Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008.

Universiẗat-Gesamthochsch., Diss.--Paderborn, 1996.

Explosives used in the mining industry release nitrate into the environment, causing concerns for the water quality in local river-systems. One way of reducing the nitrate loading into the environment is through a woodchip bioreactor. Water is passed through the bioreactor, where denitrifying microbial communities use the organic carbon from the substrate for energy, together with the nitrate. The efficiency of the denitrification process depends on various factors, including the type of carbon source selected and the temperature. To determine a suitable organic substrate to use in colder environments, column experiments were conducted, comparing different woodchip types. Three columns contained woodchips from pine, spruce and birch. In the fourth column, barley wheat was mixed with pine woodchips. An influent solution was pumped into the columns contained 50 mg/L nitrate-nitrogen. The effluent water was sampled and analysed twice per week for nitrate, nitrite and ammonium concentrations. The pH and alkalinity were analysed weekly to determine that denitrification was taking place. Three column conditions were tested. During the initial period, the columns were kept in 21 °C with a hydraulic residence time (HRT) of 6.3 days. In the following period, the columns were refrigerated at a temperature of 5°C. During the final period, the HRT was lowered to 3.2 days. After a 106-day runtime, it could be concluded that pine woodchips were the most effective substrate for denitrification in 5 °C temperature. The column with pine woodchips removed nitrate efficiently and produced the least amount of by-products and released DOC with a short HRT. The pine woodchips and barley straw column had high nitrite accumulation, and the nitrate removal rate in the birch and spruce woodchip columns was low in 5 °C conditions. / Sprängmedel som används inom gruvindustrin släpper ut nitrat i miljön, vilket kan leda till problem med vattenkvaliteten i lokala vattensystem. Ett sätt att reducera mängden nitrat som släpps ut är genom en bioreaktor med träflis. Vatten passeras genom bioreaktorn, där denitrifierande microbakteriella grupper använder det organiska kolet från substratet för energi, tillsammans med nitratet. Effektiviteten av den denitrifierande processen beror på flertalet faktorer, däribland vilken sorts kolkälla som valts ut och vilken temperatur bioreaktorn håller. För att identifiera ett bra organiskt substrat att använda i kallt klimat genomfördes ett kolumnexperiment som jämförde olika sorters träflis. Tre kolonner innehöll träflis från tall, gran och björk. I en fjärde kolonn blandades kornhalm med träflis från tall. En lösning med koncentrationen 50 mg/L kväve i form av nitrat pumpades in i kolonnerna. Utloppsvattnet från de fyra kolonnerna analyserades två gånger per vecka för koncentration av nitrat, nitrit och ammonium. pH och alkalinitet analyserades varje vecka för att se att denitrifikation skedde. Tre olika förutsättningar testades i kolonnerna. I den första perioden hölls kolonnerna i 21 °C med en hydraulisk uppehållstid på 6,3 dagar. I den följande perioden kyldes kolonnerna till 5 °C. I den sista perioden sänktes uppehållstiden till 3,2 dagar. Efter 106 dagar gick det att fastställa att tall-träflisen var det mest effektiva substratet för denitrifikation i 5 °C. Kolonnen med träflis från tall sänkte nitrathalten i vattnet och producerade minst biprodukter, samt frigjorde organiskt kol även vid kort uppehållstid. Kolonnen med tallflis och kornhalm ackumulerade mycket nitrit, och kolonnerna med träflis från björk och gran hade låga nivåer av nitrat-rening när temperaturen sänktes till 5 °C.

This diploma thesis deals with the bioreactor system and its use for the production of heat and biogas. The bioreactor uses the composting and metanogation process of fermentation that humanity has known for hundreds of years, but the combination of these processes is a relatively unexplored area. The theoretical part of the thesis analyzes the existing possibilities of utilization of the heat generated in the compost, and also describes the used technology of small biogas stations and other small systems for biogas production. It follows the practical part of the work, when it was the task to design a bioreactor working at low temperatures during the winter. Part of the solution is the initial design and testing of the basic test structure of the bioreactor, followed by the implementation of a more advanced and more complex system, including a control and measuring center realized by a microcontroller.

