the integrity of the tissue. The resulting replacement is formed as fibrocartilage, which has not the capability to withstand the biodynamical forces within the joint. As these defects in hyaline cartilage represent a gross of the diseases of the musculoskeletal system, there is a high medical interest in the development of innovative cell-based therapies, as autologous chondrocyte transplantation (ACT) is one. With this type of therapy in vitro cultivated chondrocytes are seeded into a cartilage defect with the aim of producing hyaline cartilage. Aims of the study In the last decades the need for a detailed understanding of the biodynamics of cartilage became obvious for further development of therapies. The aim of this study was therefore to establish a cell culture system to provide an insight into the biodynamics of chondrocytes. Aside from the examination of the differentiation of in vitro cultivated chondrocytes and their synthesis of extracellular matrix as a function of the cultivation time, another aim of this study was to determine whether the application of hydrostatic pressure might have beneficial influence on the expression of extracellular matrix components by chondrocytes in vitro, in accordance with the hyaline cartilage. Material and methods Human articular chondrocytes were cultivated in vitro without the application of hydrostatic pressure in the first place. The cells were observed phase contrast microscopically and the distribution of collagen type I and II was detected immuncytochemically. In further experiments optical confluent chondrocytes were transferred to a bioreactor system applying a hydrostatic pressure of 5 or 10 bar with variable time periods of the pressure applied. Subsequently, the expression of collagen type I, collagen type II and aggrecan was investigated and quantified using qPCR and Western Blot. Chondrocytes cultivated exclusively without the application of hydrostatic pressure served as controls. In this pilot-study the samples were analysed using arithmetic mean and standard deviation to evaluate the power statistically. In addition, similar test conditions with marginal differences were pooled and the necessary sample size to meet a power of 80 % with an alpha error of 0.05 was calculated using the maximum potential standard deviation. In cases where this statistic power was obtained, an analysis of significance (\"One Way Analysis of Variance”) was carried out meeting a significance level under 0.05. Results During the cultivation of chondrocytes in vitro without hydrostatic pressure the length of the cultivation time did neither show an effect on the phase contrast microscopical morphology nor on the immuncytochemically detected distribution of collagen typ I and II. The application of increased hydrostatic pressure for 24 hours results in a 0.2-0.8-fold decrease of the expression of collagen type I and II and a 1.7-2.2-fold increase of aggrecan expression compared to the unloaded controls. This effect was more distinct with 5 bar but was accompanied by instabilities in the cell culture. This is why further investigations concentrated on the use of 10 bar pressure with subsequently shortened time period of the applied pressure. With short times of loading (1.5 and 3 hours) a pressure load of 10 bar led to a 0.8 fold decrease of the expression of collagen type I and II and showed a 1.6-2.4 fold increase of aggrecan expression. These qPCR results were supported by the protein expression of collagen type I, II and aggrecan detected in Western Blot. Conclusions A cell culture system was established to examine the effect of hydrostatic pressure on the expression of chondrocytes on the one hand, which can further be modified for the assembly of cell transplants on the other hand. Subsequently the results of this study led to a definition of cell culture conditions, stimulating the