Nitrogen and phosphorus are involved in many processes on the Planet Earth. Especially in agricultural areas water is contaminated by nutrients, which can cause the eutrophication of surface waters, and other problems. The solution could be use of denitrifying bioreactors, which are used for the reduction of high nitrate concentrations in shallow groundwaters. The subject of the thesis was the study of phosphorus removal in the denitrification bioreactor by steel turnings, which are constituent part of the organic load of the bioreactor. Steel turnings release Fe, which causes the precipitation and adsorption of P. Eight bioreactors were filled with poplar woodchips. To these columns just above the surface were added model water enriched with nitrate nitrogen, phosphate phosphate was added to 4 columns, where two of them were enhanced by the addition of steel turnings upstream of the wood medium. Sampling and the analyses of the samples were determined weekly, determination of the phosphorus, iron and other substances necessary for the detection of processes in the bioreactor was performed. The dependence of phosphorus removal on the bioreactor operating conditions was evaluated based on measured data, and the effect of iron on the biological denitrification process was also assessed. Steel turnings have been found to be effective in removing TP, but it is necessary to solve iron leaching in the future. The concentration of phosphorus was reduced up to 0 mg/l on the effluent from the denitrification bioreactors, efficiency of phosphorus removal reached 100 %. The presence of steel chips had no effect on denitrification speed. The denitrification process was also successful in the phosphorus removal columns. From the point of view of leaching of substances and iron, the removal of N and P seems to be preferable in dry period during stoppage with no water fillings. Shutdown of bioreactors with flooded filling caused high concentrations of leached iron up to 149 mg/l

This thesis analyzes data on E. coli cell growth in a bioreactor to investigate the possibility of finding predictable correlations between the environmental parameters (sensor data) and the growth using machine learning. Discovering these correlations could be a first step toward optimizing the growth of cells to be used for cell therapy: an effective but very expensive treatment method for cancer. This could ultimately lead to decreased manufacturing costs and larger treatment availability. The data first underwent a thorough preprocessing to obtain useful features that were divided into batches. In addition, a few separate further processing methods were applied to the data for further analysis. Thereafter several different machine learning methods were implemented and evaluated on the data. All possible sensor combinations were then fed into the best-performing network and the mean absolute error was calculated for each combination. The results showed that the implemented machine learning models did not find predictable patterns between sensor inputs and growth, as the predictions did not follow the growth variations and the models mainly predicted the average yield. However, the possibility that the used approach would benefit from additional data should not be discarded. / Detta examensarbete analyserar data som beskriver celltillväxt av E. coli i en bioreaktor för att undersöka möjligheten att hitta samband mellan inputparametrar och tillväxt med hjälp av maskininlärning. Att upptäcka dessa samband kan vara ett första steg mot att optimera tillväxten av celler som används för cellterapi: en effektiv men väldigt dyr behandlingsmetod för cancer. Detta kan i slutändan leda till minskade tillverkningskostnader och en större tillgänglighet av behandlingen. All data genomgick först en ingående förberedande bearbetning för att erhålla användbara features som var uppdelade i batcher. Ett antal separata vidarebearbetningsmetoder tillämpades också för vidare analys. Därefter implementerades och evaluerades ett flertal olika maskininlärningsmetoder. Den bäst presterande modellen blev tränad på alla möjliga sensorkombinationer och medelabsolutfelet beräknades. Resul- taten visade att de implementerade maskininlärningsmodellerna inte hittade förutsägbara mönster mellan sensorinput och celltillväxt, då förutsägelserna inte följde tillväxtvariationerna och modellerna främst förutspådde den genomsnittliga celltillväxten. Trots resultatet bör möjligheten att ytterligare data kan gynna det använda tillvägagångssättet inte förkastas.

The increasing concentration of nitrates in surface water and groundwater is becoming a global problem. The dissertation thesis is focused on the denitrifying bioreactors with organic fill material designed for the reduction of nitrate input from agricultural areas in the Czech Republic. A set of laboratory experiments was performed – static leaching tests and column tests, including chemical analyses of outflow water and ecotoxicological bioassays. Seven materials common in the Czech Republic, various process parameters, types and lengths of bioreactor shutdown in dry periods and the use of outflow water for irrigation were tested. The thesis deals with both denitrification efficiency and ways of reducing negative effects. An evaluation of the overall effect bioreactors is included along with a prediction regarding leaching over the following years.

Summary Juliane Schneevoigt „Investigation of time- and pressure-dependent expression of different components of the extracellular matrix by chondrocytes in vitro” Institute of Anatomy, Histology and Embryology of the University of Leipzig Submitted in June 2015 98 pages, 34 figures, 41 tables, 153 references keywords: cartilage, chondrocytes, hydrostatic pressure, bioreactor, qPCR Introduction Hyaline cartilage maintains the basic function of transmitting articular pressure load within synovial joints and therefore provides the basis for the movements of an organism. Being a small coverage of the joint surface, it shows a composition designed to match this function specifically. A high amount of proteoglycans and its associated water determines the elastic formability of the hyaline cartilage which allows the absorbance of pressure and shear forces. These proteoglycans, mainly based on aggrecan as core-protein, are embedded into a meshwork of collagen fibres, primarily formed of collagen type II. This composition is not to be understood as a static construct; moreover it is exposed to biophysical forces that permanently require a dynamic adaptation. This adaptation of the extracellular matrix formed by proteoglycans and collagen type II is organised by a small number of embedded chondrocytes, the cells of the hyaline cartilage. As chondrocytes are post-mitotic cells and due to the lack of vascularisation within hyaline cartilage, there is hardly any chance for regeneration of defects in order to maintain the integrity of the tissue. The resulting replacement is formed as fibrocartilage, which has not the capability to withstand the biodynamical forces within the joint. As these defects in hyaline cartilage represent a gross of the diseases of the musculoskeletal system, there is a high medical interest in the development of innovative cell-based therapies, as autologous chondrocyte transplantation (ACT) is one. With this type of therapy in vitro cultivated chondrocytes are seeded into a cartilage defect with the aim of producing hyaline cartilage. Aims of the study In the last decades the need for a detailed understanding of the biodynamics of cartilage became obvious for further development of therapies. The aim of this study was therefore to establish a cell culture system to provide an insight into the biodynamics of chondrocytes. Aside from the examination of the differentiation of in vitro cultivated chondrocytes and their synthesis of extracellular matrix as a function of the cultivation time, another aim of this study was to determine whether the application of hydrostatic pressure might have beneficial influence on the expression of extracellular matrix components by chondrocytes in vitro, in accordance with the hyaline cartilage. Material and methods Human articular chondrocytes were cultivated in vitro without the application of hydrostatic pressure in the first place. The cells were observed phase contrast microscopically and the distribution of collagen type I and II was detected immuncytochemically. In further experiments optical confluent chondrocytes were transferred to a bioreactor system applying a hydrostatic pressure of 5 or 10 bar with variable time periods of the pressure applied. Subsequently, the expression of collagen type I, collagen type II and aggrecan was investigated and quantified using qPCR and Western Blot. Chondrocytes cultivated exclusively without the application of hydrostatic pressure served as controls. In this pilot-study the samples were analysed using arithmetic mean and standard deviation to evaluate the power statistically. In addition, similar test conditions with marginal differences were pooled and the necessary sample size to meet a power of 80 % with an alpha error of 0.05 was calculated using the maximum potential standard deviation. In cases where this statistic power was obtained, an analysis of significance (\"One Way Analysis of Variance”) was carried out meeting a significance level under 0.05. Results During the cultivation of chondrocytes in vitro without hydrostatic pressure the length of the cultivation time did neither show an effect on the phase contrast microscopical morphology nor on the immuncytochemically detected distribution of collagen typ I and II. The application of increased hydrostatic pressure for 24 hours results in a 0.2-0.8-fold