extracellular matrix production of chondrocytes towards the composition of hyaline cartilage. This was the case using a seeding density of 104 cells/cm2 and a pre-cultivation time of 6 days of normal pressure, followed by the application of 10 bar hydrostatic pressure for 1.5-3 h. With the help of this pilot-study a cell culture system was established to gain more information on biodynamics of hyaline cartilage. Moreover it is possible that this information will provide a basis for further development of cell based therapies of cartilage defects, such as ACT. / Zusammenfassung Juliane Schneevoigt „Untersuchung der zeit- und druckabhängigen Expression verschiedener Komponenten der extrazellulären Matrix durch Chondrozyten in vitro“ Veterinär-Anatomisches Institut der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Juni 2015 98 Seiten, 34 Abbildungen, 41 Tabellen, 153 Literaturangaben Schlüsselwörter: Knorpel, Chondrozyten, hydrostatischer Druck, Bioreaktor, qPCR Einleitung Der hyaline Knorpel gewährleistet die grundlegende Funktion der Druckübertragung innerhalb der synovialen Gelenke und stellt somit die Grundlage für die Bewegung des Organismus dar. Als schmaler Überzug der Gelenkflächen ist er in seinem Aufbau an diese Funktion spezifisch angepasst. Dabei bedingt der hohe Gehalt an Proteoglykanen und das an diese assoziierte Wasser die elastische Verformbarkeit des hyalinen Knorpels, die es ermöglicht, Druck- und Scherkräfte abzufedern. Die Proteoglykane, die hauptsächlich auf Aggrekan als Kernprotein basieren, sind in ein Maschenwerk kollagener Fasern eingelagert, welches im Wesentlichen durch Kollagen Typ II gebildet wird. Diese Zusammensetzung darf nicht als statisches Konstrukt verstanden werden. Vielmehr ist der hyaline Knorpel in vivo verschiedenen biophysikalischen Einflüssen ausgesetzt, die eine dynamische Anpassung erfordern. Solche Anpassungsvorgänge in Form einer Änderung der Zusammensetzung der aus kollagenen Fasern und Proteoglykanen bestehenden extrazellulären Matrix werden durch die wenigen eingelagerten Chondrozyten, die Zellen des hyalinen Knorpels, organisiert. Da die reifen Chondrozyten jedoch keine Zellteilungen aufweisen und dem hyalinen Knorpel eine Vaskularisierung fehlt, ist eine Defektregeneration kaum möglich, sodass eine Wiederherstellung der Integrität des Gewebes unterbleibt und stattdessen ein Ersatzknorpel, der Faserknorpel, gebildet wird, welcher den einwirkenden biodynamischen Belastungen jedoch nicht standhalten kann. Da die Defekte des hyalinen Knorpels einen Großteil der Erkrankungen des Bewegungsapparats darstellen und zudem die Arthrose als Langzeitfolge nach sich ziehen, besteht ein hohes medizinisches Interesse an der Entwicklung zellbasierter Therapieansätze, wie der Autologen Chondrozytentransplantation (ACT). Hierbei werden - bislang mit unterschiedlichen Erfolgen – in vitro kultivierte Chondrozyten mit dem Ziel, neuen hyalinen Knorpel zu bilden, in einen Knorpeldefekt eingebracht. Ziele der Untersuchungen In den letzten Jahrzehnten zeigte sich, dass die Entwicklung von Therapieansätzen zur Behandlung von Knorpeldefekten ein detaillierteres Verständnis des Knorpelgewebes und speziell dessen Biodynamik erfordert. Ziel dieser Arbeit war es daher, im Rahmen einer Pilotstudie, ein In-vitro-System zu etablieren, welches die Untersuchung der Biodynamik der Chondrozyten ermöglicht. Neben der Untersuchung der Morphologie der Chondrozyten und der durch sie synthetisierten extrazellulären Matrix in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit der Zellen, wurde die Fragestellung bearbeitet, ob durch die Wirkung eines hydrostatischen Drucks günstige Effekte in Hinblick auf die Expression einer extrazellulären Matrix, wie sie im hyalinen Knorpel vorliegt, erzielt werden kann. Materialien und Methoden Eine Primärkultur humaner artikulärer Chondrozyten wurde zunächst unter