decrease of the expression of collagen type I and II and a 1.7-2.2-fold increase of aggrecan expression compared to the unloaded controls. This effect was more distinct with 5 bar but was accompanied by instabilities in the cell culture. This is why further investigations concentrated on the use of 10 bar pressure with subsequently shortened time period of the applied pressure. With short times of loading (1.5 and 3 hours) a pressure load of 10 bar led to a 0.8 fold decrease of the expression of collagen type I and II and showed a 1.6-2.4 fold increase of aggrecan expression. These qPCR results were supported by the protein expression of collagen type I, II and aggrecan detected in Western Blot. Conclusions A cell culture system was established to examine the effect of hydrostatic pressure on the expression of chondrocytes on the one hand, which can further be modified for the assembly of cell transplants on the other hand. Subsequently the results of this study led to a definition of cell culture conditions, stimulating the extracellular matrix production of chondrocytes towards the composition of hyaline cartilage. This was the case using a seeding density of 104 cells/cm2 and a pre-cultivation time of 6 days of normal pressure, followed by the application of 10 bar hydrostatic pressure for 1.5-3 h. With the help of this pilot-study a cell culture system was established to gain more information on biodynamics of hyaline cartilage. Moreover it is possible that this information will provide a basis for further development of cell based therapies of cartilage defects, such as ACT. / Zusammenfassung Juliane Schneevoigt „Untersuchung der zeit- und druckabhängigen Expression verschiedener Komponenten der extrazellulären Matrix durch Chondrozyten in vitro“ Veterinär-Anatomisches Institut der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Juni 2015 98 Seiten, 34 Abbildungen, 41 Tabellen, 153 Literaturangaben Schlüsselwörter: Knorpel, Chondrozyten, hydrostatischer Druck, Bioreaktor, qPCR Einleitung Der hyaline Knorpel gewährleistet die grundlegende Funktion der Druckübertragung innerhalb der synovialen Gelenke und stellt somit die Grundlage für die Bewegung des Organismus dar. Als schmaler Überzug der Gelenkflächen ist er in seinem Aufbau an diese Funktion spezifisch angepasst. Dabei bedingt der hohe Gehalt an Proteoglykanen und das an diese assoziierte Wasser die elastische Verformbarkeit des hyalinen Knorpels, die es ermöglicht, Druck- und Scherkräfte abzufedern. Die Proteoglykane, die hauptsächlich auf Aggrekan als Kernprotein basieren, sind in ein Maschenwerk kollagener Fasern eingelagert, welches im Wesentlichen durch Kollagen Typ II gebildet wird. Diese Zusammensetzung darf nicht als statisches Konstrukt verstanden werden. Vielmehr ist der hyaline Knorpel in vivo verschiedenen biophysikalischen Einflüssen ausgesetzt, die eine dynamische Anpassung erfordern. Solche Anpassungsvorgänge in Form einer Änderung der Zusammensetzung der aus kollagenen Fasern und Proteoglykanen bestehenden extrazellulären Matrix werden durch die wenigen eingelagerten Chondrozyten, die Zellen des hyalinen Knorpels, organisiert. Da die reifen Chondrozyten jedoch keine Zellteilungen aufweisen und dem hyalinen Knorpel eine Vaskularisierung fehlt, ist eine Defektregeneration kaum möglich, sodass eine Wiederherstellung der Integrität des Gewebes unterbleibt und stattdessen ein Ersatzknorpel, der Faserknorpel, gebildet wird, welcher den einwirkenden biodynamischen Belastungen jedoch nicht standhalten kann. Da die Defekte des hyalinen Knorpels einen Großteil der Erkrankungen des Bewegungsapparats darstellen und zudem die Arthrose als Langzeitfolge nach sich ziehen, besteht ein hohes medizinisches Interesse an der Entwicklung zellbasierter Therapieansätze, wie der Autologen Chondrozytentransplantation (ACT). Hierbei werden - bislang mit unterschiedlichen Erfolgen – in vitro kultivierte Chondrozyten mit dem Ziel, neuen hyalinen Knorpel zu bilden, in einen Knorpeldefekt eingebracht. Ziele der Untersuchungen In den letzten Jahrzehnten zeigte sich, dass die Entwicklung von Therapieansätzen zur Behandlung von Knorpeldefekten ein detaillierteres Verständnis des Knorpelgewebes und speziell dessen Biodynamik erfordert. Ziel dieser Arbeit war es daher, im Rahmen einer Pilotstudie, ein In-vitro-System zu etablieren, welches die Untersuchung der Biodynamik