Standardzellkulturbedingungen und atmosphärischem Druck kultiviert. Die Zellen wurden phasenkontrastmikroskopisch und hinsichtlich der Verteilung von Kollagen Typ I und II immunzytochemisch untersucht. In den weiteren Versuchen wurden optisch konfluente Chondrozyten in einen Bioreaktor überführt und weiter unter einem hydrostatischen Druck von 5 oder 10 bar kultiviert. Dabei wurde die Dauer der Druckeinwirkung auf die Chondrozyten variiert. Das Expressionsmuster der so kultivierten Chondrozyten wurde quantitativ in Hinblick auf Kollagen Typ I und II sowie Aggrekan mittels qPCR und Western Blot untersucht. Dabei dienten jeweils Chondrozyten, die ohne erhöhte Druckbedingungen kultiviert wurden, als Kontrollen. In dieser Pilotstudie wurden die Proben unter Berechnung der Mittelwerte und Standardabweichung hinsichtlich ihrer statistischen Power ausgewertet. Neben dieser Analyse der Einzelergebnisse wurden die Versuchsbedingungen, die kaum Unterschiede in den Ergebnissen aufwiesen, in Gruppen zusammengefasst und mit Hilfe der größtmöglichen vorhandenen Standardabweichung der Stichprobenumfang eines Versuchs errechnet, welcher die statistische Power der Ergebnisse bei einem Alpha-Fehler von 0,05 auf 80% erhöht. In den Fällen, in denen diese Power erreicht wurde, erfolgte eine Untersuchung der Unterschiede auf Signifikanz („One Way Analysis of Variance“) bei einem Signifikanzniveau < 0,05. Ergebnisse Während der In-vitro-Kultivierung der Chondrozyten unter atmosphärischem Druck zeigte die Länge der Kultivierungszeit weder einen Einfluss auf die phasenkontrastmikroskopisch untersuchte Morphologie der Zellen noch auf die immunzytochemisch detektierte Verteilung des Kollagen Typ I und II. Die Wirkung eines erhöhten hydrostatischen Drucks (5 bar, 10 bar) für 24 Stunden führte zu einer Abnahme der Expression von Kollagen Typ I und Typ II auf das 0,2-0,8-fache bei gleichzeitiger Zunahme der Expression des Aggrekan auf das 1,7-2,2-fache, verglichen mit der unbehandelten Kontrolle. Dieser Effekt war bei 5 bar ausgeprägter als bei 10 bar, führte jedoch gleichzeitig zu einer starken Instabilität des Zellkultursystems. Vor diesem Hintergrund wurde für den höheren Druck (10 bar) die Zeitdauer der Druckeinwirkung verkürzt. Hierbei konnten bei kurzzeitiger Druckeinwirkung von 10 bar (1,5 und 3 Stunden) bei Erhalt der Zellen ähnliche Effekte erzielt werden wie für die Bedingung 5 bar, 24 Stunden. Die Expression von Kollagen Typ I und Typ II sank auf das 0,8-fache, wohingegen ein Anstieg der Aggrekanexpression auf das 1,6-2,4-fache erreicht wurde. Diese Ergebnisse der qPCR konnten durch die im Western Blot für Kollagen Typ I, II und Aggrekan detektierte Proteinexpression gestützt werden. Schlussfolgerungen Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein In-vitro-System etabliert, welches einerseits der Untersuchung des Einflusses von hydrostatischem Druck auf die Expression von Chondrozyten dienen und andererseits für die Herstellung von Zelltransplantaten weiter modifiziert werden kann. Die Ergebnisse der Untersuchungen führten zur Definition von Bedingungen für das In-vitro-System, unter denen die Expression der extrazellulären Matrix durch die Chondrozyten in Richtung der Zusammensetzung im hyalinen Knorpel stimuliert werden kann. Dies zeigte sich bei einer Aussaat der humanen Chondrozyten in einer Konzentration von 104 Zellen/cm2 und einer Vorkultivierungszeit von 6 Tagen unter Normaldruck, gefolgt von der Kultivierung unter hydrostatischem Druck von 10 bar für 1,5 bis 3 Stunden. Mit Hilfe dieser Pilotstudie wurde somit ein In-vitro-System etabliert, auf dessen Basis Untersuchungen durchgeführt werden können, die weiterführende Erkenntnisse zur Biodynamik des hyalinen Knorpels liefern und der zukünftigen Entwicklung zellbasierter Therapieansätze der Knorpeldefekte, wie der ACT, zu Gute kommen.

Zugl.: Erlangen, Nürnberg, Universiẗat, Diss., 2007.