der Chondrozyten ermöglicht. Neben der Untersuchung der Morphologie der Chondrozyten und der durch sie synthetisierten extrazellulären Matrix in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit der Zellen, wurde die Fragestellung bearbeitet, ob durch die Wirkung eines hydrostatischen Drucks günstige Effekte in Hinblick auf die Expression einer extrazellulären Matrix, wie sie im hyalinen Knorpel vorliegt, erzielt werden kann. Materialien und Methoden Eine Primärkultur humaner artikulärer Chondrozyten wurde zunächst unter Standardzellkulturbedingungen und atmosphärischem Druck kultiviert. Die Zellen wurden phasenkontrastmikroskopisch und hinsichtlich der Verteilung von Kollagen Typ I und II immunzytochemisch untersucht. In den weiteren Versuchen wurden optisch konfluente Chondrozyten in einen Bioreaktor überführt und weiter unter einem hydrostatischen Druck von 5 oder 10 bar kultiviert. Dabei wurde die Dauer der Druckeinwirkung auf die Chondrozyten variiert. Das Expressionsmuster der so kultivierten Chondrozyten wurde quantitativ in Hinblick auf Kollagen Typ I und II sowie Aggrekan mittels qPCR und Western Blot untersucht. Dabei dienten jeweils Chondrozyten, die ohne erhöhte Druckbedingungen kultiviert wurden, als Kontrollen. In dieser Pilotstudie wurden die Proben unter Berechnung der Mittelwerte und Standardabweichung hinsichtlich ihrer statistischen Power ausgewertet. Neben dieser Analyse der Einzelergebnisse wurden die Versuchsbedingungen, die kaum Unterschiede in den Ergebnissen aufwiesen, in Gruppen zusammengefasst und mit Hilfe der größtmöglichen vorhandenen Standardabweichung der Stichprobenumfang eines Versuchs errechnet, welcher die statistische Power der Ergebnisse bei einem Alpha-Fehler von 0,05 auf 80% erhöht. In den Fällen, in denen diese Power erreicht wurde, erfolgte eine Untersuchung der Unterschiede auf Signifikanz („One Way Analysis of Variance“) bei einem Signifikanzniveau < 0,05. Ergebnisse Während der In-vitro-Kultivierung der Chondrozyten unter atmosphärischem Druck zeigte die Länge der Kultivierungszeit weder einen Einfluss auf die phasenkontrastmikroskopisch untersuchte Morphologie der Zellen noch auf die immunzytochemisch detektierte Verteilung des Kollagen Typ I und II. Die Wirkung eines erhöhten hydrostatischen Drucks (5 bar, 10 bar) für 24 Stunden führte zu einer Abnahme der Expression von Kollagen Typ I und Typ II auf das 0,2-0,8-fache bei gleichzeitiger Zunahme der Expression des Aggrekan auf das 1,7-2,2-fache, verglichen mit der unbehandelten Kontrolle. Dieser Effekt war bei 5 bar ausgeprägter als bei 10 bar, führte jedoch gleichzeitig zu einer starken Instabilität des Zellkultursystems. Vor diesem Hintergrund wurde für den höheren Druck (10 bar) die Zeitdauer der Druckeinwirkung verkürzt. Hierbei konnten bei kurzzeitiger Druckeinwirkung von 10 bar (1,5 und 3 Stunden) bei Erhalt der Zellen ähnliche Effekte erzielt werden wie für die Bedingung 5 bar, 24 Stunden. Die Expression von Kollagen Typ I und Typ II sank auf das 0,8-fache, wohingegen ein Anstieg der Aggrekanexpression auf das 1,6-2,4-fache erreicht wurde. Diese Ergebnisse der qPCR konnten durch die im Western Blot für Kollagen Typ I, II und Aggrekan detektierte Proteinexpression gestützt werden. Schlussfolgerungen Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein In-vitro-System etabliert, welches einerseits der Untersuchung des Einflusses von hydrostatischem Druck auf die Expression von Chondrozyten dienen und andererseits für die Herstellung von Zelltransplantaten weiter modifiziert werden kann. Die Ergebnisse der Untersuchungen führten zur Definition von Bedingungen für das In-vitro-System, unter denen die Expression der extrazellulären Matrix durch die Chondrozyten in Richtung der Zusammensetzung im hyalinen Knorpel stimuliert werden kann. Dies zeigte sich bei einer Aussaat der humanen Chondrozyten in einer Konzentration von 104 Zellen/cm2 und einer Vorkultivierungszeit von 6 Tagen unter Normaldruck, gefolgt von der Kultivierung unter hydrostatischem Druck von 10 bar für 1,5 bis 3 Stunden. Mit Hilfe dieser Pilotstudie wurde somit ein In-vitro-System etabliert, auf dessen Basis Untersuchungen durchgeführt werden können, die weiterführende Erkenntnisse zur Biodynamik des hyalinen Knorpels liefern und der zukünftigen Entwicklung zellbasierter Therapieansätze der Knorpeldefekte, wie der ACT, zu Gute kommen.

Die Arbeit befasst sich mit Methoden der Erfassung metabolischer Funktion einer dynamischen Zellkultur in Bioreaktoren zur klinischen Verwendung als Leberunterstützungssystem. Der Fokus liegt auf der Etablierung von Tests zur Qualitätssicherung als effiziente In- Prozess Kontrollen während der Bereitstellungsphase der Zellkulturen. Weitere Ziele sind ein Beitrag zu Wirksamkeitsnachweis und zur Charakterisierung des Systems im Rahmen von Zulassungen als "Biologic". Bei der experimentellen Untersuchung unter Verwendung von Leberzellkulturen aus porcinen Organen wurden der Lidocain- MEGX Test, die Elimination von Galaktose und Sorbitol sowie die Elimination von Ammoniak und die Synthese von Harnstoff, Lactat und Albumin berücksichtigt. Dies erfolgte mittels Bolus- und Fliessgleichgewichtsuntersuchungen sowie Konzentrationsbestimmungen. Die Ergebnisse zeigten für alle Parameter einen hochsignifikanten Unterschied zu Zellfreien Bioreaktoren, sowie einen typischen Verlauf, der in eine initiale Adhäsionsphase, eine stabile Kulturphase und eine darauf folgende erweiterte Phase mit langsamer Abschwächung der Zellleistungen gegliedert werden kann. Die Parameter erwiesen sich prinzipiell alle geeignet für den Einsatz in der Qualitätssicherung der dynamischen Zellkultur. Ein kombiniertes Untersuchungsschema bestehend aus Parametern die die Integrität der Zellmembranen reflektieren, wie die Freisetzung von Enzymen, sowie metabolischen Parametern wie Lidocain, Galaktose, Sorbitol als auch Syntheseparameter, für Proteine Albumin, als Hepatozyten typische Leistungen die Synthese von Harnstoff und der Abbau von Lactat ist in der Lage einen ausreichend umfassenden Einblick in den Status der dynamischen Zellkultur zu liefern. / Objectives of this work were to find easy to handle every day quality assessment procedure for bioreactors that are intended for clinical trials, further more usefulness of these parameters in characterization and standardization of the Liver Support System. Parameters for evaluation had been: Lidocaine, Megx, Sorbitol, Galactose, Urea, Albumin and Lactate. Bolus and Continuous metabolic liver functions tests had been done, for synthesis and detoxification parameters liberation was measured by concentration. Highly significant difference between bioreactor with primary porcine liver cells and cell-free devices was shown by t-tests. Differences to other groups like infected bioreactors had been demonstrated with ANOVA. Results show typical course over the culture period that can be categorized into a initial phase of cell reorganization, a stable culture phase and an extended phase with slow decay. All parameter proved to be suitable for daily routine quality assessment in dynamic cell culture systems. The combination of parameters reflecting different specific cellular function is able to give more comprehensive insights in the status of the cell culture.

Polyketides are natural products with complex chemical structures and immense pharmaceutical potential that are synthesized via secondary metabolic pathways. The in-vitro synthesis of these molecules requires high supply of building blocks such as acetyl Co-enzyme A, and cofactors (adenosine triphosphate (ATP). These precursor and cofactor are synthesized from respective soluble enzymes. Owing to the expensive nature of the enzymes, it is important to immobilize enzymes to improve the process economics by enabling multiple uses of catalyst and improving overall productivity and robustness. The polymer-based particles of nano and submicron size have become attractive material for their role in the life sciences. With the advances in synthetic protocols of the microgels and commercial availability of many of the monomers, it is feasible to tune the properties of the particles as per the process requirement. The core shell microgel with functional shell allows high loading of ligands onto the microgel particles due to increased availability of functional group on the outer surface. The aim of the thesis thus was to study biochemical reactions on the smart microgels support using single (acetyl CoA synthetase (Acs)) and dual (pyruvate kinase (Pk) and L-lactic dehydrogenase (Ldh)) enzyme/s systems. The study indicated that the enzyme immobilization significantly depends on the enzyme, conjugation strategy and the support. The covalent immobilization provides rigidity to the enzyme structure as in case of Acs immobilized on PNIPAm-AEMA microgels but at the same time leads to loss in enzyme activity. Whereas, in the case of covalent immobilization of Ldh on microgel showed improved in enzyme activity. On the other hand adsorption of the enzyme via ionic interaction provide better kinetic profile of enzymes hence the membrane reactor was prepared using PNIPAm-PEI conjugates for acetyl CoA synthesis. The better outcome of work with PNIPAm-PEI resulted in its further evaluation for dual enzyme system. This work is unique in the view that the immobilization strategies were well adapted to immobilize single and dual enzymes to achieve stable bioconjugates for their respective applications in precursor biosynthesis (Acetyl Co enzyme A) and co-factor dependent processes (ACoA and ATP). The positive end results of microgels as the support (particles in solution and as the thin film (membrane)) opens further prospective to explore these systems for other precursor biomolecule production.